Name: expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא קריירה פרס פיתוח 1IK2BX001701, CTSA פרס UL1TR000445 מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, הקרן הלאומית למדע פרסים 1547757 ו 1400969, ומענק NIH GM05551. התוכן שלה הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח דעות רשמיות של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום או המכונים הלאומיים לבריאות.

1. ביטוי של S100A12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה המוסמכת BL21 DE3 תאים עם pGEMEX-S100a12 פלסמיד באמצעות תקן סטנדרטי חום ההלם 18 . הוסף 1 עד 5 μL של פלסמיד ל 50 μL של חיידקים בצינור microcentrifuge על הקרח. דגירה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על הקרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של מדיה SOC לתאים. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בסל&quot;ד 250 על שייקר מסלולית עבור 1 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 150 μL של התגובה טרנספורמציה על בינוני LB- אגר (בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין). לדגור על 12-16 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה אחת. לחסן 2 מ&quot;ל של LB (בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (300 סל&quot;ד). OD 600 צריך לקרוא בין 1-3 ספיגת יחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של תרבות Starter ל 50 מ&quot;ל של ZYM-5052 autoinduהתקשורת ction 26 בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של אמפיצילין. עבור אוורור הטוב ביותר ביטוי מקסימלי, להשתמש 250 מ&quot;ל מבולבל בקבוק ארלנמאייר. לנער (300 סל&quot;ד) עבור 24 שעות, על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה חיידקי לצינור צנטריפוגות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (4 XG, 10 דקות) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את המדיה, מדגם יומן, ואת הדבק לאחסן חנות ב -80 מעלות צלזיוס. המדגם יציב במשך שנים. </li></ol> 2. טיהור של S100A12 באמצעות כרומטוגרפיה בלחץ נמוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 30 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ההשעיה על קרח לתאי lyse. השתמש ~ 20 W פלט, 5 על 5 ו 5 את מחזור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה, 20,000 xg במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר כוס נקי 100 מ&quot;ל פוליפרופילן. מגניב את הפתרון על ידי הנחת כוס על הקרח. מוסיפים מערבביםR ולאט לאט להוסיף 11.20 גרם של אמוניום סולפט. אפשר פתרון לערבב על קרח במשך 1 שעות נוספות. זה תיצור פתרון 60% של אמוניום גופרתי ו להאיץ את רוב E. חלבונים אנדוגניים. S100A12 יישאר מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב 4 ° C, 20,000 xg במשך 20 דקות כדי גלולה החלבון זירז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר צינורות דיאליזה (MWCO 3,500 kDa). Dialyze נגד 1 L של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 ב 4 ° C. לשנות את המאגר דיאליזה פעמיים. אפשר 4 שעות בין השינויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניון חילופי כרומטוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כרומטוגרפיה על מערכת לחץ נמוך. קצב זרימה אופייני הוא 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודה 5 מ&quot;ל Sepharose עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ~ 40 מ&quot;ל של פתרון S100A12 באמצעות משאבת מדגם (לאסוף את הזרימה דרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את העמודה עם שיפוע 0-30% (BuFfer B הוא 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0, 1 M NaCl) על 19 כרכים טור (קורות חיים, 95 מ&quot;ל). איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות MES SDS PAGE עם מכתים Coomassie. הפעל ג&#39;ל באמצעות מתח קבוע (20 V / cm) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכילים S100A12. S100A12 פועל ב ~ 10 חלבון kDa על ג&#39;ל denaturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרוכזים שברים ל 5 מ&quot;ל באמצעות מכשיר ultrafiltration (MWCO 10 kDa). צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 8 דקות ~. קח את החלק העליון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרפיה הדרת גודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה S75 עם 1 קורות חיים (120 מ&quot;ל) של 20 מ&quot;מ טריס pH 8, 100 mM NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק &lt;5 מ&quot;ל של שברים מרוכזים S100A12 (מתוך חילופי יונים כרומטוגרפיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הטור בקצב זרימה של 1 מ&quot;ל / מ מעל 120 מ&quot;ל. איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות SDS PAGE עם מכתים Coomassie. אימות זהות חלבון באמצעותכתם המערבי או ספקטרומטריית מסה (מחושב המסה המולקולארית של יחידת משנה monomeric 10,575.0 דה, נמדד 10575.4 דה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת החלבון 280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במאגר ה- SEC כחסר. מקדם הכחדה מחושב עבור S100A12 homodimer הוא 5960 M -1 ס&quot;מ -1 . הערה: תשואות אופייניות הם 35-45 מ&quot;ג של S100A12 לכל 50 מ&quot;ל של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot S100A12 לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל (1 מ&quot;ג / צינור), הקפאה פלאש בחנקן נוזלי לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 3. פעילות אנטי מיקרוביאלית Assays <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס H. pylori זן G27 על לוחות אגר טריפטי אגר בתוספת 5% כבשים דם (צלחות אגר דם). לגדול 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן H. pylori לתוך מרק ברוסלה בתוספת 1x כולסטרול. תרבות מעללילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל H. pylori 1:10 לתוך 50% מרק ברוסלה, 50% חיץ calprotectin בתוספת 1x כולסטרול ותרבות בינונית או בתוספת של 100 מיקרומטר אבץ כלוריד פלוס 0, 100 או 1000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 מטוהרים. תרבות לילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבצע דילולים סדרתי צלחת על צלחות אגר דם. אפשר מושבות חיידקים לגדול במשך 2-3 ימים על 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. למנות את המושבה להרכיב יחידות לחשב את הגידול החיידקי בנוכחות או היעדר של S100A12 ו / או אקסוגני אקס. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול יעיל הן ביטוי וטיהור האדם S100A12 מוצג. מערכת ביטוי קולי קולי הוא הכלי הנפוץ ביותר המשמש לייצור חלבונים רקומביננטי, במיוחד כאשר כמויות מ&quot;ג נדרשים מחקרים ביוכימיים וביופיסיקליים. שיפור המפתח של הנוהל המתואר כאן הוא השימוש של אוטומטי אינדוקציה מדיה <sup class...

S100 חלבונים הם מחלקה של EF יד המשפחה של סידן מחייב חלבונים עם מגוון רחב של פונקציות 1 . הם באים לידי ביטוי באופן רקמות תא ספציפי, לווסת מגוון רחב של פונקציות הסלולר 2 , 3 . ייחודי חלבונים סידן מחייב, חלבונים S100 התערוכה הן פונקציות תאיים תאיים 4 , 5 . בתוך התא, Ca 2 + מחייב גורם לשינוי קונפורמציה החושפת משטח הידרופובי כי מטרות ספציפיות חלבון מחייב שותפים 6 . מנגנון תאיים זה מסדיר תהליכים חשובים כגון התפשטות תאים, התמיינות ואנרגיה מטבוליזם. בסביבה תאית, S100 חלבונים התערוכה שתי פונקציות 7 . באחד מהם, הם פועלים כנזק הנלווה לחלבון המולקולרי (DAMP) ויוצרים פרו-דלקתהתגובה החיסונית אטורי באמצעות אינטראקציה עם קולטנים הכרה דפוס 8 , 9 . בנוסף, כמה חברים של מחלקה S100 חלבון sequester המעבר מתכות, פונקציה המשמשת להרעב פתוגנים חיידקים בתהליך המכונה החסינות התזונתיים 10 , 11 . S100A12 (הידוע גם בשם calgranulin C ו- EN-RAGE) מתבטאת מאוד מקרופאגים ונויטרופילים ו זוהו כסימן ביולוגי פוטנציאלי למחלות דלקתיות 12 , 13 . בנוסף סידן מחייב באתרי EF-Hand שלה, S100A12 יש שני זיקה גבוהה מתכת מחייב אתרים הממוקם בקצה השני של ממשק dimer 14 , 15 . כל אתר מחייב מורכב משלושה שאריות histidine ושאריות חומצה אחת aspartic והוא יכול chelate אבץ או נחושת &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . לאחרונה, דיווחנו כי רעב אבץ תלוי S100A12 חשוב בויסות הצמיחה של הליקובקטר פילורי ופעילותם של גורמים ארסתיים דלקתיים 18 . H. pylori מדביק את הבטן של כמחצית מאוכלוסיית האדם בעולם; מה שהופך אותו ללא ספק לאחד הפתוגנים החיידקים המצליחים ביותר 19 . זיהום עם H. pylori יכול להוביל לתוצאות משמעותיות של מחלת קיבה, כולל גסטריטיס, כיב פפטי ותריסריון, רירית לימפומה לימפומה (MALT), וכן אדנוקרצינומה קיבה פולשנית (סרטן הקיבה). סרטן הקיבה הוא הגורם המוביל למוות שאינו קשור לסרטן בסרטן בעולם, וגורם הסיכון הגדול ביותר הקשור לסרטן הקיבה הוא זיהום ב- H. pylori . H. pylori נמשכת נישה קיבה למרות robuSt התגובה החיסונית הפתוגן, מדגיש את הצורך בהבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון של שליטה זה זיהום חיידקי 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori - דלקת נלווה מאופיינת בחדירה עמוקה של תאים פולימורפונומיים, או נויטרופילים, המפקידים רפרטואר של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים, כולל S100A12, באתר ההדבקה 18 , 24 , 25 . במאמץ להבין את הדיאלוג המורכב בין המארח לבין הפתוגן, ביקשנו לחדד את הטכניקה לטהר את S100A12 ולהשתמש בה כדי לחקור את המיקרוביאליות שמשפיעה על הפתוגן הרלוונטי מבחינה רפואית. פרוטוקול להלן מתאר טכניקה משופרת לטיהור S100A12 במצב פעיל ביולוגית שלה; המסוגל לחייב מתכות מזין עם אפיני גבוההTy ו chelating אותם מן הפולש מיקרואורגניזמים. יתר על כן, השיטות להלן מדגישות את התועלת של חלבון זה כמגיב קריטי כדי לחקור את המנגנון שבו מולקולות מולקולות מולדות להגביל את הצמיחה של פתוגנים חיידקיים. S100A- חלבונים משפחתיים זכו להערכה כקבוצה חשובה של מולקולות מערכת החיסון המולדת אשר משתתפים איתות החיסון וכן ההגנה המארח 27 . המחקר הטוב ביותר של אלה הוא calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin הוא נויטרופיל הקשורים חלבון אשר יוצר heterodimer של S100A8 ו S100A9 יחידות משנה אשר נקשר מתכות המעבר בממשק dimer 31 . Calprotectin הוכח להחזיק שני אתרי מחייב מתכת: אתר 1 יכול לקשור Zn 2 + , Mn 2 + , או Fe 2 + , ואת האתר 2 יכול<html> כץ Zn 2+ 31 , 32 . דיווחים רבים הוכיחו שלקאלפרוקטין יש פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד גורמים שונים כגון Staphylococcus aureus , קנדידה אלביקנס , Acinetobacter baumannii , דלקת ריאות של קלבסילה , Escherichia coli ו- H. pylori , וכי ההשפעות המעכבות נובעות מפעולת הקלציה המתכתית של calprotectin 25 , 28 , חשוב מחקרים קודמים הראו כי פעילות ה- Calprotectin מפעילה מספר רב של פעילויות על H. pylori, כולל שינוי השומנים מבנה בקרום החיצוני, הדחקה של מערכת הפרשת הטיפוס הרביעי (שהיא גורם ארסי פרו-דלקתני משמעותי בתוך H. pylori ), יצירת היווצרות ביופילם והדחקה H. pylori הצמיחה ואת הכדאיות באופן תלוי מינוןClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . יתר על כן, בדיקות גנטיות וביוכימיות חשפו את הפעילות האנטיבקטריאלית של קלפרוטקטין כנגד H. pylori נבעה ברובה מיכולתה לקשור אבץ מזין 25 . H. pylori דורש אבץ, כפי שנקבע על ידי מחקר קודם אשר ניצל בינוני מוגדר כימית כדי לוודא את הדרישות micronutrient עבור הפתוגן הזה לגדול ולהתרבות 34 . בנוסף, קלפרוקטין היה שופע מאוד בתוך רקמות נגועות ב H. pylori , והוא קשור לחדירים נויטרופילים, דבר המצביע על כך שהמארח עשוי להעסיק את ה- Calprotectin כאסטרטגיה אנטי-מיקרוביאלית במהלך ההדבקה ודלקת שלאחר מכן , 25 , 35 . עדויות חדשות מ טכניקות הקרנה proteomics unbiased עולה כי בתנאים בהם מינים חמצן תגובתי בשפע, calprotecפח עובר שינויים לאחר טרנסלוציאציה אשר משנים את האתר מחייב hexa histidine, ובכך מעכב את הפעילות מחייב מתכת של חלבון 36 . ככזה, שיערנו כי חלבונים אחרים של משפחת S100A בין הרפרטואר הרחב של המולקולות הללו עשויים לשמש ככלי עזר-מתכת עזר. בחרנו את S100A12 לצורך מחקר נוסף, משום שהוא לא זוהה במסך הנ&quot;ל לתמורות פוסט-טרנסלציוניות, יש לו את היכולת לקשור אבץ, והוא שופע מאוד ברקמות אנושיות הנגזרות מאנשים של H. pylori- infected. העבודה שלנו מצביעה על כך ש- S100A12 יכול לעכב את צמיחת ה- H. pylori ואת הכדאיות במינון תלוי במינון G27 של H. pylori , וכי פעילות מיקרוביאלית של חלבון זה יכולה להפוך על ידי תוספת של אבץ מזין עודף. עבודה זו משלימה את העבודה הקודמת שלנו המעידה על פעילות מיקרוביאלית של S100A12 נגד PMSS1 ו- 7.13 זנים של H. pylori , מדגים פעילות אנטיבקטריאלית רחבה נגד מבודדים קליניים רבים זנים מותאמים למעבדה של H. pylori 18 . יחד, תוצאות אלה מאשרות את החשיבות של S100A12 כמנגנון לבקרה על צמיחה וחיידקים בקטריאליים באמצעות חסינות תזונתיים. מחקרים עתידיים על אינטראקציה חשובה זו של חיידק מארח יכולים לכלול ניצול של הפעילות של S100A12 כדי להפחית את נטל החיידקים ברקמות המארחות, או לקבוע את תרומתו של חלבון זה לחיבור החיסון בהקשר של זיהום H. pylori .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Expression&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Expression cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Autoinduction medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Selection agent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatography System</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

חלבונים Calgranulin הם מתווכים חשובים של חסינות מולדת הם חברי המעמד S100 של המשפחה EF יד של חלבונים מחייב סידן. כמה חלבונים S100 יש את היכולת לקשור מתכות המעבר עם זיקה גבוהה ביעילות לשלוף אותם מן הפתוג חיידקים פתוגנים בתהליך זה כינה &quot;חסינות תזונתיים&quot;. S100A12 (EN-RAGE) מחייב הן אבץ והן נחושת, והוא שופע בתאי חיסון מולדים כגון מקרופאגים ונויטרופילים. אנו מדווחים על שיטה מעודנת לביטוי, העשרה וטיהור של S100A12 בתצורה הפעילה והמתכתבת. ניצול של חלבון זה בצמיחה חיידקים וניתוחי חיוניות מגלה כי S100A12 יש פעילות מיקרוביאלית נגד הפתוגן חיידק , Helicobacter pylori . הפעילות המיקרוביאלית מבוססת על פעילות מחייב אבץ של S100A12, אשר chelates אבץ מזין, ובכך רעב H. pylori אשר דורש אבץ לצמיחה pרוליפרציה.

S100A12 ביטוי וטיהור טיהור שלושה שלבים המיוצר ~ 40 מ&quot;ג של רקומביננטי S100A12 מ 50 מ&quot;ל של תרבות חיידקים. הצעד הראשון היה משקעים סולפט אמוניום של חלבונים אנדוגניים E. coli . צעד זה היה ואחריו anion חילופי...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Drugs for Peptic Ulcer Disease

SCIENTISTS IN ACTION

8.3K Views.  Fisk University.  כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori . 

Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Immunology and Infection

טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

מחבר זרקור: זיקה טיהור של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus  

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Bioengineering

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biology

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for immune cell stimulations. This protocol is based on a two-step chromatography strategy, which comprises protein pre-purification on an anion-exchange chromatography column and a subsequent polishing step on a hydrophobic-interaction column. This strategy produces S100A12 protein of high purity and yield at manageable costs. For functional assays on immune cells eventual remnant endotoxin contamination requires careful monitoring and further cleaning steps to obtain endotoxin-free protein. The majority of endotoxin contaminations can be excluded by anion-exchange chromatography. To deplete residual contaminations, this protocol describes a removal step with centrifugal filters. Depending on the available ion-strength S100A12 can arrange into different homomultimers. To investigate the relationship between structure and function, this protocol further describes ion-treatment of S100A12 protein followed by chemical crosslinking to stabilize S100A12 oligomers and their subsequent separation by size-exclusion chromatography. Finally, we describe a cell-based assay that confirms the biological activity of the purified protein and confirms LPS-free preparation.

This protocol describes a purification method for recombinant tag-free calcium binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers for human monocyte stimulation assays.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים