Name: an aptamer-based sensor for unchelated gadolinium(iii)
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII at JoVE.com

We would like to gratefully acknowledge Dr. Milan N Stojanovic from Columbia University, New York, NY for valuable scientific input. This work is supported by funding from the California State University East Bay (CSUEB) and the CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C., and A.L. were supported by the CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום. 1. הכנת פתרונות מניות Aptamer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). גדיל 1 (-aptamer ה &#39;): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 &quot; סטרנד 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל קווצה מים לעשות 100 פתרונות מניות בודדות מיקרומטר של aptamer-ה &#39;ואת QS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן פתרונות אלה ב -20 ° C. הפתרונות הם יציבים עד כה, במשך 3 שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער FreeZדואר ההפשרה מחזורים, לאחסן את פתרונות המניות ב 10 aliquots μL. </li></ol> 2. הכנת הפתרון-חיישן ה 2x <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ assay (20 HEPES מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 150 מ&quot;מ NaCl, KCl 5 מ&quot;מ). התאם את ה- pH ל ~ 7.4 עם NaOH ו HCl, ולסנן דרך מסננים העליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר PES. אחסן בבקבוקים סטריליים. אם מסונן מאוחסן כראוי (בטמפרטורת החדר), למאגר יציב עד כה, עבור 2 שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 μL של פתרון ה-aptamer המניות (משלב 1.2) ו -2 μL של פתרון המניות QS (משלב 1.2) ב 497 μL של חיץ assay. מערבבים היטב בעזרת מערבולת. הריכוזים שלהם בפתרון ה-חיישן 2x הם 200 ננומטר ו 400 ננומטר, בהתאמה. הערה: היקף הפתרון ה-חיישן 2x מוכן בשלב זה הוא 500 μL, וזה מספיק כדי לבדוק 6 - 7 ריכוזים שונים של אלוקים 3+ עבור עקומת הכיול ואת הפתרונות חומר ניגוד(שלב 3). כל דגימה תיתן בארות כפולות צלחת 384 גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את עוצמת הקול של פתרון 2x אלוקים-החיישן פי מספר פתרונות 3+ האלוקים שצריך להיבדק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון-חיישן ה 2x ל -9 צינורות PCR, עם 50 μL לתוך צינור אחד. מניחים את צינורות Cycler תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תוכנית Cycler התרמית כדי לחמם את הפתרון המוצע עבור צינורות עד 95 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 5 דקות, ואז לאט לאט לקרר את פתרונות ל -25 מעלות צלזיוס מעל ~ 15 דקות (בשיעור של ~ 0.05 - 0.1 ° C / ים). מחזור החימום וקירור הוא להבטיח הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה &#39;ואת QS. תוצאות הכלאה חלקית מרווה שלמה קרינת רקע גבוהה של החיישן. אם Cycler תרמית אינו זמין, לבצע את התהליך הזה באמצעות אמבט מים חמים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מצונן עד 25 מעלות צלזיוס, מיד להשתמש הפתרון, או לשמור Cycler התרמית (עד כ 2 שעות) עד מוכן להיותמְשׁוּמָשׁ. כאשר באמבט מים משמש למערכות החימום, לעזוב את הצינורות באמבטיה כמו המים מתקררים לאט לטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. בניית עקומת כיול הקרינה לאיתור נוכחות של הקב&quot;ה Unchelated 3+ בתמיסה של חומר ניגוד אלוקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים GdCl 3 מוצק למאגר assay (אותו למאגר כמו בשלב 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דילול סדרתי, להכין 100 μL כל אחד 6 פתרונות 3+ שוני אלוקים צינורות microcentrifuge ב כפול הריכוזים הרצויים הסופיים עבור עקומת הכיול (2x פתרונות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, כדי לבנות כיול עבור 0 (מאגר בלבד ללא GdCl 3), 50, 100, 200, 400, ו -800 ננומטר של הקב&quot;ה 3+, להכין תמיסות המכילות 0, 100, 200, 400, 800, ו -1,600 ננומטר של היון. הקפד תמיד לכלול את &quot;אטומים&quot; עם 0 ננומטר אלוקים 3+ כמו שליטה שלילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את חומר ניגוד להיות מבחןאד למאגר assay. כן 2 או 3 ריכוזים שונים של פתרונות חומר ניגוד דרך דילול סדרתי. הערה: בדיקת 3 ריכוזים שונים של פתרון חומר ניגוד מומלצת. זו היא להבטיח כי ריכוזים אלה נמצאים בטווח ליניארי. אם בדגימות שנבדקו אינו מציג קשר לינארי, הקטינו את הריכוזים של חומר הניגוד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן משלב 2.5 מתוך Cycler התרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של כל פתרון ה 3+ משלב 3.2 לתוך 6 מתוך 9 צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כל צינור PCR מכיל כעת את הריכוז הרצוי של הקב&quot;ה 3+ להיבדק, 100 ננומטר אלוקים-aptamer, ו -200 ננומטר QS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל צינורות הנותרים PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן, להוסיף 50 μL של פתרונות חומר ניגוד משלב 3.3. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שלolutions בתוך צינורות PCR במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. הם עשויים להיות שנותרו לעמוד עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 45 μL של כל צינור לתוך צלחת 384 גם. כל צינור PCR ייתן בארות כפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הקרינה של כל אחד גם על קורא צלחת. Fluorophore (FAM) המשמש לעיצוב חיישן-ה &#39;יש מקסימום עירור ופליטה של ​​ננומטר 495 ו -520 בהתאמה, כמפורט באתר האינטרנט של הספק. בחר אורכי גל עירור ופליטה מתאימים או מסנן תלויים אם הצליח-הקורא monochromator- או מסנן מבוסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרף של קרינה ביחידות קרינה שרירותיות (עפו) נגד ריכוז של קב&quot;ה 3+. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרף כמו שינוי לקפל הקרינה נגד ריכוז של הקב&quot;ה 3+. חשב את השינוי לקפל הקרינה על ידי חלוקת עפו של כל ריכוז ידי עפו של הפתרון &quot;אטומים&quot; (עם 0 ננומטר של הקב&quot;ה 3+). השינוי לקפל קרינה יאפשר עבור normalization של התוצאות, צריך התצוגה עפה עת מסוימת (בימים שונים, וכו &#39;) וריאציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את פליטת הקרינה של תמיסה המכילה חומר הניגוד ו &#39;ריק&#39;, המהווה את התמיסה המכילה 0 ננומטר GdCl 3 (מאגר בלבד). הערה: קרינה גבוהה יותר של פתרון GBCA מרמזת על הנוכחות של unchelated אלוקים 3+, אשר עשוי להצריך טיהור נוספת של חומר הניגוד. הכמות הנוכחית 3+ unchelated האלוקים ניתן להעריך באמצעות עקומת הכיול נבנתה בשלב 3.10 או 3.11. </li></ol>

<ol>
	<li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents.">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li><li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrogenic+systemic+fibrosis:+a+concise+review+for+cardiologists.">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li><li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+contrast+agents:+basic+chemistry+and+safety.">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li><li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples:+a+review.">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li><li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., H&#252;tter, J., Weinmann, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C.">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li><li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS.">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li><li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater.">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li><li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations.">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li><li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium(III)+ions+in+aqueous+solution.">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li><li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note.">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li><li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers.">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li><li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+gadolinium+chemistry.">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li><li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands.">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li><li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence.">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים 3+ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את ...

החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) 1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה 3+) מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב&quot;ה unchelated 3+ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת 2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות של 3+ unchelated הקב&quot;ה בפתרונות GBCA לעתים קרובות היא תוצאה של תגובה מלאה בין ליגנד ואת יון, דיסוציאציה של המתחם, או displacement ידי קטיונים מתכת ביולוגיים אחרים 3. בין מספר טכניקות המשמשות כיום לקביעת הנוכחות של קב&quot;ה 3+, שמסתמך על כרומטוגרפיה ו / או דרגת ספקטרומטריית הגבוהה ביותר מבחינת צדדיות ותחולה 4. בין שאר מעלותיו שלהם גבוהה רגישות ודיוק, היכולת לנתח מטריצות מדגם שונות (כולל בסרום אדם 5, שתן ושיער 6, שפכים 7, ועל ניסוחים חומר ניגוד 8), ואת כימות סימולטני של מתחמי ה 3+ מרובים (הרישום של מחקרים קודמים עד 2013 מתוארת סקירה מקיפה על ידי Telgmann et al.) 4. החסרון היחיד הוא כי כמה שיטות אלה דורשים instrumentations (כגון מצמידי אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית) 4 כי מעבדות מסוימות עשויות לא תהיינה גישה. במסגרת גילוי GBCA רומן על מחקר הוכחה של קונספט רמות, arelatively יותר נוחה, מהירה, וחסכוני שיטה מבוססת ספקטרוסקופיות (כגון ספיג או קרינת UV-Vis) עשויה לשמש אלטרנטיבה יקרה. בעזרת יישומים אלה בחשבון, חיישן פלורסנט מבוסס aptamer עבור מימיית אלוקים 3+ פותח 9. Aptamer (חס-aptamer) הוא מולקולת DNA חד-גדילי ארוך 44-בסיס עם רצף של בסיסים כי היה מבודד בתהליך האבולוציה שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9. כדי להתאים את aptamer לתוך חיישן ניאון, fluorophore מחוברת התחנה הסופית &#39;5 של גדיל, אשר הוא הכלאה ואז עם גדיל מרווה (QS) באמצעות 13 בסיסים משלימים (איור 1). QS מתויג עם מולקולת מרווה בחושך ב 3 התחנה הסופית &#39;. בהיעדר ה 3+, החיישן (חס-חיישן), מורכב ביחס של 1: 2 חפרפרת של הקב&quot;ה-aptamer ו QS בהתאמה, יהיה t בשל פליטת קרינה מינימאליתo העברת אנרגיה מן fluorophore אל מרווה. התוספת של מימית אלוקים 3+ יהיה לעקור את QS מן הקב&quot;ה-aptamer, וכתוצאה מכך גידול פליטת הקרינה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> איור 1. החיישן (חס-חיישן) שמורכב של aptamer הארוך 44-הבסיס (-aptamer ה &#39;) מתויג עם והעמסה (א fluorophore) ואת גדיל המרווה ארוך 13-בסיס (QS) מתויג עם dabcyl (א מרווה כהה) . בהעדר unchelated אלוקים 3+, הקרינה של החיישן היא מינימלית. עם תוספת של הקב&quot;ה 3+, עקירה של QS מתרחשת וגידול פליטת הקרינה הוא ציין. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יש כרגע, אחד נפוצה מבוסס ספקטרוסקופיות שיטה לזהותing 3+ אלוקים מימי. Assay זו משתמשת תפוז xylenol מולקולה, אשר עוברת שינוי אורך הגל קליטה מקסימלית מפני 433 עד 573 ננומטר על קלאציה אל יון 10. יחס מקסימום ספיגת שני אלה יכולים לשמש כדי לכמת את כמות unchelated אלוקים 3+. חיישן aptamer מהווה חלופה (יכול להיות גם משלים) אל assay הכתום xylenol, כמו שתי השיטות יש תנאי תגובה שונים (כגון pH ורכב של תמיסות בופר בשימוש), selectivities היעד, טווח ליניארי של כימות, ואופני זיהוי 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and fluorophore modification in the order form</td><td>A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Quenching strand</td><td>IDTDNA</td><td>Input sequence and quencher modification in the order form</td><td>A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.</td></tr><tr><td>Molecular biology grade water</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well</td></tr><tr><td>Gadolinium(III) chloride anhydrous</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride anhydrous</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toxic and corrosive</td></tr><tr><td>384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Plates which are suitable for fluorescence reading are required.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane</td></tr><tr><td>Disposable sterile bottles 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>A larger or smaller bottle may be used</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>Micropipets</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer</td></tr><tr><td>Pipet tips (non filter) of appropriate sizes</td><td></td><td></td><td>No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Plate readers from other manufacturers would work equally well</td></tr></tbody></table>

an aptamer-based sensor for unchelated gadolinium(iii)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים 3+ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII at JoVE.com

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

7.2K Views.  California State University, East Bay. The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor. 

Video: An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

חקירות על קומפלקס Ga (III) של EOB-DTPA ו שלה<sup&gt; 68</sup&gt; Ga radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון חומרי ניגוד מבוססי dendrimer עבור דימות תהודה מגנטית

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medicine

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Bioengineering

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

מכשירי חימום המבוסס על לייזר מותאם אישית המיועדים לשחרור עורר, ציספלטין מThermosensitive יפוזומים עם הדרכת תמונת תהודה מגנטית

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקה פלואורסצנטית לזיהוי כלטורי ברזל חדשניים

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: הערכת ההשפעה של כלטורי ברזל חדשים על חילוף החומרים של תאים סרטניים

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

Cancer Research

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe targeting the fibroblast activation protein for positron emission tomography imaging of the tumor microenvironment. The reaction conditions involved acetate buffer (final concentration: 0.1 M), methionine as an anti-radiolysis agent (final concentration: 5.4 mg/mL), and 30 &#181;g of 3BP-3940, with heating for 8 min at 98 &#176;C. A final purification step on a C18 cartridge was necessary to obtain a radiolabeled product of high purity. In contrast, the generator-produced 68Ga was used directly without a concentration step on a cation exchange cartridge. The production of three validation batches confirmed the method&#39;s reliability, allowing the synthesis of [68Ga]Ga-3BP-3940 in 22.3 &#177; 0.6 min with high radiochemical purity (RCP), as determined by both radio-HPLC (99.1% &#177; 0.1%) and radio-TLC (99.2% &#177; 0.1%). The average radiochemical yield, based on RCP values measured by radio-HPLC, was 74.4% &#177; 3.3%. The stability of the radiolabeled product was demonstrated for up to 4 h after preparation. This protocol provides a reliable, rapid, and efficient methodology for the preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940, which can easily be transposed to a clinical setting.

This research describes the automated process for [68Ga]Ga-3BP-3940 production with the GAIA V2 synthesizer, for PET imaging of fibroblast activation protein. The results of quality control tests performed on three test batches are also presented.

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חקירות על קומפלקס Ga (III) של EOB-DTPA ו שלה

הכנה

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

מכשירי חימום המבוסס על לייזר מותאם אישית המיועדים לשחרור עורר, ציספלטין מThermosensitive יפוזומים עם הדרכת תמונת תהודה מגנטית

ריחוף מגנטי יחד עם הדמיה ניידת וניתוח עבור אבחון מחלות

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

Automated Preparation of [⁶⁸Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment