This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. ייצור תבנית סיליקון ופלה הערה: photomask נועד עם תוכנת AutoCAD ומיוצר על ידי חברה מסחרית. עיצוב זה מכיל שלוש שכבות של דפוסים שונים ( <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">קובץ משלים 1</a> ). בגבהים של הראשון, השני, השלישי ושכבות עומדים 4 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 50 מיקרומטר, בהתאמה. העובש הפרוס סיליקון נוצר מן photomask באמצעות ליתוגרפיה רך 9, 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להתאדות אדי מים. ספין מעיל photoresist שלילית SU-8 על גבי פרוסות סיליקון סיליקון. הערה: מעיל ספין SU-8 3005 ב 5000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה הראשונה, SU-8 2010 ב 3000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה השנייה, ו SU-8 3025 ב 2000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את שכבה שלישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Soft-אופה את הפרוסות המצופות לפני tהוא דפוס העברה. יישר ולחשוף את הפרוסות במצב &quot;קשר ישיר&quot; באמצעות aligner מסכה. הערה: Soft-לאפות את רקיק עבור 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה הראשונה, 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השנייה, ולאחר 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השלישית. השתמש במינון החשיפה ב 100 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה הראשונה, 130 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה השנייה, ו 200 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה השלישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החשיפה, פוסט-אופים את פרוסות ולפתח אותו באמצעות מפתח SU-8. לייבש את פרוסות באמצעות אקדח N 2 וקשה לאפות את פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: תבנית סיליקון מקובעת צלחת 15 סנטימטרי קוטר פטרי מפלסטיק באמצעות נייר דבק, עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. בדרך כלל, אנחנו שמים כמה מבני שבב זהה על אותו שטאנץ, המאפשר שבבי microfluidic מרובה כדי להיות מפוברקים בו זמנית. ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כל עובש פעמים רבות לפברק שבבי microfluidic. </li></ol> 2. Microfluidicייצור שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סירה במשקל נקיה על איזון טרה את האיזון. יוצקים 50 גרם של בסיס PDMS לתוך הסירה לשקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5 גרם של סוכן ריפוי PDMS לסירה שוקל (w / w יחס של 1:10 לבסיס PDMS). הערה: נפח זה מבוסס על צלחת 15 ס&quot;מ קוטר פטרי עם עובש. התאם את הכמות מגיב אם באמצעות צלחת פטרי בגודל שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בסיס PDMS ואת הסוכן ריפוי עם טפטפת הפנויה. התחל מקצה הסירה במשקל ולאט לאט להזיז פנימה. מערבבים היטב במשך כמה דקות עד בועות קטנות יוצרים ברחבי תערובת; ערבוב יסודי חיוני פילמור PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לאט לתוך צלחת פטרי; את התערובת יש לכסות את התבנית פרוסות סיליקון לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי בחלל ריק עבור 10 דקות כדי להסיר את כל בועות אוויר מן התערובת PDMS. אם הבועות נשארים על פני השטח של התערובת, להשתמש פיפטה לפוצץ אותן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת סיליקוןעובש פרוס עם PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך כ 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בעדינות את השכבה של PDMS פולימר את העובש הפרוס סיליקון, להימנע מכל פגיעת בניית התבנית הפרוסה. לחלופין, לחתוך את PDMS ישירות מהתבנית פרוסות סיליקון עם מרווח של 5 מ&quot;מ מינימום סביב התבנית בעזרת סכין גילוח תעשייתי חד קצה; לקלף את שכבת PDMS בעדינות את התבנית הפרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שכבת PDMS על הספסל עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. לחתוך בזהירות את השבב היחיד עם סכין גילוח תעשייתי חד קצה, שמירת מרווח הולם מהקצה של כל שבב יחיד, כדי למנוע ניזק הבנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה, השתמש בעט אגרוף (מזהה 0.75 מ&quot;מ) מחורר ישר למטה דרך מעגלי הכניסה ויציאה בכל צד של הערוצים. הערה: אלה חורים ליצור את מסלול הזרימה של המדיום. לכן, חשוב לעבור את עיגולי אגרוף כל הדרך דרך שכבת PDMS. הקפדלהסיר את עמודות PDMS מן החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק בכל חור מנוקב על ידי החדרת מחט עט אגרוף שוב לתוך החור. ודא את המחט יכולה לצאת מהצד השני, המציין כי אין חסימה. החל קלטת אל פני שטח הדפוס, אז בעדינות לקלף את הקלטת כדי לנקות חלקיקי אבק. חזור על פעולה זו לפחות שלוש פעמים. השאר פיסה נקיה של נייר דבק על PDMS לשמור עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה בצד השני של PDMS ולהשאיר את החלק האחרון של הסרט על גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס כיסוי 24 מ&quot;מ x 30 מ&quot;מ עם עובי של 0.13-0.17 מ&quot;מ. תרסיס אתנול 70% על הזכוכית ויבשה עם מסיר אבק לעקר פני השטח; בנוסף, ניתן לכבס את הכוס במי autoclaved מיובשת עם מסיר אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מכסה זכוכית PDMS לצלחת פלסטיק. הסר את נייר הדבק מן PDMS ומניח את צד הדפוס פונה כלפי מעלה. להימנע מכל מגע עם משטח הדפוס במהלך ההעברה. </li><li&gt; מניח את צלחת הפלסטיק במכונת הפלזמה. החל טיפול פלזמת חמצן PDMS ואת מכסה הזכוכית כדי לעבד את המשטחים הידרופילי עם פרמטרי הפעולה הבאים: חשיפה, 75 s; ייצוב גז, 20 סמ&quot;ק / min; לחץ, 200; וכוח, 100 W. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למקם את PDMS על מכסה הזכוכית, חיבור שני משטחים הידרופיליים (המשטחים אשר התמודדו במהלך טיפול פלזמה). ודא שאין בועות אוויר בין PDMS ואת מכסה הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שבב PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך h 2 לפחות. הערה: מיקרופלואידיקה חסר עלול לגרום לדליפת נוזל על מיקרוסקופ במהלך הניסוי. לכן, חשוב לבדוק את הקשר בין PDMS ואת מכסה זכוכית על ידי הרמת PDMS מעט מן הקצוות עם פינצטה. בהרימו בעדינות את PDMS לא צריך להפריד אותו מכסה הזכוכית, המצביע על קשר מוצלח. </li></ol> 3. הכנות לקראת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; כן Tube. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול צינורות קלט ופלט בתמיסת 70% אתנול בנפרד 1 יום לפני הכנת שבב PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 5 מ&quot;ל עם מים autoclaved לשטוף את הצינורות. לשטוף כל צינור ידי חיבור הצינור על המזרק שטיפה בצינור מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה לפחות 3 פעמים כדי לנקות שאריות אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ערוצי PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 10X לוודא את המבנה עקבי וללא פגע. ייצב את שבב PDMS על פלטפורמת מיקרוסקופ באמצעות נייר דבק. הערה: הפוך שבבים מרובים בבת אחת בשלב 2 על מנת להבטיח כי ישנם שבב גיבוי, במיוחד אם מה שהופך את המכשיר בפעם הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 5 מ&quot;ל עם מים autoclaved. Secure את מזרק משאבת מזרק והכנס את צינורות קלט ופלט המקבילים. קבע את מהירות הכביסה כדי 750 μL / h כדי לשטוף את השבב במשך כ 10 דקות. בועות האוויר בערוצי הסניףיש נשטף במהלך תקופה זו; אם יש בועות נותרות, להתאים את המהירות ידנית כדי לחסל את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדגם שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של מדגם שמרים מוכן (OD 600 0.6-0.8) לשני צינורות 1.5-מ&quot;ל microcentrifuge צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רוב supernatant מצינור כל ולשלב את השארית ליצירת מדגם 0.5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהה את משאבת המזרק ולהסיר את צינורות הזנה משבב PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית להפוך את משאבת מזרק כדי למצוץ בועת אוויר קטן (1 עד 2 ס&quot;מ אורך) לתוך צינור אחד קלט. הזז על למצוץ במדגם השמרים; בועת האוויר תציג את גבול המדגם מצביע כמה כבר נמשכה מדגם. הערה: הימנע מוצץ המדגם לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינור ההזנה בחזרה לתוך שבב PDMS ולהפעיל מחדש את המשאבה כדי לטעון את התאים במהירות של 750 μL / h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המזרק לשאוב במשך 10 דק &#39;n ולבחון את התקדמות טעינת תא תחת מיקרוסקופ; עם טעינה מוצלחת תהיה תאי מלכודת תחת יותר מ 60% של להשעות עמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to פתרון תזונה ולהתאים את המהירות ל 400 μL / h עבור culturing תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדות תצפית בחר עבור מיקרוסקופ. הערה: עבור מדידות אורך חיים, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 40x. לניתוח כתב הניאון, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרת שמן 60X. </li></ol>

<ol>
	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+High-tech+yeast+ageing.">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li><li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies.">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast.">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143 (2013).</li><li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system.">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length.">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li><li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast:+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p/Msn4p+and+Hsf1p+regulons.">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li><li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מכשיר PDMS צריך להיעשות טרי. אחרת, את בועות האוויר הנגרם על ידי החדרת צינורות לתוך המכשיר תהיינה קשות להסיר. שלב 3.4 חשוב כדי לשפר את יעילות טעינת תא על ידי ריכוז התאים. כדי להגדיל את התפוקה של הניסוי, 4 עד 6 מודולים באותו השבב PDMS מחוברים משאבות הפועלות באופן עצמאי משמשות בד...

ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל עצמת הזדקנות מחקר. עם זאת, assay תוחלת חיים מקובל בשמרים מסתמך על microdissection, וזה לא רק עבודה אינטנסיבית אך גם נמוכה תפוקה 1, 2. בנוסף, הגישה המסורתית microdissection אינה מספקת תצוגה מפורטת של תכונות תאיות ומולקולריות שונות בתאים אם חד ההוריים ככל שהם מזדקנים. הפיתוח של מכשירי microfluidic אפשר הליך אוטומטי למדידת אורך חיי שמרים, כמו גם לעקוב סמנים מולקולריים פנוטיפים הסלולר שונים לאורך חיי תאי אמא 3, 4, 5, 6, 7, 8. אחרי תאי שמרים נטענים לתוך מכשיר microfluidic, הם יכולים להיות במעקב תחת מיקרוסקופ אלקטרוני-הקפות זמן אוטומטיותהדמית דואר. בעזרת הדמית כלים לעיבוד, פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים ניתן לחלץ 3, 6, 8, כולל תוחלת חיים, גודל, כתב ניאון, מורפולוגיה תא, דינמיקת מחזור התא, וכו &#39;, שרבים מהם קשים או בלתי אפשריים להשיג באמצעות שיטת microdissection המסורתית. מכשירים microfluidic שזכו להבלטה מחקר הזדקנות בשמרים מאז הפיתוח המוצלח שלהם 3 לפני כמה שנים, 4, 6, 7. מספר קבוצות מכן פרסמו על וריאציות של העיצובים הקודמים 5, ומעבדות שמרים רבות מועסקות התקני microfluidic המחקר שלהם. בתרבות תא עוברת גידול מעריכי, מספר תאי אמו ישישה זמינים עבור תצפית הוא miniscule. לכן, עיקרון העיצוב הכללי של מכשיר microfluidic למדידות תוחלת חיים הוא לשמר תאי אמא ולהסיר תאים הבת. עיצובים אחד כזה עושה שימוש בעובדה שמרים עובר חלוקת התא אסימטרי. המבנים במלכודת המכשיר תאי אמא גדולים ולאפשר לתאי בת קטנים ייסחפו. שבב microfluidic המתואר במאמר זה משתמש polydimethylsiloxane רך (PDMS) כרית (עמודות pensile אנכיות) לתאי אמא מלכודת (איור 1). התקנים של עיצוב דומה דווחו 3 בעבר, 4, 6, 7. פרוטוקול זה משתמש הליך פשוט לפברק מכשירי microfluidic ו שיטת תא-טעינה פשוטה כי הוא אופטימיזציה עבור ניסויי הדמית הזמן לשגות. אחד הפרמטרים העיקריים במכשיר microfluidic הוא הרוחב של רפידות PDMS המשמשות תאי אמא מלכודת. ד שלנוevice משתמשת רפידות רחבות שיכול לשמור תאי אמא יותר תחת כל כרית, כולל חלק משמעותי של תאי אמא טרייה, שניתן לעקוב אחריהם לאורך כל תוחלת החיים שלהם. בנוסף מדידות אורך חיים, פרוטוקול זה הוא שימושי עבור ניסויי הדמית תא בודד זמן לשגות כאשר התאים צריכים להיות במעקב במשך דורות רבים או כאשר תצפית לאורך טווח החיים היא הכרחית.

<table><tbody><tr><td>3&#039;&#039; &amp;lt;111&gt; silicon wafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 and 3000 Series</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;reg; 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Include Sylgard&amp;reg; silicone elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&amp;trade; punch (I.D. 0.75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002513</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&amp;reg; cover glass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&amp;trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Syringe (Luer-Lock&amp;trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)</td><td>Component Supply Company</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Needle Assortment</td><td>Component Supply Company</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Lab Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

לאחר הניסויים, תוחלת החיים של תאים ורבי פנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לחלץ מן הזמן לשגות תמונות המוקלטות. מאחר שיש מספר תכונות שונות כי ניתן לחלץ כל תא, הצעד הראשון של הניתוח הוא לביאור התאים ואירועים, כולל עמדות וגבולות של התאים ואת התזמון של איר?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells at JoVE.com

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K Views.  Peking University.  מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד. 

Video: Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Bioengineering

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

Genetics

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...