Name: a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila at JoVE.com

K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. איסוף ביצים מפני זבובים עם גנוטיפים של ריבית הערה: צלבים אידיאליים המורכבים של 150 זבובי בתולה ולפחות 75 גברים. אוספי צילומים צריכים להיות מורכבים של 200 זבובים לפחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות ענבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגר 37.5 גרם ל -1.5 מים מזוקקים L בבקבוק 4 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים / אגר חיטוי לערבב למשך 50 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (250 פרנהייט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מים / לערבב אגר הוא מעוקר, להוסיף סוכרוז 50 גרם מיץ ענבים 500 מ&quot;ל ומערבבים עם בר ומערבבים בצלחת ומערבבים מחומם עד להמסה סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכבים את האש וממשיכים לבחוש כדי לקרר את התערובת מיץ ענבים / סוכרוז אל מתחת ל -70 מעלות צלזיוס. בדוק את הטמפרטורה הפנימית עם מדחום אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 גרם תסיסנית סוכן אנטי פטרייתי (למשל, Tegosept) לחמם מיץ ענבים / תערובת סוכרוז ומערבבים לפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מים / תערובת אגרה הוא מתוך החיטוי, לאפשר את הבקבוק כדי לקרר למגע ידי מתערבל מדי פעם. </li><li&gt; שלב מים / תערובת אגר מיץ ענבים / תערובת סוכרוז ומערבבים עד גם מעורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה סרולוגיות להוסיף 8 - 10 מ&quot;ל של תערובת הענבים את המכסה של צלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ&quot;מ בסגנון). אפשר התערובת להכתיר גבוהה יותר מאשר גובה הקירות המכסים כדי ליצור צורה קמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צלחות ענבים להתקרר במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן בכלי אטום על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להדביק שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל פתרון חיץ פוספט (PBS) ל -4 שמרים יבשים פעילים חי g בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל חרוטי ומערבבים במרית עד שהתערובת חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים חנות ולהדביק ב 4 ºC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מנה קטנה (כ 1/8 כפית) של רסק שמרים לאמצע צלחת ענבים. להחליק כל קצוות גסים עם מרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחות ענבים באינקובטור עד שהם הגיעו לטמפרטורת הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר זבובי עניין לתוך צלחת ענבי תא מורכב ביצה ומניח wלהדביק שמרים ה- i מול פנימה על גבי. צלחת ענבי סרט לתא אוסף ביצה כדי להימנע מהמצב שבו הצליח לנשור. הקפד לכתוב מידע גנוטיפ ותאריך חשוב על החלק התחתון של צלחת ענבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעמיד על הקצה את תא אוסף ביצה לאפשר הזבובים להטיל ביצים על צלחת ענבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קופסה או לכסות על תאי אוסף ביצה ומניחים אותם באינקובטור ב 25 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 4 - 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של אוסף ידי לקיחת צלחת ענבים מתוך החדר אוסף ביצה והעברת הזבובים בחזרה לתוך בקבוק מזונם. השתמש מרית לנגב את רסק שמרים עודף מהצלחת הענבים. צלחת ענבי חנות בצלחת פטרי גדולה בתוך חממת humidified ב 25 ºC עבור ~ 24 שעות. </li></ol> העברת 2. זחלי מזון הניסיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין אוכל ניסיוני. הערה: מתכון אוכל זה מבוסס על מתכון מרכז מניות Bloomington 18. שינויים חשוביםכוללים העלאת כמות השמרים כדי לייעל את הערך התזונתי של המזון לפי הערכת עיתוי של נדודי במה (בין 112 - 120 שעות לאחר איסוף הביצים ב 25 ºC). בעוד שמצאנו המתכון הזה אידיאלי עבור הבריאות וההתפתחות של זחלי הניסוי שלנו, כל מתכון אוכל כיול נתון מקובל עם בקרות חיוביות ושליליות, דוגמאות של ורשומי צעד 3.10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 1,600 מ&quot;ל מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 134 גרם קמח תירס, 10.6 גרם תסיסנית אגר Type II, ואת חלק מהמים (~ 500 מ&quot;ל) בכוס L 1. ערבבו 2 דקות עם מערבל יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 70 גרם שמרים יבשים פעילים חי, 18.4 גרם קמח סויה, 84.8 גרם תמצית מאלט, וחלק מהמים (~ 500 מ&quot;ל) ב 1 אחר כוס L. ערבבו 2 דקות עם מערבל יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל כוס ויוצקים לתוך בקבוק 4 L. השתמש שאריות מים כדי לשטוף את הכוסות ולהוסיף לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד סירופ תירס בהיר 140 מ&quot;ל ולהוסיף את הבקבוק, ומערבבים על ידי מתערבל. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי במשך 50 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (250 פרנהייט) בסביבה הנוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר, לשפוך מזון לתוך מבחנה 4 L להתקרר. עזרה בתהליך הקירור על ידי מיזוג עם מיקסר יד ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבקבוק מתקרר מספיק לגעת, להוסיף 8.8 מ&quot;ל חומצה propionic ו -16.8 מ&quot;ל תסיסנית אנטי פטרייתי פתרון סוכן / אתנול. לערבב היטב. (בצע פתרון סוכן אנטי פטרייתי תסיסנית על ידי הוספת 380 גרם תסיסנית אנטי פטרייתי סוכן עד 1 L 200 אתנול הוכחה ערבוב על צלחת חמה עד שהיא נמסה, מוודא הפתרון אינו עולה על 70 מעלות צלזיוס.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מזון לתוך צלוחיות עד שהאוכל הוא כ 1 ס&quot;מ עמוק להתקרר ב RT במשך 2 - 3 שעות. חבר צלוחיות בחנות באינקובטור ב 25 ºC. השתמשו בהם במשך השבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול מרית מספר פעמים לתוך השכבה העליונה של בקבוקון מזון להבקיע אותו. זה יעזור הזחלים להתחפר ולהאכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22 - 24 שעות לאחר איסוף ביצים ישהסתיים, להשתמש במכחול קטן כדי לאסוף 50 instar הראשונים (L1) זחלים באותו הגודל למידע. מניח זחלים במזון הניסיוני. נקה את המכחול על מעבדה לנגב ולהבטיח שאין זחלים הנותרים על המכחול לפני שאתה ממשיך גנוטיפ אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקבוקון של הזחלים באינקובטור ב 25 ºC ולאפשר לפתח. </li></ol> 3. לקבוע רמות שומן זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 L 10x מניית PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, ו -2.4 גרם KH 2 PO 4 כדי 800 מ&quot;ל מים בכוס L 2 המכיל בר ומערבבים. מערבבים ללא חום עד שכל המלחים משולבים. תביא pH ל -7.4. הגבר את עוצמת 1 ליטר עם מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 L 1x PBS. הוספת 200 מ&quot;ל פתרון 10x PBS המניות 1,800 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במלאי זה של 1x PBS לעשות 20% w / v סוכרוז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבקבוקון של זחלים מןחממה אחת יש 20 - 40 זחלים פסעו במעלה הצדדים של הבקבוקון (בדרך כלל ביום החמישי לאחר אוספי ביצה). רשמו את התאריך והשעה של assay, כמו גם את מספר נודד הזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ניסיוני על ידי הוספת 11.5 מ&quot;ל PBS ו -9 מ&quot;ל סוכרוז 20% צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20% סוכרוז הבקבוקון עד 0.5 - 1 ס&quot;מ מהחלק העליון של המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית לעורר את השכבה העליונה בעדינות מזון הזחלים בחינם שעדיין מתחפרים האוכל. כל הזחלים יעלו אל פני השטח של הפתרון סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את הזחלים בעדינים לתוך ריכוז סוכרוז הראשוני משלבים 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במרית לעורר הזחלים בעדינות בפתרון זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי או צינור חרוטי להעמיד על הקצה כמה פעמים כדי לערבב הפתרון ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uncap צינור החרוטים ו מערבולת ליצור מערבולת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הזחלים להתיישב, או צף העליון של פתרון או סיnking לתחתית. חכה 2 - 5 דקות עבור הזחלים להתיישב. הערה: אם יש עדיין זחלים שאינם בהחלט גם צפו או שוקע, להרים קו להשתמש כנקודת חיתוך לתייג את הזחלים כמילת מצוף או משקולת. החל אותה אמת מידה זו לכל גנוטיפים. אנו משתמשים הזווית בתחתית צינור החרוטים כמו זחלים שלנו 17 מוטצית גבול. ADP או Sir2 ניתן להשתמש כביקורת חיובית lsd2 19 מוטציות עשויות לשמש כביקורת שלילית לכיול של assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הזחלים צף ואת ריכוז מסוים נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סוכרוז 20% לפתרון ניסיוני להגדיל צפיפות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7 כדי 3.10. רשום את מספר זחלים צפו והריכוז החדש הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הצעדים 3.12 ו 3.13 עד לפחות 95% של הזחלים הם צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לאסוף את כל הזחלים לתוך צלחת לנתיחה מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> obsזחלי erve תחת מיקרוסקופ הערה אם יש זחלים קטנים,-גלמים מראש, גלמים, או הבדלים אחרים בין גנוטיפים. הערה: באופן אידיאלי, כל הזחלים אמורים להופיע הומוגנית ובאותו השלב ההתפתחותי. ראינו רק מדידות שומן עקביות בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר הזחלים הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להעביר 10 זחלים למעבדה לנגב להתייבש. לייבל צינור microcentrifuge ומניח 10 זחלים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את הזחלים בחנקן נוזלי. אחסן את הצינור ב -20 ºC. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development.">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li><li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics.">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li><li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+genetic+screens,+and+cardiac+function.">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li><li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila.">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li><li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+body,+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates:+the+nexus.">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71 (2014).</li><li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+transport+proteins+in+disease:+New+insights+from+invertebrate+models.">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li><li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., K&#252;hnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay.">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796 (2011).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li><li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila.">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353 (2010).</li><li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry.">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li><li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS.">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li><li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry:+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics.">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li><li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments,+insulin+resistance+and+dyslipidaemia.">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li><li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers.">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li><li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat.">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li><li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability.">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206 (2010).</li><li>Teixeira, L., Rabouille, C., R&#248;rth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Perilipin/ADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism.">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ישנם מספר רב של טכניקות אשר פותחו כדי למדוד את רמות השומנים 8 - 10. עם זאת, כל אחת משיטות אלה מגיעה עם כמה חסרונות עיקריים שמטופלות על ידי assay מבוססי הציפה שתוארו לעיל. ראשית, assay זה הוא מהיר מאוד. בדיקת מפל ריכוזים מלא לוקחת לא יותר מ 30 - 60 דקות. זהו שיפור עצום על רוב הטכניקות הנמצאות בשימוש כיום. לדוגמה, quantitation השומנים ידי MS לוקח 7 - 9 שעות לבודד את השומנים ועוד כמה שעות לנתח אותם. זוהי הרתעה חזקה בעת ביצוע מסך על מספר רב של בעלי חיים. באמצעות מדידת פנוטיפ ציפה מהירה, אפשר להתמקד במהירות על גנוטיפים שיש להם את הפנוטיפ של עניין. שנית, assay הצפיפות דורש ריאגנטים משותפים יחיד כגון מלחים (עבור PBS) וסוכרוז. זה עושה את זה הרבה יותר קל וזול להקרין מספר רב של זחלים או במהירות לבדוק בגנוטיפ מעניין. לבסוף, אני בפרוטוקול זהזה לא פולשנית ואת הזחלים הם עדיין בחיים בסוף. זה מאפשר ניסויים נוספים שיבוצעו על החיות כגון quantitation שומנים ספציפי או תעתיק או ניתוח חלבון. בנוסף, זחלים התאוששו יורשו להמשיך מגדילה לבגרות. יתרון נוסף של שיטה זו על פני אחרים הוא גדל רגיש לשינויים קטנים ברמות שומן אוכלוסייה. על ידי ביצוע מפל ריכוזים כולו על אוכלוסייה של 50 זחלים, משמרות קלה ברמות שומן האוכלוסייה יזוהו על ידי שינוי ריכוזי ביניים, למרות הריכוז שבו הזחלים להתחיל צף והם ריחפו לגמרי לא יכול להיות שונה יותר שולטת . תזוזה קטנה זו באוכלוסייה לא יכול להיות מזוהה תמיד בשיטות quantitation שומן אחרים כפי שהם דורשים קבוצה גדולה של הזחלים לנתח. את assay הצפיפות ומצד שני חוקר יחידים בתוך האוכלוסייה וכתוצאה מכך יכול לזהות הESE שינויים או משמרות קטנים בחלוקת האוכלוסייה הכללית. כמו טכניקה זו מסתמכת על צפיפות של הפתרון לייצר תוצאות אמינות, חשוב מאוד כי PBS ופתרונות סוכרוז נעשים באופן עקבי. מצאנו כי מתכונים שונים PBS לייצר הבדלים בצפיפות פתרון, מה שהוביל לתוצאות שונות. אנו משתמשים המתכון שתואר לעיל עבור תוצאות עקביות. יתר על כן, מה שהופך את סוכרוז 20% מאותה אצווה של PBS 1x חשוב מפני שהוא גורם באותה צפיפות פתרון רקע. אם שני הפתרונים נעשו בנפרד, שינויים קלים בצפיפות PBS יכולים להביא משתנה צפיפות נוספת מעבר התוספת של סוכרוז בקבוקון חרוטי ניסיוני. לבסוף, אידוי יכולה להיות בעיה, כי לאורך זמן הפתרונות וריכוזה יותר עם התאדות המים. לכן חשוב כובע הבקבוקים בחוזקה לסדר את הפתרון כל שבוע כך הניסיוןפתרונות להישאר עקביים. בין הצעדים המפורטים לעיל, ישנם מספר צעדים קריטיים שאם שינה, עלול לגרום תוצאות לא מדויקות על ידי assay הציפה. ראשית, חשוב כי הזחלים מועברים לתוך בקבוקון המזון הניסיוני להיות בנים אותו הגיל. העברת זחלים כי משתנים בגודלם תגרום זחלים בשלבי התפתחותיים שונים בעת assay הציפה מתבצעת. פרוטוקול זה פותח כדי לקבוע שינויים ברמות שומן נדודי זחלי L3 ולא יעבוד במדויק עבור L3 מוקדם או-גלמים מראש או מאוחר יותר. יש זחלי instar שלישיים מוקדם נטייה לצוף עצמאי של רמות שומן תוך-גלמים מראש וכיור גלמים אפילו הריכוזים הגבוהים ביותר בשימוש. מסיבה זו, בעידן של זחלי L1 עבירה הוא קריטי. בדומה לכך, הנקודה שבה הבקבוקון נלקח לבצע את assay הציפה חשובה. מהטעמים התפתחותי העיתוי אותה כאמור לעיל, צלוחיות צריך לקחת רק כאשר 20 -40 זחלים נודדים על מנת להבטיח מדידות צפיפות מדויקות. בנוסף, מספר L1 הועבר יכול להשפיע על התוצאות, כמו גם. הצלוחיות הרחבות בשימוש בפרוטוקול זה לאפשר 50 זחלים לאכול ללא תחרות במהלך פיתוח. מספר גדול בהרבה של זחלים מועבר מזה יגרום תחרות למזון עשוי להשפיע על כמות השומן מאוחסנת עצמאית של גנוטיפ. ייתכנו גנוטיפים עם רמות שומן כזה גבוהים מאוד כי רוב או כל הזחלים יצופו בריכוז הראשון. במקרה זה, הפרוטוקול ניתן לשנות על ידי הפחתת הריכוז של הפתרון מתחיל על מנת לקבל ספקטרום מלא של התפלגות צפיפות אוכלוסייה. מנגד, גנוטיפ ספציפי יכול להיות כל כך רזה כי אין זחל שצף סוכרוז הראשוני. במקרה זה, את השלבים הראשוניים עשויים להיות מושמטים וריכוז מוצא גבוה בשימוש. assay זה הוא מאוד גמיש ויכול להיות שונה עדיף להתאים למגוון רחב של רמות שומן.אנו ממליצים על השימוש שולט כגון חיות סוג הבר מתאימות (נשלטו על רקע גנטי), בקרות חיוביות (מוטציות שומן הוקם, כגון ADP או Sir2 17), בקרות שליליות (מוטציות רזה שפורסמו כגון lsd2 19). שימוש נאות של פרוטוקול זה יאפשר הקרנת עתיד של אוספים לקבוע רגולטורים חדשים של חילוף חומרים ובעלי נטייה להשמנה. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק דרך קלה עבור חוקרים בכל תחום לבחון האם המניפולציה של עניין הגנטית שלהם גורמת לשינוי רמות שומן, ללא צורך פרוטוקולים מורכבים או ציוד יקר. פרוטוקול זה יעזור להבהיר את מערכת היחסים המורכבת בין גנטיקה להשמנה.

תסיסנית שימש במשך יותר ממאה שנה בחקר הגנטיקה שאלות ביולוגיות בסיסיות אחרות. בעשורים האחרונים, זה הפך להיות ברור כי תסיסנית הוא כלי רב עוצמה בחקר מחלות אנושיות רבות. כמו 70 - 80% של גנים הקשורים למחלות בבני אדם יש ortholog זבוב מזוהה 1 - 4, תסיסנית מספקת מערכת לתרגום פשוט עדיין שבה כדי לחקור מחלות מורכבות. מטבוליזם בפרט הרוויח ממחקר כזה. לא רק הגנטיקה של מטבוליזם נשמרת היטב בין זבובים ובני אדם, אך האורגנים הרלבנטיים סוגי תאים הם גם מאוד דומים 2,5. לדוגמא, את השומן בגוף של חנויות הזבוב הוא triacylglycerides (TAG) וגליקוגן, פונקציות דומות לאלה שבוצעו בכבד יונקי שומן לבן רקמות 6. שימוש תסיסנית כמודל שמנת אדם בהרבה השתפר הבנתנו השומניםחילוף החומרים ואת הגנטיקה של ההשמנה 7. בשלב הזחל של פיתוח שימושי במיוחד ללימוד הפרדה של חומרים מזינים אחסון או ניצול כפי שהוא מוקדש אכילה לבין האחסון של אנרגיה כדי לשמש במהלך pupariation. נכון לעכשיו, יש הרבה שיטות כמותיות שונות של קביעת רמות אחסון שומן תסיסנית. השיטה הנפוצה ביותר היא assay colorimetric המצמיד (CCA) 8,9. CCA פותח לקביעת רמות TAG בסרום אדם ופועל על ההנחה כי גליצרול ששוחרר עמוד השדרה של טריגליצרידים יעברו כמה תגובות, בסופו של דבר וכתוצאה מכך תגובת חיזור מצמידי יצירת מוצר בצבע. ספיגה של אורכי גל מסוימים של אור נמדדה אז כדי לקבוע את הסכום הראשוני של הווה גליצרול. עם זאת, גליצרול יכול להיות משוחרר גם ובי-diacylglycerides בנוסף TAG ולכן לא יכול להיות מדד מדויק של יםtored השומן בגוף 9. יתר על כן, פיגמנט עין של זבובים בוגרים כתושים יכול להפריע כמה קריאות ספיגות ומסבכי תוצאות 9,10. לכן, CCA חייב להיות מלווה ומאומתים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC), המאפשר הפרדה של רוב המשפחות השומנים שניתן ונרשמת על ידי צפיפות 10,11. עם זאת, כמה שיעורי שומנים כמו סטרולים לא ניתן לנתח וצריכים לכמת בצורה שונה 12. ספקטרומטריית מסה (MS) היא דרך מדויקת לכמת את כל סוגי ליפידים סלולריים גדולים 12,13. עם זאת, הליכי שומני החילוץ צורכים לנתח ידי MS הם גם זמן רב (רוב הלקיחה כמעט יום שלם) ויקר. כאן אנו מציגים שיטה חלופית במהירות ובזול לקבוע רמות שומן האורגניזם ב זחלי L3 של תסיסנית. השיטה המוצגת להלן מנצלת את ההבדל בצפיפות בין רקמת שומן ורקמה רזה. fa יונקיםיש t רקמות בצפיפות של כ 0.9 גר &#39;/ מ&quot;ל 14 תוך שרירי השלד כמו צפיפות של 1.06 גרם / מ&quot;ל 15. הבדל זה הוא שבעלי חיים עם חנויות גבוהות יותר של שומן יהיו צפיפות נמוכה יותר מחיות עם חנויות נמוכות יותר של שומן, אשר תאפשרנה להם לצוף טוב יותר בתמיסה של צפיפות קבועה. מאפיין זה מאפשר הקרנה מהירה מאוד של מספר רב של בעלי חיים בעת היותו גם זול ולא פולשנית. ניתוח מבוסס חוק ארכימדס נעשה שימוש הוא כדי לאשר את פנוטיפים של שינוי רגולטורים ידועים של רמות שומן, כמו גם לזהות רגולטורים גנטיים הנוירולוגי חדשים של השמנה 16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch&#039;s Original 100% Grape Juice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Baker&#039;s yeast</td><td>Fleichmann&#039;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Corn Meal</td><td>Quaker</td><td></td><td>Enriched degerminated</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour</td><td>ADM Specialty Ingredients</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate anhydrous</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm petri plate</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

איור 1 מייצג דוגמא כיצד assay מבוסס הציפה יכול לזהות הן ממאגרי השומן גבוהים ונמוכים זחלי מניפולציות גנטיות. איור 1A מראה כי עירור או השתקה של קבוצת משנה מסוימת של נוירונים (E347) במוח זחל הגורם נמוך וגבוה שומן חנויות בהתאמה. שליטת הרקע הגנטית הזהה שמשה בשני המקרים. איור 1B מספק דוגמא לאופן פנוטיפ זה שהשיג assay הצפיפות מקבל תימוכי מיצוי שומנים ניטראליים וכימות ידי GCMS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54744/54744fig1.jpg" /> פונקציה באיור 1. העצבית באזורים ספציפיים של המוח הזחל הוא הכרחי ומספיק תקנה השומן בגוף. פעילות עצבית בקו E347-GAL4 המצוין הושתקה על ידי ביטוי יתר של שי DNאו מופעל על ידי ביטוי יתר של NB, כמצוין הפאנלים, והשפעות על השומן בגוף הוערכו. (א) אחוז צף הזחלים בשיווי משקל בפתרונות צפיפות שונה. חמישים זחלים נבדקו לכל לשכפל ביולוגי, n = 7 - 9 ביולוגים משכפל לכל גנוטיפ (B) אחוזי שומן (ליפידים ניטראלי סך כולל triacylglycerides פוספוליפידים מחולק לפי משקל גוף), כפי שהיא נמדדת על ידי GCMS 17,20 (n = 8).. קווים או סורגים כחולים מייצגים GAL4-בלבד (ללא כטב&quot;מ) חיות חצו כדי w 1118 כדי לשלוט על השפעות של רקע גנטי. ערכי P מייצגים תוצאות מבחני t זנב השני. **** P &lt;0.0001, *** P = 0.0001 כדי 0.001, ** P = 0.001 כדי 0.01, * P = 0.01 כדי 0.05. ברים שגיאים להראות SEM. דמות זו שונתה 16. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54744/54744fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila at JoVE.com

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

כאן אנו מציגים שיטה למדידת רמות שומן האורגניזם ב instar השלישי (L3) בשלב הזחל של תסיסנית. שיטה זו מנצלת את הצפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן להבדיל בין זחלים עם ממאגרי שומן שונים. ניתוח מבוסס ציפה הוא כלי רב ערך עבור לסינון מהיר, לשחזור, וחסכוני.

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן<em&gt; תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

8.6K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  כאן אנו מציגים שיטה למדידת רמות שומן האורגניזם ב instar השלישי (L3) בשלב הזחל של תסיסנית. שיטה זו מנצלת את הצפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן להבדיל בין זחלים עם ממאגרי שומן שונים. ניתוח מבוסס ציפה הוא כלי רב ערך עבור לסינון מהיר, לשחזור, וחסכו...

Video: A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Behavior

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Neuroscience

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים<em&gt; דרוזופילה</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Gut Acidification Monitoring Assay: A Technique to Study the Acidification of the Intestinal Lumen in Drosophila using Bromophenol Blue Dye

Source: Abu, F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63141">Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor gut acidification in Drosophila flies. After the ingestion of food supplemented with a pH indicator dye, the acidification of the intestinal lumen results in a change in the color of the dye. Visual inspection of the digestive tract of the flies to examine the color change provides evidence of acidification.

בדיקת ניטור החמצת מעיים: טכניקה לחקר החמצת לומן המעי בדרוזופילה באמצעות צבע כחול ברומופנול

Source: Abu, F., et al. Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor ...

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כימות פיגמנטציה בטן ב

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

בדיקת ניטור החמצת מעיים: טכניקה לחקר החמצת לומן המעי בדרוזופילה באמצעות צבע כחול ברומופנול