PAnap היה מתנה אדיבה של ד&quot;ר פיטר שולץ (מכון המחקר Scripps). עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מענקי מחקר MOP-102689 ו MOP-136894 (ל RB) וקרן קנדה למענק חדשנות 950-225005.

מניפולציות של צפרדעים בוצעו בהתאם להנחיות הקנדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה (CDEA, פרוטוקול מס &#39;15-042) של אוניברסיטת מונטריאול. 1. mRNA הכנה עבור FUAA התאגדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אתר מעניין של חלבון שבו שינויים קונפורמטיביים צפויים להתרחש. בחר חומצת אמינו באזור זה כדי להחליף את fUAA. הערה: בחירת המיקום מבוססת על ההסדרים המבניים הצפויים. אם קיים מבנה בעל רזולוציה גבוהה והשערה של התנועות הצפויות, יש להציב את האנאפ כך שהסביבה הכימית תשתנה; זה עשוי להיות שינוי בקבוע דיאלקטרי (הידרופובי לעומת הידרופילי) או, סביר יותר, מרווה על ידי חומצת אמינו אחרת. מיטב quenchers הם tryptophans. אנאפ צריך להיות במגע עם quencher במדינה אחת (חפיפה של רדיד ואן- der-Waals) ו חינם ממנוהאחר. אם אין מבנים ברזולוציה גבוהה או מודלים קיימים, אחד יצטרך לסרוק את האזור של עניין. בכל מקרה, רצוי לבחור מספר מקומות בקרבת מקום כדי להגדיל את ההסתברות לקבל ביטוי אות הקרינה. על מנת למזער את ההשפעות הסטריות במהלך התבגרות החלבון ו / או הפונקציה, ניתן לבחור להחליף חומצות אמינו גדולות וארומטיות (Phe, Trp, Tyr). המחברים, לעומת זאת, חוו כי סריקה אזור עניין עבור הכניסה fUAA ללא קשר חומצה אמינית תחליף, הוא פרודוקטיבי יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קודון לעצור ענבר (TAG) באתר הנבחר באמצעות mutagenesis מכוונת האתר 15 . ודא כי חלבון של עניין אינו מסתיים על קודון לעצור ענבר (TAG). אם כך, מוטציה אחרת (אוקר או אופל להפסיק קודון). להגביר, לבודד את רצף ה- DNA. להשיג חלבון mRNA עם שעתוק במבחנה 16 ולאחסן את mRNA ב 20 מעלות צלזיוס או 80 מעלות צלזיוס. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. הכנה ביצית הזרקת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי להשיג ביציות שלב V או VI מ Xenopus laevis צפרדעים defolliculate עם collagenase כפי שתואר לעיל 17 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים צפרדעים עם הרדמה מתאימה על פי פרוטוקול חיה מאושר (כאן: 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר). כאשר הם נכשלים להגיב קמצוץ עדין על קצה האצבע (אובדן רפלקס נסיגה), אז הם הרדימו כראוי לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להסיר את הצפרדעים מן הפתרון הרדמה ולשטוף ביסודיות את העור במים מתוקים. שטיפה זו תמנע את החיה ליפול לרמות עמוקות יותר של הרדמה על ידי הסרת כימית unabsorbed מפני העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צמתים השחלה מצד אחד כירורגי בזהירות לפתוח את הצמתים באמצעות שני מלקחיים. דגירה ו לגרות ביציות ב &quot;פתרון ביצית תקן&quot; (SOS) המכיל 1% (w / v) collagenase עבור 20-30 דקותכדי defolliculate. לשטוף שלוש פעמים עם פתרון SOS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ביציות גדולות ובריאות באופן אישי ו דגירה אותם הפתרון של בארת &#39;בתוספת אנטיביוטיקה (100 U / מ&quot;ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 10 מ&quot;ג / 100 מ&quot;ל קנמיצין) ו 5% בסרום בסרום 18 מעלות לפחות 4 שעות לפני ההזרקה . הערה: לאחר 2 - 4 ניתוחים עם עיכוב של 4 חודשים בין, Xenopus laevis הם מורדמים על ידי הדגירה ממושכת (&gt; 1 h) עם 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הזרקה גרעינית של DNA, להכין קצה הזרקת דק ורזה כדי להיות מסוגל להגיע לגרעין כדי למנוע נזק הביצית. ממלאים את קצה הזרקת עם שמן הר אותו על המכשיר nanoinjector. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את ננו מזרק תחת מיקרוסקופ סטריאו להשתמש מלקחיים כדי לשבור את קצה הקצה. הוצא שמן עד שאין בועות אוויר לכודים בתוך קצה הקצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 μL של 0.1 מיקרוגרם / &amp;# 181; L pAnap במים nuclease ללא המכיל NaOH (1% של 1 N NaOH) על פיסת parafilm תחת stereoscope ולמלא את קצה הזרקת עם ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 ביציות לצלחת הזרקת מצופה רשת המכילים פתרון של בארת בתוספת אנטיביוטיקה. הערה: כדי להפוך את צלחת הזרקת מצופה רשת, לחתוך חתיכת בגודל מתאים של 800 מיקרומטר רשת ניילון למלא צלחת פטרי קלקר. הוסף כלורופורם למרכז ולאחר מכן למקם את הרשת למעלה. החזק את רשת שטוח עד הפלסטיק מגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו הגרעין הביצית ממוקם בקוטב החיה (כהה), לכוון את קצה ההזרקה במרכז מוט החיה לדלד כך קצה להגיע ליד מרכז של חצי הכדור החיה (או 2-3x את עומק לעומת הזרקת רנ&quot;א ). להזריק 9.2 nL של pAnap לתוך הגרעין של כל ביצית. קצה דק וקצב הזרקה קטן עלול לגרום הזרקת לא סדיר או קצה חסום. מדי פעם לבדוק אם הזרקת עובד על ידי הזרקת לאוויר. הערה: אם הדנ&quot;א מזריק כראוי לתוך הגרעין הוא לא ברור. צפו ולכן 10 - 40% ביציות לא להביע את זוג tRNA / synthetase. ראה דיון לפרט נוסף. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> איור 2 : איור של דנ&quot;א ו- RNA הזרקה לתוך ביציות Xenopus עבור התאגדות אנאפ. ראשית, pAnap מוזרק לתוך הגרעין של הביצית Xenopus ( 1 ). לאחר 6-24 שעות, Anap ואת ערוץ רנ&quot;א הם coinjected לתוך מוט הצמח ( 2 ). Anap יהיה אורתוגונלית aminoacylated עם tRNA נושאת לעצור ענבר אנטי קודון, על ידי synethtase aminoacyl-tRNA אשר מקודד על ידי pAnap. בדרך זו, amina-tRNAs aminoacylated מזוהים על ידי הריבוזום על קודון לעצור הענבר מוכנס ב התקשרL RNA, וכתוצאה מכך דיכוי של קודון להפסיק והכנסת Anap. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות בפתרון 2 מ&quot;ל Barth בתוספת אנטיביוטיקה סרום 5% סוס (HS) ב 18 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות כדי לאפשר ביטוי חזק של tRNAs ספציפיים ANAP ו synthtases tRNA. הערה: זמן הדגירה DNA יכול להימשך מספר ימים לפני הזרקת רנ&quot;א, אבל זה לא להגביר את הביטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק ננו עבור הזרקת רנ&quot;א (כמו צעד 2.2 אבל את הזרקת קצה לא צריך להיות רזה כמו הזרקת דנ&quot;א). עבודה רק תחת אור אדום מנקודה זו כדי למנוע photobleaching של Anap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 μL של 1 מ&quot;מ אנאפ עם 1 μL של 1-2 מיקרוגרם / μL mRNA ישירות על פיסת parafilm ולמלא את קצה הזרקת עם הפתרון המעורב. אימפל מתחת לממברנה בצמח(בהיר) מוט ולהזריק 46 nL בכל ביצית מוזרק pAnap. הערה: הריכוז הנדרש mRNA תלוי בחלבון של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות מוגן מפני אור בתיבה או עטוף בנייר אלומיניום, פתרון של בארת &#39;בתוספת אנטיביוטיקה 5% בסרום בסרום ב 18 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. שערי עם פתרון של בארת &#39;טרי כל יום ולהסיר ביציות מתים כדי למנוע זיהום. </li></ol> 3. הגדרת VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הציוד המתחבר ביצי מתח, כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את מערכת הקלטה electrophysiology על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף על ידי התקנת תא ההקלטה על המחוון המאפשר להעביר את זה בין stereoscope סטנדרטי עבור הצבת הביצית ואת המיקרוסקופ לבצע מדידות הקרינה ( איור 2 ג ). הערה: הגיאומטריה של החדר לחתוך ביציות פתוח אינו מתאים לשימוש tra רגילההדלקת אור להארה במהלך מניפולציה. לכן, מנורת הלוגן &quot;gooseneck&quot; עם מסנן אדום משמש להאיר הצדה מלמעלה. הקבל של המיקרוסקופ ניתן להסיר את החלל כדי להנמיך את הבמה עבור תא electrophysiology. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור מערכת גילוי photodiode ליציאת היציאה C- הר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2 א ). לחבר את readout פוטו אל ערוץ קלט השני מעבד אותות דיגיטליים (DSP, אנלוגי / דיגיטלי - דיגיטלי / ממיר אנלוגי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 100 W, מנורת הלוגן 12 V כמקור אור עבור עירור פלואורסצנטי. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במבערי HG, אך יש להפחית את עוצמתם כדי למנוע צילום מהיר מדי במהלך ההקלטות. תאורת LED מומלצת רק אם נוריות LED בהתאמה להראות עוצמה משמעותית בטווח עירור ( למשל, ~ 350 ננומטר עבור Anap). רוב נוריות LED הלבנות לא מגיעים רחוק לתוך הספקטרום UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> InsErt תריס מבוקרת חשמלית בין מקור האור עירור מיקרוסקופ ולחבר את השליטה שלה (בדרך כלל TTL- הדופק) כדי פלט דיגיטלי של DSP. זמן הדופק TTL בתוכנת ההקלטה (עיין בתיעוד היצרן), כך שהתריס ייפתח ~ 100 אלפיות השנייה לפני תחילת ההקלטה. בדרך זו, כל הרטט במהלך תהליך הפתיחה אינו מפריע להקלטה. הזמן תלוי במהירות ורטט של התריס. סיים את 5 הדופק לפני סוף ההקלטה, כפי שמוצג באיור 4 . בדרך זו, הערך עבור הקרינה הכולל נרשם גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קוביית מסנן מתאים (מסנן עירור, המראה dichroic ו מסנן פליטה) של הצריח קוביה מסנן. עבור Anap, השתמש Expass: 377/50 nm bandpass, dichroic 409 nm longpass, ו: 470/40 nm bandpass. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> איור 3<html> / Strong&gt; : הגדרת VCF. ( A ) בצד תצוגת VCF מראה את הנתיב האור בתוך המיקרוסקופ. קוביית המסנן מכילה מסנן עירור, מראה דיכרואי ומסנן פליטה. ( B ) נבחרים מימדים תאיים הביצית הם 3.4 ס&quot;מ עבור רדיוס החדר העליון (1), 5.5 ס&quot;מ אורך החדר התחתונה (2), 1.4 ס&quot;מ עבור רוחב החדר התחתונה (3) ו 1.7 ס&quot;מ עבור רוחב החדר האמצעי (4). ( ג ) תצוגה קדמית של הגדרת VCF. הראשון ocular בצד שמאל הוא הרכבה את הביצית בתא פתוח לחתוך מתח מהדק עבור permeabilization. ואז, החדר הוא החליק מתחת למיקרוסקופ בעין השנייה ימינה. כאן, האלקטרודה V1 מוכנס לתוך הביצית באמצעות המטרה 4X, פלואורסצנטי נרשם באמצעות המטרה 40X מים טבילה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Itle &quot;&gt; 4. הקלטה VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הכנה לחתוך לפתוח ביצית מתח מלחציים כפי שתואר לעיל דמיינו 18 (הכנה גשר אגר, הרכבה ביצית, permeabilization saponin). עם זאת, עבודה תחת אור אדום בכל עת, כדי למנוע הלבנת fluorophore לפני הקלטות. בעת הנחת הביצית, ודא כי מוט החיה פונה כלפי מעלה. פיגמנטציה תחת קרום המוטות מוט בעל חיים נגד autofluorescence שמקורם cytosol ולכן מפחית הקרינה רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק את החדר אל המיקרוסקופ ולהתמקד באמצעות המטרה 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הביצית עם מתח V1 אלקטרודה חישה (3 M KCl), לעבור למים טבילה 40X (NA 0.8 - 0.9) המטרה. דגש על מוט החיה אשר פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור האדום. בחר את קוביית המסנן המתאימה על-ידי סיבוב הצריח הקובני של המסנן ויציאת היציאה האופטית המחוברת לפוטודיודה. הפעל את הלוגEn המנורה בעוצמה הגבוהה ביותר ו לעבור את הצמצם פתוח עבור 2-5 s כדי לקרוא את עוצמת הקרינה רקע שמקורה הביצית. עם ההתקנה המתוארת הערך צריך להיות סביב 50-200 הרשות הפלסטינית עבור Anap. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את מהדק, להעיף את האמבטיה / השומר לעבור פעיל ולהתאים את פוטנציאל הממברנה (V1 - V2) לפוטנציאל הפקודה על ידי סיבוב הכפתור על headstage אני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר להחזיק פוטנציאל, שלב פרוטוקול, מספר ואורך של פולסים וכו &#39;בתוכנת ההקלטה. שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה אנאפ. </li></ol> 5. שני צבעים VCF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על שני מיקומים באותו חלבון בו זמנית, מוטציה חומצה אמינו תאית ונגישה לתוך ציסטאין, ולהסיר ציסטאין אחרים כדי להבטיח תיוג ספציפי עם כימיה טיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלב 2.1-2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הקלטות VCF, דגירה ביציות ב 5 מיקרומטר TMR-maleimide ב תיוג פתרון במשך 15 דקות (או צבע אחרעם ספקטרה שאינה חופפת בהשוואה ל- Anap). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הביציות עם פתרון תיוג שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלב 4.1-4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קוביית מסנן מתאים TMR (מסנן עירור, המראה dichroic מסנן פליטה) של הצריח קוביית מסנן. החלף את הקובייה TMR מסנן על ידי סיבוב הצריח מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הקרינה רקע TMR כמתואר Anap בשלב 4.4. הערה: תיוג עם כימיה thiol תוצאות ברקע רקע גבוה עקב תיוג unspecific בקרום. לכן, הקרינה רקע TMR עשוי להרוות את מגבר (&gt; 2,000 pA). במקרה זה, לא להקטין את עוצמת האור, אבל פשוט להפחית את הקרינה רקע על ידי הוספת היסט היסט לפוטודיודה. במערכות הזמינות מסחרית להשתמש &quot;דגימה והחזק&quot; תכונה על מערכת גלאי. הערה ערך הקרינה רקע (באמצעות מסנן צפיפות 10X ניטרלי) במעבדה jOurnal, כמו ערך זה לא יירשמו (הרוויה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה TMR בו זמנית כמו בשלב 4.6. </li></ol>

<ol>
	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis:+An+Expanded+Genetic+Code.">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li><li>Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides.">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane.">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li><li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K++channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain.">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li><li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K++channels.">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels.">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li><li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+small,+environmentally+sensitive,+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li><li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid.">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids.">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866 (2015).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).</li><li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription.">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li><li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection.">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li><li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry.">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel.">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vertical+movement+of+a+K++channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer.">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li><li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement.">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li><li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions.">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li><li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential.">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li><li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels.">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-base+codon/anticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids.">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li><li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins.">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ב aminoacylation in vivo של tRNAs אשר מתמשכים ברציפות יחד עם tRNA-synthetase, מאפשר להשיג רמות ביטוי גבוהות מדידות הקרינה. עבור שילוב FUAA יעיל, זה קריטי כי pAnap מוזרק כראוי לתוך הגרעין. בשל חוסר הוודאות של המיקום המדויק של הגרעין, 10-40% מהזרקת ה- DNA צפויים להיכשל, וכתוצאה מכך לא הביעו ?...

מעל 200 חומצות אמינו לא טבעיות של תכונות כימיות ופיסיקליות שונות שולבו גנטית בחלבונים בתאי E. coli , שמרים ותאי יונקים 3 . חומצת האמינו הלא טבעית משולבת בתגובה לקודון עצירה מסוים באמצעות זוג tRNA אורתוגונלי מהונדס / synthetase. הגישה הגנטית לשינוי חלבונים סיפקה תובנות חשובות על מבנה החלבון ותפקודו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מתח פלמורומטריה (VCF) בשילוב עם UAA פלואורסצנטי. ב VCF, תצפית בו זמנית של נתונים פונקציונליים סידורים מבניים מקומי סביב בדיקה ניאון (~ 5 Å) מאפשר לנו להשיג מידע דינמי עם רזולוציה millisecond 1 . בדיקות פלואורסצנט לשנות מצב מרווה שלהם על התנועה המקומית של החלבון. תנועה של 1-2 רק מספיק כדי להוביל לשינויים משמעותיים הקרינהאינטנסיביות 4 . לאחר זיהוי של אתר של עניין בחלבון היעד, האתר הוא מוטציה על ידי מוטציה נקודה. באופן קלאסי, שאריות היה מוטציה על ציסטאין ואילו עכשיו, קודון להפסיק ענבר (TAG) הוא הציג עבור fUAA שילוב גנטי. החלבון הוא אז במבחנה transcribed. בעוד מערכות ביטוי אחרות ( למשל, תאים יונקים) ניתן להשתמש 5 , 6 , 7 , ביציות Xenopus עדיפים על מבנה מבנה מחקרים בגלל גודל גדול שלהם, המוביל מניפולציה קלה יותר עוצמת הקרינה גבוהה יותר (fluorophores) ולכן, רעש. יתר על כן, ביציות Xenopus יש רקע נמוך מן החלבונים אנדוגני 2 , 8 , ואת פיגמנטציה כהה על המגן מוטות חיית נגד רקע הקרינה מהוא cytosol. ביציות Xenopus הם הוסרו כירורגית קידוד דנ&quot;א tRNA אורתוגונליים / זוג tRNA-synthetase ספציפי עבור FUAA מוזרק לגרעין של הביציות. לאחר זמן הדגירה 6-24 שעות, RNA חלבון הוא שיתוף מוזרק עם FUAA לתוך cytosol של ביציות, ואחריו 2-3 ימים הדגירה תקופה. על מנת למנוע כל נזק fUAA (photobleaching), נהלים כולל אנאפ צריך להתבצע תחת אור אדום כדי למנוע עירור fluorophore. ביציות נלמדים על חיתוך פתוח ביצית מתח ההתקנה, אשר מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, זרם חשמלי ושינויים הקרינה נרשמות בו זמנית 9 , 10 . לחלופין, שני אלקטרודה מתח מהדק 1 או תיקון תצורת מהדק 11 ניתן להשתמש. הקרינה נרגשת לאורכי גל מתאימים עם רעש RMS נמוך<html> פליטה שנרשמה באמצעות photodiode מקושר למגבר עם הגברה גבוהה. ישנם מספר יתרונות של שימוש פלואורסצנטי חומצות אמינו לא טבעיות (fUAAs) ב-מלחציים פלמפומטריה. האחד הוא גישה לצד cytosolic של חלבונים הממברנה; תהליכים רגולטוריים רבים נמצאים כאן ( למשל, Ca 2 + - או אתרי מחייב נוקליאוטידים, איטום מהיר וסגור המדינה של ערוצי יון מגודרת מתח, פתיחת הנקבוביות, צימוד מודול). כל התהליכים הללו נגישים כעת עבור תיוג פלואורסצנטי. יתרון נוסף הוא גודל קטן של בדיקה המוביל פחות הפרעה של החלבון. עד כה, שני אורתוגונליים tRNA / tRNA זוגות synthetase עבור fUAAs כבר מהונדסים 12 , 13 , שם 3- (6-acetylnapthalen-2-ylamino) -2-aminopropanoic חומצה (Anap) הוא FUAA רק אשר שימש ביציות Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap הוא fluorophore רגיש לסביבה עם משקל מולקולרי של 272.3 גרם / מול והוא רק מעט גדול יותר Tryptophan 12 ( דמויות 1A, 1B ). בשל גודלו הקטן, השפעות סטיות פחות צפויים להיות מיוצגים על ידי fluorophore לעומת fluorophores קונבנציונאלי המצורפת באמצעות מקשר (בדרך כלל יותר מ 500 g / mol). יתר על כן, במקרה של Anap, fluorophore ממוקם קרוב יותר עמוד השדרה חלבון מאשר אלה הקשורים ציסטאין, וכתוצאה מכך, Anap הוא חיטוט סידורים מקומיים יותר. לבסוף, הסרת ציסטאין אנדוגני ב VCF קונבנציונאלי על מנת להבטיח תיוג אתר ספציפי כבר לא דרישה UAA-VCF ולכן (i) משאיר את החלבונים ב (כמעט) המדינה שלהם יליד (ii) מאפשר VCF להיות מיושם כדי ללמוד מגוון רחב יותר של חלבונים בהם פונקציה עשויה להשתנות על ידי החלפת ציסטאין. <img alt="איור 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1 : Anap ו פלואורסצנטי ספקטרה. ( א ) המבנה הכימי של אנאפ. ( ב ) ספקטרום ספיגה מנורמל ספקטרום פליטה עבור 1 ננומטר אנאפ, המדגים את הרגישות של הקרינה אנאפ כדי הידרופובייה ממס. ספקטרום פליטה התקבלו על ידי מרגש ב 350 ננומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> החיסרון של שימוש UAAs פלואורסצנטי הוא אוכלוסייה הטרוגנית של חלבונים עלולה לנבוע מקריאת קודון להפסיק, reinitiation translational, C- מסוף חתכים מקוצצים או crosstalk עם aminoacylation אנדוגני אם כמות tRNAs aminoacylated הוא נדיר. ביטוי דליפה כזה צריך תמיד להיות בדק עבור בהעדר fUAA ו tRNA / tRNA זוג synthetase. התייחסנו לסוגיית הטרנסLational reinitiation וכיצד לעקוף אותו עבור N- מסוף אתרי הכניסה בעבר 14 . עם זאת, כאשר fUAA, tRNA ו tRNA synthetase נמצאים בכמויות רווי, נותרה רק הסתברות נמוכה של ביטוי דליפה. ההבדל הפרוצדוראלי העיקרי בין FUAA-VCF לבין VCF קונבנציונאלי הוא הזרקת וטיפול ביציות; הזרקת דנ&quot;א קידוד tRNA ו tRNA synthetase (pAnap) ואחריו המבוא של Anap, אשר גם שיתוף מוזרק עם mRNA חלבון או לחלופין הוסיף פתרון הדגירה כמו אסתר acetoxymethyl (AM).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

מתח- Clamp Fluorometry (VCF) כבר טכניקה של בחירה כדי לחקור את המבנה ואת הפונקציה של חלבונים ממברנה electrogenic שבו בזמן אמת מדידות של פלואורסצנטי וזרמים בו זמנית לדווח על הסדרים מקומיים ופונקציה גלובלית, בהתאמה 1 . בעוד טכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים או קריסטלוגרפיה רנטגן לספק תמונות סטטיות של חלבונים המעניינים, VCF מספק נתונים מבניים דינמיים המאפשר לנו לקשר את הסדרים מבניים (פלואורסצנציה) לנתונים פונקציונליים דינמיים (electrophysiology). עד לאחרונה, כימיה reiactive thiol המשמשים תיוג פלואורסצנטי מכוון האתר של חלבונים הגביל את היקף הגישה כי כל ציסטות נגיש, כולל אלה אנדוגניים, יסווגו. זה היה ולכן נדרש לבנות חלבונים ללא ציסטאין אנדוגני. תיוג היה מוגבל גם לאתרים נגישים מן החוץצַד. זה השתנה עם השימוש של חומצות אמינו פלואורסצנט לא טבעי (FUAA) כדי לכלול במיוחד בדיקה פלואורסצנטי קטן בתגובה לעצור דיכוי קודון באמצעות tRNA אורתוגונלית זוג synthetase tRNA 2 . שיפור VCF רק דורש הליך הזרקת שני שלבים של הזרקת דנ&quot;א (זוג tRNA / synthetase) ואחריו RNA / FUAA שיתוף הזרקת. עכשיו, תיוג הן אתרי תאיים ו קבור אפשרי, ואת השימוש VCF התרחב באופן משמעותי. הטכניקה VCF ובכך הופך אטרקטיבי לחקר מגוון רחב של חלבונים - וחשוב יותר - מאפשר לחקור מנגנונים ציטוזוליים רבים.

איור 4 מציג דוגמה של הקלטות VCF המתקבל ביצית להביע ערוצי שייקר עם איון מהיר הוסר (IR), L382stop-W434F בנוכחות pAnap ו Anap. המוטציה W434F חוסמת את זרמי האשלגן היוניים, המאפשרים למדוד את זרם הטעינה הזעיר (gating currents). הקלטות בו זמנית של זרמים gating (עקבות העליון) ו Ana...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ&quot;א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K Views.  University of Montréal.  מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי. 

Video: Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biology

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Neuroscience

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Developmental Biology

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Bioengineering

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</em&gt; טכניקת ביצית Cut-פתוח וזלין גאפ מתח מהדק עם Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

מתח הידוק פלואומטריה ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

מתח הידוק פלואומטריה ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

שימוש pHluorin כדי להעריך את הדינמיקה של קולטני הדרכה אקסון בתרבות התא בעובר אפרוח

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

הצמד תיקון הקלטה של תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus