אנו מודים סטיוארט לוין להערות על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM056800 ואת קאתי קורט אריחים Cancer Research הקרן אנג&#39;ליקה עמון בחלקו על ידי P30-CA14051 גרנט תמיכה קוך המכון. אנג&#39;ליקה עמון הוא גם חוקר של הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן גלן Biomedical Research. קאק נתמך על ידי T32GM007753 גרנט הדרכת NIGMS.

<ol>
	<li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li><li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li><li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease.">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li><li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity,+population+stratification,+and+selection+of+human+copy-number+variation.">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761 (2015).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity.">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li><li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases.">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li><li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells.">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li><li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer.">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li><li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer.">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues.">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing.">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li><li>. KAPA Library Quantification Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016)</li><li>. DNAcopy Available from: <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016)</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism.">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell.">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing.">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li><li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei.">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li><li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Genomics:+Advances+and+Future+Perspectives.">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

באופן מסורתי, זיהוי CNVs ו aneuploidy ברמה של תאים בודדים נדרשים שיטות ציטולוגיה כגון דגי SKY. עכשיו, רצף תא בודד התפתח גישה חלופית עבור שאלות כאלה. יש רצף תא יחיד יתרונות על פני דגי SKY כפי שהוא הוא הגנום כולו ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, כאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, רצף תא בודד יכול לספק הערכה אמינה יותר של CNVs ו aneuploidy כפי שהוא לא רגיש וממצאי הכלאה והפצת הטבועות דגי SKY. עם זאת, רבים של היישומים האחרונים של רצף תא בודד לא אושש על ידי הערכה יסודית של הרגישות וסגולית של השיטות ומנתח. ואכן, חלק מן הגישות אנליטית שמוצג מחקרים אחרים המשויכים תדרים גבוהים (&gt; 50%) של שקר חיובית CNV מכנה 12. הגישה נתאר נבדקה בקפדנות באמצעות תאים של KNנטל CNV עצמו כדי לקבוע שיעורי גילוי אמת ושקר לייעל את הרגישות והסגוליות של זיהוי CNV 12. באמצעות בקרת איכות גישות אנליטיות מתוארת בפרוטוקול זה, כ 20% של 5 רווחים Mb, 75% עליה של 5 הפסדים Mb, וכל CNVs עולה על 10 Mb ניתן לאתר. למרות קביעת שיעור גילוי השווא של רצף תא בודד קשה, אנחנו מעריכים שזה יהיה פחות מ -25%. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים ממגוון מקורות, סקריפטים יכול להיות שונה כדי להתאים את הרזולוציה של זיהוי CNV, ואת הפרוטוקול ניתן להתאים לזהות וצורות אחרות של שינויי הגנומי. יש מגוון של אמצעי מתנער רקמות טריות לתוך תאים בודדים, ורבי פרסומים לתאר הליכים מותאמים במיוחד ברקמות ספציפיות, כגון 24 עור 25 מוח. אנחנו מעדיפים לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות שכן היא מאפשרת FO<html> r הערכה חזותית של כל תא כדי להיות רצף. עם זאת, אפשר גם לבודד תאים בודדים ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 26 והתקני microfluidic 27. אם בידוד תא יחיד הגברה הגנום כולו מתבצע באופן ידני, סביר לבודד להגביר עד תאים ארבעים אחד יושב. על מנת לקבל נתוני רצף תא בודד באיכות גבוהה, חשוב כי ההגברה של הגנום תא בודד היא אחידה ושלמה. אנו מוצאים כי איכות יחיד תאים המבודדות כמו גם את היעילות של תמוגה יש הגברת השפעה משמעותית על איכות נתוני רצף. ככזה, יש לקצור את התאים מן סביבת מולדתם רק לפני הבידוד והגברת הגנום כולו צריך להתחיל מייד לאחר תאים מבודדים. יתר על כן, צעד תמוגה והפיצול יש לפעול בדיוק כפי שמתואר בשלבי 2.3-2.6. &quot;&gt; האלגוריתמים יכול להיות מותאם כדי לשנות את הרזולוציה של זיהוי CNV, עם השפעות מנוגדות על הרגישות והסגוליות 12. כמו כן, ניתן להתאים את הספים כדי לזהות aneuploidy כל כרומוזום בסביבה של 11 tetraploidy. עם זאת, אנו מוצאים כי הגישה שלנו מוגבלת לגילוי CNVs יותר מ -5 Mb, כרעש הציג במהלך הגברת הגנום כולו מסבך זיהוי של וריאנטים קטן 12. שיפורים עתידיים בגישות הגברת הגנום כולו צריכים בסופו של דבר לשפר את הרזולוציה של זיהוי CNV באמצעות רצף תא בודד. רצף תא בודד מאפשר לחקירה של שינויים במספר העותק יחידים לא אבל גם וריאציות נוקלאוטיד בודדות 28, 29 ו וריאציה מבנית 30. הפרוטוקול שלנו עבור בידוד תא בודד יכול להיות מיושם לענות que אלה אחריםstions. עם זאת, הבחירה של שיטת הגברת הגנום כולו תלויה ביישום המסוים. השיטה המתוארת פרוטוקול זה, המתבסס על תגובת שרשרת פולימראז, הוא מתאים ביותר לאיתור שינויי מספר העותק כי היא מזוהה עם רמות נמוכות יותר של הטית הגברת 32. על חקירה וצורות אחרות של שינויי הגנומי, כגון פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד, שיטות אחרות של הגברת הגנום כולו הם האמינו להיות יותר מתאימים 31, 32.

שינויים במספר עותק דנ&quot;א יכול טווח בגודל מכמה זוגות בסיסים (מספר עותק וריאנטים) (CNVs) לכרומוזומים כולו (aneuploidy). שינויים במספר ההעתק המשפיעים אזורים גדולים של הגנום יכולים להיות השלכות פנוטיפי משמעותיות על ידי שינוי הביטוי של עד אלף גנים 1, 2. CNVs שנמצא בכל התאים של אוכלוסייה יכולה להיות מזוהה על ידי רצף בתפזורת או בשיטות מבוססות microarray 3, 4. עם זאת, אוכלוסיות גם יכולות להיות גנטי הטרוגנית, עם CNVs קיים קבוצת משנה של האוכלוסייה או אפילו תאים בודדים. מגוון גנטי שכיח סרטן, נהיגת התפתחות גידול, וגם נוכח ברקמות נורמליות, עם תוצאה לא ידועה 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. באופן מסורתי, מגוון גנטי הוערך באמצעות גישות ציטולוגיה או רצף בתפזורת. גישות ציטולוגיה, כגון קרינת כלאה באתרו (FISH), ממרחים כרומוזום, ואת karyotyping ספקטרלי (SKY), יש את היתרון של שינויים בזיהוי נוכחיים בתאים בודדים אבל יש שיעורי לטעות גבוהים עקב ממצאים של כלאה והפצת 11. גישות אלה מוגבלות גם מספר חושף ההעתק בלבד פתרונם משתנות פורשות כמה megabases. רצף או microarrays של DNA בתפזורת, אם כי גבוה דיוק ורזולוציה, הוא פחות רגיש. כדי לזהות מגוון גנטי על ידי גישות מבוססות אוכלוסייה, הגירסות חייבות להיות נוכחות חלק ניכר של תאים באוכלוסייה. הופעה של שיטות כדי להגביר את הדנ&quot;א הגנומי של תאים בודדים הפך אותו ניתן לרצף את הגנום של תאים בודדים. seque תא יחידיש ncing היתרונות של רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, וכאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, גבוה דיוק 12. כאן אנו מתארים שיטה לגילוי שינויים במספר עותק בקנה מידה megabase ב תאים בודדים. אנו לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות, להגביר הדנ&quot;א הגנומי באמצעות מתאם מקשר PCR, להכין ספריות עבור סידור הדור הבא, וכדי לזהות מספר עותק וריאנטים הן על ידי מודל מרקוב חבוי ופילוח בינארי מעגלית.

<table><tbody><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>PVC tubing (ID 3/16&quot;, OD 5/16&quot;, ~1 foot)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC tubing (ID 5/16&quot;, OD 7/16&quot;, ~6 inches)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 &amp;micro;m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Any plastic 5 mL pipette should suffice</td></tr><tr><td>In-Line Water Trap for Oxygen Use</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (150 mm diameter)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells</td></tr><tr><td>Hard-Shell&amp;nbsp;Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR&amp;nbsp;Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Any 96-well PCR plate should suffice</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Any 96-well tissue culture plate should suffice</td></tr><tr><td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;A&#039; Film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini plate spinner</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&amp;nbsp;</td><td>Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Any similar magnetic tube strip should suffice</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&amp;nbsp;</td><td>This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.</td></tr></tbody></table>

detection of copy number alterations using single cell sequencing

איתור של שינויים גנומיים ברזולוצית תא בודדת חשוב לאפיון מגוון גנטי ואבולוציה ברקמות נורמליות, סרטן, ואוכלוסיות מיקרוביאלי. שיטות מסורתיות להערכת הטרוגניות גנטית היו מוגבלות על ידי ברזולוציה נמוכה, רגישות נמוכה, ו / או סגולי נמוך. רצף תא יחיד התפתח ככלי רב עצמה לאיתור הטרוגניות גנטית עם רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, כאשר נותחו כראוי, סגולי גבוה. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הבידוד, הגברת הגנום כולו, רצף, וניתוח של תאים בודדים. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי האמין של וריאנטים מספר עותק megabase מידת תאים בודדים. עם זאת, היבטים של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמים גם לחקור סוגים אחרים של שינויים גנטיים בתאים יחידים.

Aspirator התאספו אמור להופיע דומה לזו באיור 1 א. המחט צריכה להיגרר כאלה שזה רחב מספיק כדי להכיל תא בודד אבל לא כל כך רחב כי נפח גדול נערך עם התא הבודד. Aspirating תאים בודדים היא הקלה כאשר יש בין אחת לחמש תאים בשדה 10X (איור 1B). אם הגברת הגנום כולו היא מוצלחת, המדגם יופיע ככתם על ג&#39;ל agarose (איור 2, מסלולי 1, 2, 4, 5, 6, ו -7). מבחין בכתם קלוש או נעדר מצביע על תגובת הגברה נכשלה ואת המדגם לא צריך להיות רצף (איור 2, נתיבי 3 ו -8). בעקבות הכנת ספרייה, חלוקת גודל שבר של הדגימות צריכה להיות מוערכת על ידי אלקטרופורזה נימים על נתח שבר.בהצלחת ספריות מוכנות תהיינה חלוקות למדי אפילו בגדלים שברים 150 כדי 900 נ&quot;ב (איור 3, A, B). נכשלתי כנת ספרייה תגרום התפלגות גודל שבר סוטה וספריות כזה לא צריכות להיות רצף (איור 3 ג). עיבוד הנתונים רצף באמצעות מודל מרקוב נסתר (HMMcopy) ופילוח בינארי עגול (DNAcopy) יהיה לנתח את הגנום של כל תא למקטעים של מספר עותק מוערך. מגזרים אלה לאחר מכן ניתן מסוננים לזהות את אלה עם מספר עותק מוערך בקנה אחד עם רווח או הפסד בתא בודד (טבלה 1). מגזרים מסוננים אלה מן HMMcopy ו DNAcopy יש חפיפה ואז לזהות CNVs ברמת ודאות גבוהה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> איור 1. בידוד תא יחיד. (<html> א) התאסף microaspirator. (B) מראה השדה 10X ניתק תאים (חיצים) ומחט microaspirator (בפינה הימנית התחתונה). Aspirating תאים בודדים הוא הקלה כאשר יש בין אחת לחמישה תאים בשדה 10X. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> איור 2. הגברת הגנום כולו. ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose של 5 μl של מוצרי הגברה הגנום כולו. דוגמאות כי בהצלחה להגביר יופיע לכתמים בהירים החל מיום 100 נ&quot;ב ל -1 kb (מסלולים 1, 2, 4, 5, 6, ו -7) והוא יכול להיות רצף. דוגמאות שאינו להגביר בהצלחה תפקנה מריחות קלושות או לא למרוח (נתיבים 3 ו -8) ואסור להיות רצף.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> איור 3. הכנת הספרייה. תוצאות נציגת מנתח שבר. הגרפים מראים גודל שבר (ב BP) על ציר X ו- יחידות הקרינה היחסית (RFU) על ציר Y. מימין כל גרף הוא שביל ג&#39;ל מדומה. (א) תוצאות עבור מדגם אידיאלי, עם חלוקה שווה בין 150 ל 900 נ&quot;ב וללא פסגות חדות או הטיה כלפי צד אחד. מדגם זה מקובל על רצף. תוצאות (B) מדגימה בסדר, עם התפלגות גודל מוטה כלפי בגדלים שבר נמוכים. אמנם זה לא אופטימלי, המדגם יכול עדיין להיות רצף. (ג) תוצאות ממדגם נכשל, עם גדלים שבר קטן בעיקרה. זו נגרמת ככל הנראה על ידי דגירה ממושכת במהלך שלב tagmentationהכנה הספרייה. מדגם זה לא אמור להיות רצף. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> לִטעוֹם </td><td> מִגזָר </td><td> Chr </td><td> הַתחָלָה </td><td> סוֹף </td><td> מדינה </td><td> חֲצִיוֹן </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144,500,001 </td><td> 146,500,000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67,000,001 </td><td> 134,500,000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> גhr19 </td><td> 1 </td><td> 20,000,000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chrY </td><td> 1 </td><td> 59,500,000 </td><td> 2 </td><td> -1.506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> לִטעוֹם </td><td> Chrom </td><td> התחל סל </td><td> סוף bin </td><td> הַתחָלָה </td><td> סוֹף </td><td> ממוצע Seg </td><td> med Seg </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62,612,945 </td><td> 129,971,511 </td><td> 1.4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28,416,392 </td><td> 1.4141 </td><td> .1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51,659,160 </td><td> 95,343,369 </td><td> 1.3548 </td><td> .1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrY </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23,805,358 </td><td> -2.7004 </td><td> .3591 </td></tr></tbody></table> ניתוח נתונים מהטבלה 1.. מגזרים מסוננים שנוצרו על ידי HMMcopy ו DNAcopy מתא בודד. חופפים שתי תוצאות אלו מגלה רווח על כרומוזום 10 מ 67 130 MB כמו גם רווח על כרומוזום 19 מן 0 כדי 20 MB. מצאנו כי רווחי על החלק הפרוקסימלי של כרומוזום 19 הם תוצר של רצף תא בודד 12.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

11.5K Views.  Massachusetts Institute of Technology.  רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים. 

Video: Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Cancer Research

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Behavior

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengineering

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Biology

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.