Name: analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

CG נתמך על ידי תרומות של סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר (ANR-13-JSV1-0008), מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (n˚8304162 אינטגרציה מארי קירי קריירה) ומן המועצה האירופית למחקר (ERC) תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר תוכנית חדשנות (n˚639300 גרנט המוצא ERC).

1. ליגנד הצמידה כדי חרוזים מגנטיים הערה: נטיה ליגנד מתבצע באמצעות חרוזים פאראמגנטי המופעל Tosyl עם 2.8 מיקרומטר קוטר (ריכוז פתרון המניות 10 8 חרוזים / מ&quot;ל, 30 חרוזים מ&quot;ג / מ&quot;ל). הפרוטוקול הבא מבוסס על דגימות של כ 2 x 10 5 תאים, אשר מתאימות MRC-5 תאים שגודלו 80% confluency בצלחת בתרבית רקמה 60 מ&quot;מ. כוון את עוצמת הקול של חרוזים ריאגנטים בהתאם אם באמצעות צלחות בגדלים או תאים שונים בהתלכדויות שונות. השתמש בסכום של חרוזי פאראמגנטי כדי שיהיו 2 חרוזים לכל תא. לכן, 4 x 10 5 חרוזים נדרשים על צלחת 60 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing לפחות 30 שניות. Aliquot 40 μL של חרוזים פאראמגנטי מושעים (המקביל ל 4 x 10 6 חרוזים) כדי צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על separati מגנטיעל דוכן על מנת להפריד החרוזים המגנטיים מהפתרון. בטל supernatant, להסיר את צינורית מדוכן הפרדה מגנטי ו resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב לשטוף וחזור פעמיים עם 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה של דבר, resuspend את החרוזים ב 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 מיקרוגרם שור פיברונקטין (FN) או כל ליגנד רצפטור הידבקות תאים אחרים אל pH 1 מ&quot;ל 0.1 M Na-פוספט 7.4 המכילה חרוזים ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים קודמים על ידי החלפת FN או כל ליגנד ספציפי אחר עם BSA, פולי- D- ליזין או apo-transferrin עבור פקדים שליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לניתוח ג&#39;ל, לקחת aliquot 10 μL של פתרון ליגנד עבור ניתוח יעילות crosslinking ומערבבים עם נפח מתאים של חיץ מדגם Laemmli מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים עם תמיסה המכילה ליגנד 12-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מצרף חרוזים להופיע לאחר התגובה התרחשה, sonicate (חשמל רציף 39 W) לכל היותר 10-20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החרוזים באמצעות עמדת פרדה מגנטית, לשאוב את הפתרון הנותרים ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS / 0.2% BSA pH 7.6 פתרון. דגירה של 1 ש &#39;על הרוטור על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים באמצעות פעמיים מגנט עם 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. חרוזים Resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Sonicate אם אגרגטים להופיע לכל היותר 20-30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להסיר aliquot 10 μL בניתוח היעילות צימוד ידי כתם המערבי (לערבב עם נפח מתאים של חיץ מדגם מרוכז Laemmli). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לתא מבחנים או חרוזי חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להפעיל ג&#39;ל SDS-PAGE ו כתם כחול Coomassie לנתח crosslinking FN כדי חרוזים מגנטיים. </li></ol> 2. יישום של כוחות Tensional על חרוזים מצופים ליגנד Bound הידבקות קולטנים על הגבפני השטח של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי חסיד תרבות על צלחת תרבות 60 מ&quot;מ רקמה במדיום גידול מתאים (בדרך כלל DMEM 4.5 גר &#39;/ ל D- גלוקוז בתוספת FCS 10%) עד שמגיע 80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה הלא denaturing הלא יוניים (20 מ&quot;מ טריס HCl 7.6 pH, 150 מ&quot;מ NaCl, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1% NP-40) וצינורות צמרמורת microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים מצופים ליגנד ממדור 1.10 ו resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS / 0.2% BSA pH 7.6. הוספת 100 μL של פתרון חרוזים מצופים ליגנד עד 5 מ&quot;ל של מדיום מערבולת תרבות חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני בצלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולהוסיף 5 מ&quot;ל מדיום הגידול חם בתוספת חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר החרוזים משקעים לדבוק תאים. זה חיוני כדי לא יעלה על 20 דקות מאז חרוזים ניתן הפנימו ידי phagocytosis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להתבונן החרוזים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות obje 10X או 20Xctive ולבדוק הידבקות חרוז ידי טלטול צלחת להפלות בין מצורף צף חרוזים מעט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על תרבות הצלחת בחממה, להחליף את מכסת הצלחת הנורמלית מכסה עם מגנט ניאודימיום עגול 38 מ&quot;מ המצורפת על הפנים העליון. המגנט מוחזק במקום על ידי שני מגנטי ניאודימיום קטנים 13 מ&quot;מ ממוקמים בחלק התחתון של הפנים של המכסה. מאז המגנטים הם מאוד חזקים, לתפעל אותם בקפידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים נתונים מתח עבור נקודות הזמן הרצויות בתנאי תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול, מניחים צלחת על הקרח ובזהירות לשאוב את המדיום כולו מצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL של חיץ תמוגה התא, דגירה במשך 10 דקות על הקרח. אסוף את lysate באמצעות תא מגרד והעברת צינור microcentrifuge מראש צונן 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת החרוזים המגנטיים באמצעות דוכן ההפרדה המגנטי ולהעביר את lysate התא הכולל עד צמרמורת מראש חדשהאד צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. אחסן חלק זה ב -20 ° C לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 3 פעמים עם חיץ 1 תמוגה קר כקרח מ&quot;ל. הוסף 50 μL Laemmli מדגם חיץ גלולה חרוז, ומערבבים על ידי pipetting ומרתיחים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמצעות תנור לחסום יבש. חלק זה מכיל את מתחמי הידבקות המבודדים. המשך ניתוח או חנות ביוכימיים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן lysate התא הכולל המתקבל לאחר ההפרדה חרוזים (כ -300 μL), להסיר aliquot 50 μL לניתוח כתם המערבי. הערה: 250 μL עזב יכול לשמש מחקרים ביוכימיים נוספים כגון מחקרי אינטראקציה בין חלבונים (immunoprecipitation, מבחני נפתח GST) או ניסויי פעילות GTPase (שינוי למאגר תמוגה עשוי להיות נחוץ תלוי GTPase של עניין). </li></ol>

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+forces:+architectural+control+of+mechanotransduction.">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li><li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+adaptation+to+mechanical+stress:+role+of+integrins,+Rho,+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels.">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li><li>Zhao, X. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway.">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells.">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Pelham, R. J., Wang, Y. l. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells.">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li><li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions.">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway.">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li><li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Allostery:+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch.">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li><li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor,+LARG,+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration.">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li><li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion.">TGF-&#946; regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li><li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF.">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li><li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2++flux+in+fibroblasts.">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li><li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching.">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li><li>Kuo, J. -. C., Han, X., Hsiao, C. -. T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+&#946;-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation.">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for &#946;-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li><li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;1-+and+&#945;v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments.">&#946;1- and &#945;v-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li><li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus.">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li><li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex.">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li><li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio, ., A, M. P., Sheetz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+alpha(5)beta(1)+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha(v)beta(3)+and+talin+enable+mechanotransduction.">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li><li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells.">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li><li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes:+Role+of+the+consensus+adhesome.">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li><li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes.">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li><li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Fr&#233;millon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition.">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes.">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2 (2011).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+&#945;4&#946;1+integrin+adhesion+complexes+reveals+&#945;-subunit-dependent+protein+recruitment.">Proteomic analysis of &#945;4&#946;1 integrin adhesion complexes reveals &#945;-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li><li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells.">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , (2015).</li><li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation.">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li><li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons.">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li><li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding,+phagocytosis,+and+cytoskeletal+reorganization.">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li><li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads.">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li><li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction.">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li><li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time.">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטה המתוארת כאן מהווה גישה פשוטה ליישם מתח לקולטנים הדבקה פני תא ולאפשר הטיהור הבאה שלהם. עם זאת, כמה צעדים חיוניים כדי לבצע טיהור הדבקה יעילה אופטימיזציה פוטנציאלי יכולים להיעשות בהתאם קולטנים הידבקות הממוקדות. אנו מציגים בעיות פוטנציאליות המשתמש עלול להיתקל בהמשך. השתמשנו חרוזים מגנטיים 2.8 מיקרומטר בקוטר אבל חרוזים גדולים יותר יכולים לשמש כגון 4.5 מיקרומטר קוטר. עם זאת, קוטר חרוז צריך להיות מוגבל 2-5 מיקרומטר מאז phagocytosis עלול להתרחש מהר יותר במהלך 30-60 דגירה דקה וחרוזים גדולים יש הידבקות חזקה כך עקירה חרוזה תוגבל תחת שדה מגנטי 34, 35. לכן, חשוב להגביל זמן דגירה לתקופות קצרות להשתמש בגודל חרוז הראוי. מספר החרוזים מודגרות לכל תא ישפיע על הכמות של fניסיון orce ידי תא בודד. בעוד אחד לא רוצה לעורר תאים ביעילות עם מתח, יותר מדי חרוזים לכל תא יכולים להוביל הפעלה של מסלולי איתות רלוונטיים. אנחנו בדרך כלל דגירה בממוצע שני חרוזים לכל תא עבור חרוזי מצופי FN, אבל כמות זו יכולה להיות מותאמת [1 עד 5 חרוזים לכל תא] בהתאם לסוג התא לבין הקולטן פני התא. לגבי המגנט, השיטה המתוארת כאן המשמשת אבן שואבת אשר הכח וכתוצאה מכך על 2.8 מיקרומטר כבר נמדד (כ 30-40 pN ידי מדידת התזוזה של חרוזים מגנטיים גליצרול חי, נוזל ניוטוני עם צמיגות ידועה 31, למרות שזה ניתן להשתמש מגנטים גדולים להחיל כמות הכוח גדול במידת הצורך. חשוב לציין כי מגנטים אלה הם חזקים מאוד לתמרן אותם בקפידה. לאחר 12-24 הדגירה h עם ליגנד ECM (שלב 1.7), כמו גם לאחר 1 הדגירה h (שלב 1.9) עם PBS / 0.2% BSA pH 7.6 חיץ, מ &#39;microbeads agnetic עלול ליצור אגרגטים. זהו אז קריטי להפריד חרוזים ככל האפשר לכבד את היחס של 2 חרוזים לכל תא. עם זאת, עד היום מקובל להיות 5: 1 יחס. חרוזים הפרדה ניתן להשיג גם על ידי ערבוב pipetting או באמצעות sonication, למרות לתקופה קצרה (20-30 שניות). חלבונים שונים ניתן מצומדות כדי חרוזים, כולל ליגנד integrin (FN, קולגן), חלבונים רקומביננטיים או נוגדנים מיקוד קולטנים בתא השטח המבוקש. הקובץ המצורף של חרוזים מגנטיים צופה ליגנד אל פני תא הגב עלול להתערער על ידי יעילויות צימוד הנמוכות של ליגנד על החרוזים. מומלץ לבדוק ליגנד מחייב את החרוזים על ידי איסוף aliquot של פתרון ליגנד המדולל לפני הוספת החרוזים aliquot של חרוזים בסוף תהליך הצימוד. aliquots אלה יכולים להיות מעובד לניתוח SDS-PAGE ו Coomassie מכתים כחול. אם אין שינוייםמסלולי איתות או תהליכי mechanosensing צפויים מזוהים, חשוב לשקול את אפשרויות שונות. דרך אחת לזהות את הבעיה הוא לווסת את תקופת הניסוי עם מגנט. עובדה ידועה היא כי מהירות של תהליכים תאיים משתנה בהתאם לסוג התא בשימוש. אפשרות נוספת תהיה לבחון מולקולות מתח רגיש ידוע ובדוק שינויים translational פוסט שלהם באמצעות המערבי סופג (זירחון paxillin למשל או זרחון FAK ניתן לנתח). כמות הכח יכולה להיות גם ביקורתית באמצעות מגנט עבה (באותה הכיתה N52) או חרוזים גדולים יותר יכולה להיות אופציה. בנוסף, ליגנד / קולטן יעילות מחייב יכול להיחקר על ידי מורכבות הידבקות ניתוח ולחפש קולטנים בתא השטח (כגון cadherin או integrin). התא confluency יכול גם להשפיע על התגובה התאית למתיחות. כפי נצפה כי תא / תאי הידבקות יכולה להשפיע על התנהגות תא cystokeletal prestress, זה important לציין כי confluency עשוי להשפיע על התגובה התאית למתיחות. למרות שאנחנו ממליצים 80% confluency להשמת מתח הידבקויות מבוססים integrin, תנאים שונים עשויים להיבדק על מנת לייעל את המערכת הניסיונית. אמנם שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לפענח את adhesome המתח הרגיש כמו גם מסלולי האיתות הקשורות, זה גם היה מספר מגבלות. ראשית, מאז הדאגה העיקרית באמצעות חרוזים מגנטיים קטן גודל כזה הוא הסיכון של הפנמה שלהם על ידי התאים, שיטה זו לא ניתן להשתמש ללימוד לטווח ארוך mechanosensitive איתות התגובות הסלולר שמשנים גורל התא כגון בידול ושגשוגם. מגבלה נוספת טמונה בדרך של איך כוחות מוחלים על שכבה של תאים בצלחת התרבות. ואכן, מאז השדה המגנטי הוא תמיד גבוה יותר בפריפריה של המגנט, כוחות יכולים להשתנות על פני השטח של צלחת התרבות עם שיפוע יורד של תאמתיחה מהפריפריה למרכז ועשוי להוביל תגובות הסלולר הטרוגנית. ההליך המתואר כאן מהווה שיטה יעילה פשוטה ועלות המאפשרת ללמוד מסלולים הסלולר mechanosensitive וכן חוקר את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות נתונים במתח. בניגוד לגישות אחרים, כגון מתיחת מכשיר החלים זן מחזורי לתאים, להוביל לנקיטה של ​​מתח לכל קולטנים בתא שטח אינטראקציה עם תאי מטריקס. השיטה המתוארת כאן יש את היתרון של מה שמאפשר גירוי כוח של תת-סדרה ספציפית של קולטנים בתא שטח ועוד מגוון גדול של הליגנדים יכול לשמש, כגון integrin הליגנדים או נוגדני מיקוד קולטנים בתא שטח, המאפשרים ללמוד על מערכות mechanosensitive רבות ברורות. יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי היא מובילה בטיהור מתחמי החלבונים אשר חוותה מתח לעבוד על loadbearing elements אשר ידועים לשחק תפקיד מרכזי mechanotransduction 36. מתחם ההידבקות המטוהר יכול לשמש גם עבור גישות ביוכימיים שונות 14, כגון מבחני קינאז לחקור פעילות קינאז בתגובת מתח, או assay פילמור יקטין. בנוסף, מערכת ניסיונית זו ניתנת בשילוב עם פינצטה המגנטי לחקור את התגובה המכנה הסלולר לתאם את התגובה הזאת עם מסלולי איתות המזוהים. מעניין לציין, כי חלקיקים magnetoplasmonic שימשו לאחרונה מכנית Notch עומס ו- E-cadherin עם שליטה מדויקת בזמן ובמרחב 37. התפתחות אחרונה זה עשויה לעזור לחקור מסלולי איתות mechanosensitive עם תשומות מרחבית, זמניות מכאניות שונות.

בשנת metazoa, מתח מכני מכוון התפתחות רקמת הומאוסטזיס באמצעות הסדרת מספר עצום של תהליכים תאיים כגון התפשטות, בידול הישרדות 1, 2. מתח מכאני יכול לנבוע מטריקס או יכול להיוצר על ידי תאים חסידים, אשר מדגם הסביבה התאית שלהם באמצעות מכונות התכווצות actomyosin שמושכות אל תאי מטריקס וזונדים הנוקשים שלה באמצעות מולקולות מתח רגיש. בתגובת מתח, חלבוני הידבקות mechanosensitive לעבור שינויים מרחביים המפעילים מפלי איתות מורכבים. בתורו, מסלולי איתות אלה לתזמר mechanoresponse מקיף התפשטות, בידול והישרדות אשר מתאים את ההתנהגות הסלולר לסביבה התאית. ניתן ליישבם תהליכים כאלה בתוך פרק זמן קצר טווח (שניות עד דקות) להאכיל בחזרה במהירות אל הלולאה של מכה<html> notransduction ידי שינוי מבני mechanosensitive. למשל, הידבקויות מבוססי integrin לחזק בתגובה מתח דרך שיפוץ cytoskeletal בתיווך GTPase Rho 3, 4, 5. במקביל, מסלולי איתות אחרים מופעלים על שעות וימים לשלוט תכנות גנטי כי בסופו של דבר להשפיע תא גורל 6. בעוד מחקרים רבים הדגישו את השפעת נוקשות מטריקס על דטרמיניזם תא ומחלות פיתוח 1, 2, המנגנונים המולקולריים המדויקים של mechanotransduction בתיווך ההידבקות עדיין להישאר חמקמקים. גישות שונות פותחו כדי לחקור את ההשפעות של כוחות שנוצר תא או כוחות חיצוניים על התנהגות תא, כוללים מערכות זרימה, העברת אנרגית תהודת קרינת חיישני -tension (סריג) 7,ילדה = &quot;Xref&quot;&gt; 8, תואם מצעים 9, פינצטה המגנטית, פינצטה אופטית 10 ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 11. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזי פאראמגנטי לאפיין מסלולי mechanotransduction בתגובת כוחות tensional להחיל קולטנים הידבקות ספציפיים. חרוזי פאראמגנטי הם חלקיקים כי הפיך למגנט כאשר הניחו שדה מגנטי. לאחר מצופה ליגנד עבור קולטן מסוים, חרוזים אלה מספקים כלים רבים עצמה כדי לחקור את ההשפעות של יישום כוח תאי. שיטה זו תאומת על ידי מספר מחקרים 3, 5, 12 - 17 מציגה את היתרון כדי להקל על ניתוח ביוכימיים בעיקר על תאים חסידים. באמצעות חרוזים מגנטיים דומים מצופה קולגן ואחריו ניתוח ביוכימיים, עבודה מוקדמת דיווחה על עלייהזירחון החלבון טירוזין ו RhoA ההפעלה בתגובה מתח 5, 18, 19. השיטה המתוארת להלן שמשה גם עם פיברונקטין (FN) חרוזים מצופים לאפיין את מסלולי האיתות במורד זרם המתח להחיל integrins 3. במחקר זה, Guilluy et al. המתח עולה כי מפעיל RhoA באמצעות גיוס של הגורמים החליפין נוקלאוטיד שני גואנין (GEFs), LARG ואת GEF-H1, לקומפלקסים הידבקות integrin. מאז, מחקרים אחרים הראו כי GEF-H1 מגויסת לקומפלקסים דבקים בתגובת מתח תא שנוצר באמצעות שיטות שונות 20, 21, הוכחת את החוסן של המתודולוגיה המתוארת כאן. כתוצאה מכך, מופעל RhoA הוצגה לקדם חיזוק הידבקות, דרך שיפוץ cytoskeletal. מערכת זו גם שמשה לחקור מיושם מתח to קולטנים הידבקות תא / תא. יישום של כוחות על חרוזים מגנטיים צופה עם התחום התאי של E-cadherin שהגדיל גיוס vinculin בדומה מתחמי ההידבקות קשור integrin 12. קולינס ועמיתיו ציינו כי יישום של מתח PECAM-1 מקדם integrin ו RhoA הפעלת 13. גישה נוספת ניסיוני באמצעות חרוזים מגנטיים היא חקר מתח להחיל גרעינים בודדים. באמצעות חרוזים מצופים עם נוגדנים כנגד חלבון מעטפת הגרעין nesprin-1, מתחמי מעטפת הגרעין היו מטוהרים כדי להראות שהם מוסדרים באופן דינמי בתגובה מתח מכני 22. תוצאות אלו תומכות האדירות של שיטה זו בחקר מסלולי mechanotransduction. יתר על כן, בעוד מערכות זרימה או כוח המתיחה לעורר תהליכים תאיים כלליים, חרוזים מגנטיים שמתמקדים קולטן הידבקות תא באמצעות אחת הליגנדים קולטן 13, 15. יתרון נוסף של שיטה זו הוא הבידוד של מתחמי הידבקות באמצעות הליך טיהור זיקה ליגנד פשוט. עובדה ידועה היא כי תוספת של חרוזים מצופים ליגנד לתאים נקשר לקולטנים הידבקות ומשרה את הגיוס של חלבונים הידבקות מספר 23. בקשה נוספת של כוחות כדי חרוזים מגנטיים צופה ליגנד הופכת מתחמי הידבקות אלה לתוך פלטפורמות macromolecular שמתווכים מסלולי איתות מתח תלוי שונים 4, 24. Cell תמוגה ואחריו ריכוז חרוז באמצעות מגנט מתיר את בידודה של פלטפורמות הידבקות. שיטות אחרות להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות כבר שימשו תאים חסיד. הם משלבים crosslinking כימי כדי לחסוך אינטראקציות בין חלבוניםו צעד תמוגה התא על ידי חומר ניקוי ותזרים גזירה או sonication 20, 21, 25, 26, 27, 28. השלב האחרון הוא האוסף של ממברנות פלזמת גחון וכתוצאה המכילות את מתחמי ההידבקות. בניגוד לשיטות אלה, חרוזים מגנטיים לאפשר רמת טיהור גדולה של מתחמי הידבקות תא על ידי מיקוד סלקטיבי מש&#39; מסוימת של קולטנים הידבקות. חרוזים מגנטיים כבר להשתמש בהם כדי לטהר מתחמי הידבקות תאים שאינם חסיד המצורפת microbeads מצופה ליגנד 29, 30. השיטה המתוארת להלן מחק מצבים ביולוגיים שבו כוח מוחל לתקופה ממושכת קצרה (שניות עד דקות). לכן, זה מספק כלי רב עצמה על החקירה היא את ההרכב המולקולרי של מתחמי הידבקות מטוהריםמסלולי mechanosensitive-איתות במורד הזרם. כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות tensional לחלבוני משטח דבק. מגנט ניאודימיום קבע מושם על גבי משטח תרבות הצלחת. פן המוט של המגנט הוא ממוקם בגובה של 6 מ&quot;מ כך שהכח על חרוז מגנטי יחיד 2.8 מיקרומטר הוא קבועים (כ 30-40 pN) 31. משך גירוי מתח נקבע על ידי המפעיל בהתאם המולקולה של ריבית בקנה המידה בעת ההפעלה שלה. תאים הם סוף סוף lysed, מתחמי הידבקות הם מטוהרים על ידי פרדת חרוזים באמצעות מגנט וניתוחי ביוכימיים מעובדים. פרוטוקול זה כולל הכנת חרוזים פאראמגנטי מצופה ליגנד, ואת היישום של מתח באמצעות מגנט ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח להחיל ADH מבוסס integrinesions גורם שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

<table><tbody><tr><td>Neodymium magnets (on the upper face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>grade N52 dimension: 1 1/2&quot; dia. x 1/2&quot; thick</td></tr><tr><td>Neodymium magnets (on the lower face of 60 mm dish)</td><td>K&amp;amp;J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>grade N42 dimension: 1/2&quot; dia. x 1/4&quot; thick Black Plastic Coated&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetic beads&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronectin from bovine plasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bovine Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing cell surface adhesion remodeling in response to mechanical tension using magnetic beads

מתחמי הידבקות תא משטח Mechanosensitive לאפשר לתאים לחוש את התכונות המכאניות של סביבתם. מחקרים שנעשה לאחרונה זיהו הם מולקולות חישת כוח באתרים דבקים, ואת גורמי תעתוק תלוי כוח המווסתים ביטוי גנים ספציפי שושלת ולנסוע פלטי פנוטיפי. עם זאת, רשתות איתות המרת מתח מכאני לתוך הביוכימיים נותרו חמקמקות. כדי לחקור את מסלולי האיתות עוסקים על מתח מכאני להחיל פני תא קולטן, microbeads פאראמגנטי ניתן להשתמש. כאן אנו מציגים פרוטוקול באמצעות חרוזים מגנטיים להחיל כוחות לחלבונים דבקים פני תא. בגישה זו, אפשר לחקור מסלולי איתות ציטופלסמית כוח תלוי רק לא על ידי גישות ביוכימיות שונות, אלא גם שיפוץ הידבקות על ידי בידוד מגנטי של מתחמי הידבקות מצורפים החרוזים מצופים ליגנד. פרוטוקול זה כולל הכנת שיתוף ליגנדחרוזי פאראמגנטי ated, ואת היישום של להגדיר כוחות מתיחים ואחריו ניתוחים ביוכימיים. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת מתח שחל על הידבקות מבוססת integrin מפעיל שיפוץ הידבקות ומשנת זירחון החלבון טירוזין.

סכמטית של הטכניקה מודגמת באיור 1 א. בעקבות נטייה ליגנד, חרוזים מגנטיים מודגרת עם תאים במשך 20 דקות, ולאחר מכן מגנט קבוע משמש כדי להחיל כוחות מתיחים של כ 30-40 pN עבור כמות זמן שונה. 1b איור מראה 2.8 מיקרומטר חרוזים מגנטיים מצופה FN כבול קולטנים הידבקות התא MRC5. השלבים לשטוף חרוזים פאראמגנטי לאחר תמוגה התא הם קריטיים ולקבוע את מידת טיהור. מינימום של שלושה שוטף מומלץ. Immunoblots GADPH עם חשיפות ארוכות יכול להיות שימושי כדי לבחון את טוהר מתחמי הידבקות (איור 2 א). FN מצופה חרוזים שימשו לחקור את תהליכי mechanotransduction המתרחשות לאורך זמן על מתחמי הידבקות בתגובה למתח. לאחר פרדה מגנטית של השבר המורכב ההידבקות, lysate ואת שבר ההידבקות המורכב נותחו על ידיכתם מערבי. כצפוי, צפינו תלין, vinculin ו paxillin, אבל לא GAPDH בשבריר מתחמי הידבקות גם במקרים שאין בהם גירוי מכני (איור 2b). עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים 32, 33, מתח מופעל גיוס vinculin לקומפלקסי הידבקות. בעוד מתח לא השפיע גיוס paxillin לקומפלקסי הידבקות, זירחון על טירוזין 31 שופר בתגובת מתח מכאני הן lysate התא סכה בשבריר ההידבקות המורכב. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig1.jpg" /> איור 1. תיאור של השיטה. (א) איור סכמטי של הטכניקה. תאים הם ראשית בתרבית תרבות בינונית עד confluency הרצוי הוא הגיע. לאחר מכן, חרוזים פאראמגנטי מתווספים במשך 15-20 דקות. כוחות Tensional על 30-40 pN הםאז מיושם באמצעות המגנט מכויל עבור משך הזמן שונה. (ב) חרוזים פאראמגנטי מצופה פיברונקטין להיקשר לקולטנים הידבקות התא. תאים הם צילמו ידי בניגוד שלב ב משודר-אור מיקרוסקופיה 15 דקות לאחר הוספת חרוזים פאראמגנטי (חץ לבן) בינוני. (תמונה למעלה: בר סולם = 25 מיקרומטר, תמונה תחתונה: סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55330/55330fig2.jpg" /> איור 2. מתח מכני גורם התבגרות הידבקות. (א) טיהור של מתחמי הידבקות. immunoblotting GAPDH משמש טעינה מלאה עבור lysate התא הכולל וכדי לבדוק את טוהר מתחמי הידבקות. קרום nitrocellulose כבר צילמו באמצעות חשיפה ארוכה להפגין הבהיעדר דואר של אות בשבריר מורכב הידבקות. (ב) מתח גורם התבגרות הידבקות. טעינה מלאה (GAPDH) ומועמדים (vinculin, תלין ו paxillin) ידוע יגויסו או פוספורילציה ב מתחמי הידבקות בתגובה למתח מכני immunoblotted. ניסוי זה בוצע על MRC5 תאים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55330/55330fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads at JoVE.com

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

analyzing-cell-surface-adhesion-remodeling-response-to-mechanical

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Centre de recherche UGA - INSERM U1209 - CNRS UMR.  הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקו...

Video: Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Bioengineering

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Biochemistry

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>מחקר In Vivo Mechanotransduction באמצעות חרוזים מגנטיים בלב דג הזברה

Manipulating Mechanical Forces in the Developing Zebrafish Heart Using Magnetic Beads

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction and physical stimuli generated by the beating heart. Intracardiac hemodynamics, driven by blood flow, emerge as fundamental information shaping the development of the embryonic heart. Here, we describe an effective method to manipulate mechanical forces in vivo by grafting a 30 &#181;m to 60 &#181;m diameter magnetic bead in the cardiac lumen. The insertion of the bead is conducted through microsurgery in anesthetized larvae without perturbing heart function and enables artificial alteration of the boundary conditions, thereby modifying flow forces in the system. As a result, the presence of the bead amplifies the mechanical forces experienced by endocardial cells and can directly trigger mechanical stimulus-dependent calcium influx. This approach facilitates the investigation of mechanotransduction pathways that govern heart development and can provide insights into the role of mechanical forces in cardiac valve morphogenesis.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הבנת הכוחות המכניים המעורבים בעיצוב לב דג הזברה

This protocol outlines a method for grafting a magnetic bead into the developing zebrafish heart through microsurgery, enabling the manipulation of mechanical forces in vivo and triggering mechanical stimulus-dependent calcium influx in endocardial cells.

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanical forces continuously provide feedback to heart valve morphogenetic programs. In zebrafish, cardiac valve development relies on heart contraction ...

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

פינצטה מגנטית במהירות גבוהה למדידות ננומכניות על אלמנטים רגישים לכוח

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים

מניפולציה של כוחות מכניים בלב דג הזברה המתפתח באמצעות חרוזים מגנטיים