Name: visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish at JoVE.com

אנו מודים פרופ &#39;כריסטוף אנגלר ופרופ דידייה Stainier עבור gifting את Tg (wt1b: GFP) Li1 ו Tg (kdrl: EGFP) s843 זנים, בהתאמה, ואת מתקן Core דג הזברה טייוואן למתן Tg (kdrl: mCherry) ci5. מחקר זה נתמך על ידי מענקי משרד של טייוואן המדע והטכנולוגיה (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

משפט ואתיקה: כל הפרוצדורות על דג הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש Tunghai אוניברסיטת (אישור IRB NO 101-12.) ובוצע בהתאם להנחיות שאושרו. 1. פתרונות המניות עבור 3β-HSD אנזימתי פעילות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן-dehydroandrosterone טרנס [10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב sulfoxide דימתיל (DMSO)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מימה dinucleotide אדנין β-nicotinamide (1.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן nicotinamide (ויטמין B3, 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב H 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן tetrazolium כחול 4-ניטרו (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב dimethylformamide 70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot כל המרכיבים האלה לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מניסיוננו, חזרה הקפאה להפשרה של aliquots של כל הפתרונים הנ&quot;ל אינו משפיע על עוצמת 3β-HSD פעילות מכתימה. </li></ol> 2. Wחור-הר 3β-HSD פעילות מכתים הערה: 3β-HSD הפעילות האנזימטית ניתן לזהות עוברי דג הזברה מוקדם ככל 28 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כאשר בתרבית על 28.5 מעלות צלזיוס, אשר עולה בקנה אחד עם תחילת ביטוי mRNA של hsd3b1 2,7. פרוטוקול מכתים פעילות כל הר 3β-HSD במחקר זה מבוסס על שיטה שתואר לעיל 8 והיה נחוש להצליח דג הזברה פיתוח עד 7 ימים לאחר ההפריה 9. לניתוח במיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה steroidogenic interrenal, כל הר מכתים פעילות 3β-HSD יש להחיל קווי מהונדס המבטא הקרינה ספציפי האנדותל, כגון Tg (kdrl: EGFP) s843 14 ו Tg (kdrl: mCherry) ci5 15 . כדי לנתח את רקמת steroidogenic interrenal שוקלת את המשך הפיתוח כליות דג הזברה, 3β-HSD פעילות מכתים יכול להיות appliעורך אל Tg (wt1b: GFP) Li1 דגים 16, שבו היווצרות של tubules glomerulus ו pronephric מותווה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את דג הזברה פיתוח על ידי דוגרים להם 0.03% phenylthiourea במים ביצה (מלח 0.06 מ&quot;ג / L שונית במים deionized), החל משלב בין 12 ל 24 hpf, לעכב היווצרות פיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן עוברים dechorionated או זחלים ב (א) 4% paraformaldehyde (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 0.1% Tween 20 (PFAT) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT) או (ב) 2% PFAT לילה בשעה 4 ° C או עבור שעה 2 ב 4 ° C, ואחריו 4 שעות ב RT. זהירות: PFA הוא רעיל על ידי שאיפה ידי מגע עם העור. זה הרסני לעור, ריריות, עיניים, ודרכי הנשימה העליונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 4x עוברים במשך 10 דקות עם PBS בתוספת 0.1% Tween 20 (PBST) ב RT. הערה: זה קריטי כדי לא לייבש את הדגימות תוך שינוי פתרונות הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין את staפתרון ining לפני התגובות (טבלה 1). כן, מערבולת, וחלקי צנטריפוגות A ו- B ב צינורות נפרדים. הערה: הוספת כל המרכיבים ישר לתוך צינור אחד תגרום משקעים קשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הפתרון השלם של חלק לפתרון השלם של חלק ב &#39;, ומערבב היטב כדי להכין את הפתרון המכתים, ומייד להפיץ 1 מיליליטר לתוך צינור אחד microfuge המכיל עוברים קבועים ורחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלישת צינורות microfuge עם רדיד אלומיניום על מנת להגן עליהם מפני האור והמקום משני הכתף או פלטפורמת נדנדה עבור רעד עדין ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אמפירי לקבוע את זמן התגובה על ידי ניטור אותות chromogenic באמצעות מיקרוסקופיה. משקעים קלים יפתחו לאורך זמן; עם זאת, הם לא יפריעו לתהליך התגובה. הערה: לקבלת עוברים קבועים ב 28 hpf, מכתים ב 25 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות מייצרת איתות ברורה על רקמות interrenal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי שטיפת 4x במשך 10 דקות ב PBST. אניf לא immunohistochemical נוסף (IHC) ניתוח נדרש, שלאחר לתקן את העוברים מוכתם 4% PFAT במשך 60 דקות ב RT. אחרת, לאחסן את העוברים לכבס ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיקרוסקופיה כל ההר, נקה את המוכתם, שלאחר קבוע, ורחץ עובר עם גליצרול 50% ב- PBS, כוון אותם עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה בשקופית, ולבחון באמצעות מיקרוסקופ זקוף תחת תאורה בשדה בהירה. הערה: כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה רקמות interrenal, שטוח הר ניתוח 3β-HSD פעילות מוכתמת עובר deyolked מומלץ. כמו רקמת steroidogenic interrenal ממוצבת ממש מעל שק החלמון, ניתוח שטוח הר הגחון של הרקמה interrenal מאפשר תצפית ישירה וברורה של מורפולוגיה interrenal 17. </li></ol> 3. ניתוח IHC של עוברי פעילות מוכתמת 3β-HSD הערה: לקבלת ניתוח המיקרו-סביבה של כלי הדם של steroiרקמת dogenic, העוברים מוכתם פעילות 3β-HSD עם כתב ניאון האנדותל ספציפי מהונדס חשופים רוחביים חתך vibratome וניתוח IHC עוקב 12,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את 3β-HSD פעילות מוכתם ורחץ עוברים עם 2% PFA בתוספת 1% Triton X-100 עבור שעה 1 ב 4 ° C ולשטוף 4x במשך 10 דקות ב PBS המכיל 1% Triton X-100 (PBSTx) ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Embedding <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% נמוך ההיתוך agarose על ידי המסת agarose ב PBS על 95 מעלות צלזיוס, aliquot לתוך צינורות microfuge, ולאחסן ב 4-8 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים aliquot של 4%-התכה נמוכה agarose ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשמור את aliquot ב -47 ° C. הטמע את כל העובר ב מותכת 4% נמוך ההיתוך agarose בכובע פרטי או צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge אשר משמש עובש, להתקרר עד מוצק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד חתיכת סרט נייר p היבשlatform של vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק agarose קשה מרוב עובש על ידי סכין גילוח. החל דבק מגע לקלטת נייר על הרציף, ולתקן לחסום agarose על גבי קלטת נייר, עם הצד הקדמי של המדגם פונה כלפי מעלה. חתוך את הבלוק agarose לצורה פריזמה טרפז, עם כ 4 מ&quot;מ ו 8 מ&quot;מ בכל צד של היבטים העליונים והתחתונים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הבלוק agarose המכילים מדגם עם קר PBS השלימו עם 0.5% Triton X-100 (0.5% PBSTx) באמצעות טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את גוש agarose לתוך 100 מיקרומטר חלקים לפי במדריך ההוראות של vibratome. כל הזמן לשטוף את הבלוק agarose כדי למנוע התייבשות. כמו כל פרוסה חותכת, להסיר אותו vibratome באמצעות מחט מזרק 26 G, ולהעביר לצלחת מקום המכילה קר 0.5% PBSTx (500 μl / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הפעילות החיובית HSD-3β סעיפי רקמה ידי סימון תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ולהעביר את הסעיפים ידי pipette טיפ עם חתך סופו (כ 1 מ&quot;מ קוטר פנימי בפתיחה) לתוך צלחת 96-היטב המכילה קר 0.5% PBSTx (150 μl / טוב). דגימות הרקמה בדרך כלל לנתק מגוש agarose לאחר שלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization ו כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 15 דקות ב 0.5% PBSTx ב RT, 10 דקות ב PBS, 4x במשך 10 דקות ב PBS השלימו עם DMSO אלבומין 1% שור / 1% / 0.1% Triton X-100 (PBDTx). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה עבור נסיוב עגל 1 hr ב 2% עובריים (FCS) ב PBDTx ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה ראשית נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה עבור 1.5 ימי PBDTx המכילים נוגדן ראשוני (למשל, פיברונקטין אנטי אנושי polyclonal הארנב קינאז הדבקה מוקדים אנטי אנושי עכבר) ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כְּבָסִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה במשך שעה 1 ב 2% FCS ב PBDTX ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות עבור 1.5 ימים PBDTx המכיל נוגדנים משני (ארנב נגד עז מצומדות fluorophore או IgG אנטי עכבר) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כְּבָסִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT ו 4x במשך 10 דקות ב PBST ב RT. הערה: לקבלת ניתוח מיקרוסקופי confocal, נקה את דגימות עם גליצרול 50% ב- PBS. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב העובר ההר השלם והסעיף ידי מיקרוסקופ confocal מצויד 10X / 0.5 ו 20X / 0.75 עדשה אובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהוי סימולטני של הקרינה ואת מכתים 3β-HSD, להגדיר את מצב multitrack כדלקמן: לייזר ארגון 488 ננומטר 505-530 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי של GFP; 543 לייזר הליום-נאון ננומטר מסנן bandpass 560-615 ננומטר לצורך זיהוי של mCherry; ומשודר ערוץ אור לצורך זיהוי של מכתים 3β-HSD.גודל החריר הוא 1 יחידת איירי, וההחלטה היא 1,024 x 1,024 פיקסלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את ערימות z (עם 6 מרווח מיקרומטר) כהשלכת 3D, ולמזג את ההקרנה ואת השדה הבהיר, באמצעות תוכנה המובנית confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li><li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development.">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li><li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model.">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li><li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome:+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes.">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li><li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells.">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551 (1992).</li><li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta5-delta4+isomerase+gene+family.">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li><li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function,+expression,+and+evolution.">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li><li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts:+morphology,+histology,+and+immunohistochemistry.">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium.">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo.">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997 (2014).</li><li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development.">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis.">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li><li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to declare.

עוצמת האות של פעילות 3β-HSD וגובר במהלך ריאקציה. אותות ברורים של פעילות 3β-HSD אותרו לאחר 4 שעות של התגובה לשלבים מ -28 hpf ואילך. עם זאת, משך התגובה דורש נחישות אמפירית, בהתאם לצורך של assay. במקרים בהם מכתים דורש עיבוד לילה, רקע כחלחל מעט נוטה להתפתח על דגימות. ניתן להתגבר על בעי?...

<html> בלוטת יותרת הכליה, מרכיב חיוני של ציר hypothalamo-היפופיזה-אדרנל, מפריש סטרואידים ומתאם הומאוסטזיס סטרואידים ואת התגובה הגופנית ללחץ. בלוטת יותרת הכליה כולל הקורטקס החיצוני, אשר מפריש סטרואידים באופן אזור ספציפי, ומדולה פנימית, אשר מסנתז קטכולאמינים. בלוטת interrenal ב teleosts היא העמית של בלוטת יותרת הכליה ביונקים והוא מורכב של תאי interrenal ו chromaffin steroidogenic, שהן ושווי תפקודי של קליפת יותרת הכליה ומדולה, בהתאמה 1-3. מחקרים שנערכו תוך יישום מודל דג הזברה דיווחו כי הן שושלות תאים steroidogenic ו chromaffin נוצרות על ידי מנגנונים מולקולריים ותאיים מאוד דומים לאלה ביונקים 1,2. לכן, דג הזברה הוא מודל רב עצמה פוטנציאלית ללימוד הפרעות גנטיות, בקרת נוירואנדוקריניים, וביולוגית מערכות של hypothalamo-היפופיזה-אדרנל הציר (interrenal). s = &quot;jove_content&quot;&gt; בבלוטת יותרת הכליה, 3β-HSD מזרז את ההמרה של פרוגסטרון מ פרגננולון, 17α-hydroxyprogesterone מ 17α-hydroxypregnelolone, ו אנדרוסטנדיון מ dehydroepiandrosterone 4,5. 3β-HSD חיונית biosynthesizing כל המעמדות של סטרואידים הורמונלית, כלומר פרוגסטרון, גלוקוקורטיקואידים, מינרלוקורטיקואידים, אנדרוגנים, אסטרוגנים. שני-HSD 3β האדם isozymes HSD3B1 ו HSD3B2 מבוטא 6 דיפרנציאלי. HSD3B1 מתבטא השליה ורקמות פריפריה, כאשר HSD3B2 מתבטא בקליפת והאשכים הכליה. האדם HSD3B1 ו HSD3B2 הוא-orthologs שיתוף של hsd3b1 דג הזברה, אשר באו לידי ביטוי על רקמות interrenal ואשכים מבוגרים; hsd3b2 דג הזברה הוא גן אימהי הביע שאת התמלילים להיעלם לפני organogenesis 7. הפרוטוקול של assay הפעילות האנזימטית כל הר 3β-HSD עבור דג זברה פותח על ידי שינוי השיטה של ​​לוי,שעות שתואר על ידי Milano et al. , על חלקים קפואים של שמונה בעלי חוליות 8. בגלל חדירות רקמות שקיפות אופטית של דג הזברה פיתוח, כל הר 3β-HSD היסטוכימיה יכול לשמש בהצלחה העובר הזחלים דג הזברה קבוע ובאופן ספציפי להתוות הרקמות interrenal מובחן. assay הרגיש ומהיר זו יושם כדי מוטנטים morphants שבאו להפגין סוגים שונים של dysmorphogenesis interrenal. פעילות interrenal 3β-HSD תיאור בעובר שבו מפרט של רקמת interrenal מופר באמצעות מציאה ספציפית של גורם שעתוק Ff1b והוא ירד כמו הבידול interrenal מושפע מציאה של coregulator Ff1b Prox1 9,10. יש לציין, כי פעילות 3β-HSD ניתן לאתר מוטציות עם מומים בשלב מוקדם חמורים, כגון ראש סיכת שתום עין לפזול, שבו 3β-Hsd היסטוכימיה מתווה כיצד נדידת תאי interrenal מושפעת 11. הבידול של רקמת interrenal לא נפגע גם בהיעדר המוחלט של דם בכלי דם. לכן, איך אותות שמקורם האנדותל לעצב את איבר interrenal בפיתוח ניתן לקבוע 12,13. בסך הכל, assay histochemical זה שימש בהצלחה ללימוד מפרט, בידול, והגירה של תאים steroidogenic במודל דג הזברה. לכן, זה צריך להיות יעיל כלי אמין עבור כל מסך גנטי או כימי מיקוד הפרעות איבר האדרנל interrenal.

<table><tbody><tr><td>Confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td>LSM510&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>USB</td><td>US16374</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Calf Serum&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td><td>Sigma</td><td>N1636</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium</td><td>Promega</td><td>S380C</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100Tab</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Reef Salt</td><td>AZOO</td><td>AZ28001</td><td></td></tr><tr><td>trans-Dehydroandrosterone</td><td>Sigma</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000M</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

כדי לקבוע כיצד codevelops רקמות interrenal steroidogenic עם glomerulus כליות pronephric ואת כלי הדם המתהווה שלה, assay הפעילות האנזימטית 3β-HSD בוצע על כפול מהונדס Tg (wt1b: GFP) Li1; Tg (kdrl: mCherry) העובר ci5 ב 34 hpf (איור 1). בשלב זה, רקמת steroidogenic הפעילות חיובית 3β-HSD מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish at JoVE.com

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח.

לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K Views.  Tunghai University.  בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח. 

Video: Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Chemistry

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Cancer Research

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Biology

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Medicine

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...