We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

1. תאי הכנות לקראת מבחני הפצת נשק הערה: הכן שתי שורות תאים באותו אופן וזרעי במתכונת זהה עבור כל שיטה כדי להיות מנותח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 7 התאים מפגש 75-80% ב T 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות תרבות רקמות באמצעות פנול אדום חינם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) L- גלוטמין, 200 מ&quot;מ, 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ו אינסולין 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל puromycin ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. לטפל בתאים בכיתה ארון biosafety סטרילי השנייה. הערה: משך הזמן שנדרש כדי לגדל את תאי המפגש משתנה בהתאם דילול הזריעה. לקראת ציפוי התאים עבור מבחני שגשוג, זרע התאים ב דילול 1: 3 DMEM בתוספת ולתחזק בתנאים צמיחה נורמלית במשך 3 ימים עד 75-80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את התאים מהבקבוק, לשפוך את התקשורת לתוךמיכל פסולת. מיד לשטוף את שכבת התאים עם 2 מ&quot;ל של טריפסין 2x מחומם מראש. לשאוב טריפסין. הוסף 2 מיליליטר נוסף של טריפסין מחומם מראש ל שכבת התאים והמקום באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים לנתק, לשטוף את התאים עם 10 מ&quot;ל חימם השלימו טרי DMEM. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל סטרילי ב 491 XG במשך 5 דקות ב RT. בזהירות לשאוב ולהיפטר supernatant. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלול ב 5 מיליליטר של DMEM בתוספת הטריה. בצע ספירת תאים כדי לקבוע את הצפיפות הנכונה זרע התאים 96-גם צלחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 100 μl של ההשעיה תא 900 μl בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS). מניח חיישן 60 מיקרומטר חדש על דלפק התא האוטומטי. החזק את הבוכנה ואת להטביע את חיישן השעית התא המדולל. לאט לשחרר את הבוכנה על דלפק התא. הסר את החיישן מן cou התאnter כאשר הושלם. הערה: ספירת תאי יוצג על הדלפק של תאים תאים / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בווליום סופי של 100 μl (ב DMEM) בצלחת 96-היטב confluency ~ 20% כדי לאפשר מקום צמיחת תאים ומדידה של התפשטות על פני 3-5 ימים (ראה טבלה 1). זרעים כל שורות תאים בשלושה עותקים. הערה: לצורך ניסוי זה, שלוש צפיפויות תאים שונות הוערכו כדי לקבוע את צפיפות התא האופטימלית. המספרים התא נדרש מסוכמים בטבלה 1. תאי זרע בצפיפות נמוכה אם המדידה של צמיחה לטווח ארוך יותר נדרש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור hemocytometer מבחני מבוססי הארה, להכין צלחת אחת לכל נקודת זמן (כלומר 4 צלחות לכל assay). עבור assay תרמי התא, להכין רק צלחת אחת למשך הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. </li></ol> 2. תא קביעת סופרים אותנוing hemocytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם הוא בינוני טריפסין עד 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים, תנור או באמבט מים. לשאוב מדיה מתאי לתוך מיכל פסולת, לשטוף פעם אחת עם 30 μl של טריפסין 2x, לשאוב טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שוב עם 30 μl של טריפסין 2x, דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטפוח בעדינות קץ הצלחת כדי לסלק תאים מן הצלחת. הוסף 50 μl של DMEM בתוספת ומערבבים התאים על ידי pipetting עד שהתאים ליצור ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן hemocytometer על ידי ניקוי פני שטח מכסה זכוכית עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המכסה להחליק זכוכית מעל התאי לספור להדביק עד &#39;הטבעות השבירות של ניוטון&#39; ניתן לראות בין קצות כיסוי החלקים ואת hemocytometer. הערה: אלו מעידים כי החלקת הכיסוי דבקה כהלכה hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 20 μl של השעית תא בחסות החלקה, מילוי תא הספירה לפי תנועה נימי.מניחים hemocytometer בהגדלה 10x של מיקרוסקופ ולדמיין לתאי הספירה של פריסת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ב 4 הריבועים החיצוניים של פריסת הרשת. כדי לשפר את דיוק, ספירות חוזרות של ריבועים חיצוניים נוספים במידת הצורך, או עד לספור יש הגיעו לגיל 70 - 100 תאים 14,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז התאים לכל מ&quot;ל כדלקמן: ספירת תאי ממוצע גורם לדילול x מרובע (אם משתמשים בו) x 10 4 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.1-2.8 כל 24 שעות למשך 96 שעות שלאחר זריעה. </li></ol> 3. קביעת התפשטות תאים באמצעות Assay הארה מבוססת הערה: זוהי מדידת סיום. לאחר המגיב מתווסף התאים, הצלחת ניתן לכמת רק פעם אחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב הארת הפשרה באמבט מי C ° 22 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות מגיב על ידי היפוך הבקבוק להשיג תערובת הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן צלחת אחת של תאים שנזרעו (משלב1.5) בשעה RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של מגיב הארה היטב כל אחד. מערבבי תוכן על שייקר מסלולית במשך 2 דקות. אפשר צלחת כדי לדגור במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי הארה באמצעות תוכנת קורא צלחת מצב מרובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל קורא צלחת מצב מרובה ולפתוח את התוכנה. ב &#39;מנהל המשימות&#39;, בחר &#39;ניסויים&#39; ו &#39;ליצור new&#39;.Select&#39; קובץ &#39;מסרגל הכלים בצד, ותחת&#39; פרוטוקול &#39;כרטיסייה, בחר&#39; נוהל &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;גרנייה 96 תחתית שטוחה&#39; סוג הצלחת, וסמן את התיבה &#39;שימוש מכסה&#39;. בחר פעולה &quot;לקרוא&quot; תחת תיבת &quot;שיטה לקרוא &#39;. &#39;הארה&#39; בחר שיטת הזיהוי. לחץ על &#39;אישור&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו הצעד לקרוא, בחר את הבארות לסריקה תחת הלשונית &quot;הצלחת המלאה&quot;, ובחר בארות לפעול בארות ריקות כמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המסנן מוגדר מסנן ריק (למשל, תקע, Em: חור, ראי: ללא). קבע את הרווח כדי135, עם זמן אינטגרציה של 0.5 שניות לעמוד היטב לגובה לקרוא של 6.5 מ&quot;מ. לחץ על &#39;אישור&#39; כדי לשמור את ההגדרות על לקרוא הארה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע קריאת פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעל צלחת על ידי בחירת הכרטיסייה &#39;מכשיר בקרה&#39; ולחץ על &#39;צלחת out&#39;.Place צלחת 96-היטב על בעל צלחת, הבטחת המכסה על. סגור את מחזיק צלחת על ידי לחיצה על &quot;הצלחת&quot; הכרטיסייה תחת &quot;מכשיר הבקרה &#39;. לחץ על &quot;לקרוא עכשיו &#39;מסרגל הכלים לבצע קריאה זורחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא יחידת זורח יחסית (RLU) מדידות עבור כל טוב לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.1-3.6 להקליט התפשטות כל 24 שעות עד 96 שעות לאחר זריעת תאים. </li></ol> 4. קביעת ספירת תאים באמצעות Imager נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי הדמיה תא באמצעות תוכנת תרמי התא מצב מרובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תרמי תא רב-מצבים ה הפתוחהתוכנת דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &#39;מנהל המשימות&#39;, בחר בכרטיסייה &#39;הניסויים&#39; ו &#39;ליצור new&#39;.On את&#39; &#39;בסרגל הכלים, לחץ על&#39; קובץ &#39;כרטיסייה ופתוח&#39; פרוטוקול נוהל &quot;פעולת טמפרטורת הסט &#39;tab.Select&#39;. גדר חממה &#39;על&#39; ולהגדיר טמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס, לבדוק &#39;מחממים&#39; לפני שתמשיך עם תיבה &#39;לשלב הבא. לחץ על &#39;אישור&#39; כדי לשמור את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פעולה &quot;לקרוא&quot;. הקישו על שיטת הזיהוי &#39;תמונה&#39;, בחר &#39;קצה / התנועתיות&quot; לקרוא סוג וסוג אופטיקה&#39; מסננים &#39;. לחץ על &#39;OK&#39;.Click ב&#39;כרטיסיית מלאת צלחת&#39; ובחר בארות על הצלחת להיות צלמו. לחץ על &#39;אישור&#39; כדי לשמור את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המטרה פי 2.5 מן הנפתחת אפשרויות &#39;מטרות&#39;. תחת לשונית &#39;הערוצים&#39;, בחר בשני ערוצים: GFP 469, 525 ו מואר שדה. בדוק חשיפה &#39;אוטומטית&#39; עבור שני הערוצים ובחר את-החשיפה אוטומטית גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע AUTo הגדרות פוקוס, בחרו &#39;פוקוס אוטומטי&#39; ולחצו על &#39;אפשרויות&#39;. עבור אפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר בשיטת &#39;לסרוק ולאחר מכן פוקוס אוטומטי&#39;. לחץ על &#39;אישור&#39; כדי לשמור את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אופקי ואנכי לקזז ממרכז היטב (מיקרומטר) כדי 0.Select לסרוק מספר רב של תמונות לכל היטב מונטאז 3 x 2, עם מרווח אופקי (מיקרומטר) = 2881 ואת המרווח האנכי (מיקרומטר) = 2,127. לחץ על &#39;אישור&#39; כדי לשמור את הגדרות הליך. הערה: ראה טבלה 2 עבור פרמטרים לקריאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניסוי המשך לקרוא פלייט נבחר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית &#39;בקרת מכשיר&#39; ובחר את הצלחת &#39;צלחת החוצה&#39; function.Place 96-היטב בעל צלחת, הבטחת המכסה על. בכרטיסייה &#39;בקרת מכשיר&#39;, בחר &#39;הצלחת&#39; פונקציה. בחר &quot;לקרוא עכשיו &#39;חוצץ צלחת. חזור לקרוא כל 24 שעות עד 96 שעות שלאחר זריעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של ספירת כדוריות שימושCell Imager תוכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תמונה, לחץ על הכרטיסייה &#39;הנתונים&#39; על הצלחת ההדמיה, בחר &#39;תמונה [GFP 469, 525 + מואר שדה]&#39;. לחץ לחיצה כפולה על צלם גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תמונה טעונה. בחירה &#39;לנתח&#39; ובחר תמונה אחת של מונטאז להיות מנותחת. לחץ על &#39;OK&#39;.Check את&#39; GFP &#39;הערוץ היחיד, ופרמטרים להגדיר כפי שמתואר בטבלה 3. לחץ על&#39; START &#39;ליישם פרמטרים לתאי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המסכה ספירת תאים ממוקם מעל התאים צילמו, אשר משמש כדי לקבוע את ספירת התאים לכל תמונה. לחץ על &quot;החל שינויים&quot; ולשמור הגדרות אלה עבור כל צלחת צילמו לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חזרה לעבר הצלחת הדמיה, לחץ על התפריט &#39;נתונים&#39; הנפתח ובחר &quot;ספירת תאי &#39;. זה יפיק את ספירת תאים הכוללת לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את כל הנתונים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה על הכרטיסייה &#39;יצוא&#39; עבור o ניתוח נוסףf ספירת תאים לכל טוב. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+p53,+guardian+of+the+genome.">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li><li>Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+mutations+in+human+cancers:+origins,+consequences,+and+clinical+use.">TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).</li><li>Olivier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+value+of+somatic+TP53+gene+mutations+in+1,794+patients+with+breast+cancer.">The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).</li><li>Bourdon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+isoforms+can+regulate+p53+transcriptional+activity.">p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity.</a> Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+variants+of+p53+are+expressed+in+human+melanoma+cells+and+are+induced+by+the+DNA-damaging+agent+cisplatin.">Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin.</a> Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+mRNA+expression+of+p53+isoforms+in+breast+cancer+is+associated+with+clinical+features+and+outcome.">The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome.</a> Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).</li><li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+&amp;#34;gene+ontology&amp;#34;+(LeGO)+vectors+for+functional+gene+analysis.">A multicolor panel of novel lentiviral &amp;#34;gene ontology&amp;#34; (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology. , 25-31 (2006).</li><li>Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+to+measure+cell+proliferation+in+two+and+three+dimensions.">The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions.</a> Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).</li><li>Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).</li><li>Banks, P., Brescia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays.">Cell Viability Assays.</a> Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).</li><li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research.">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרוטוקול זה בשלוש שיטות שונות של מדידת התפשטות תאים בתאים בתרבית נבדקו. לכל שיטה הייתה מסוגלת מדידות לשחזור המדויקות של התפשטות תאים מעל 96 שעות, והתוצאות היו דומות בין כל אחת מהשיטות שנבדקו (איור 2 ו -3). הן assay ושיטת הדמית תא מבוסס ההארה הפיקו את התוצאות החזקות ביותר, מראים מגדילה ליניארי התפשטות תאים לאחר 96 שעות (איור 2b, ג). בנוסף, הדמיה תא לאורך זמן מתואר הבדל משמעותי בשיעורי הצמיחה בין transduced שורות תאים שאינם transduced (איור 4). ישנם יתרונות רבים וחסרונות לכל שיטה בחן בפרוטוקול זה, ראו טבלה 5 עבור סיכום. שיטת ספירת תאים הקונבנציונלית באמצעות hemocytometer היא שיטה בעלות נמוכה הדורשת ריאגנטים נוסף קטן מאוד או effort להכין ולהפעיל. יתר על כן, שיטה זו quantitates ספירה מוחלטת לתא בתאים / מ&quot;ל 14. עם זאת, ישנם חסרונות רציניים, אשר כוללים את הזמן רב הטבע של ספירת התאים, שיעורי שגיאה גבוהים שתוצאתו סטיות תקן גדולות בין הספירה, והעובדה כי בטווח גבוה של מספרים סלולריים נחוץ ספירת תאי מדויקת. ניתן לראות זאת באיור 2a, שבו ספירת תאים באמצעות hemocytometer הראה תוצאות משתנות על צפיפות התא נמוכה, וסטיות תקן גדולה בנקודות זמן מה לאחר מכן. חסרונות אלה הופכים שיטה זו שימושית עבור ספירת תאים בגדלי מדגם קטנים, ולוקה בחסר למדידות קצב העברת נתונים גבוהים גדולות שבו גדלה ודחיסויות זריעה בצלחת קטנות נדרשות. מגבלות אלה שניתנות להתגבר אם צפיפות התאים הוגדלה, כגון כי המספר המזערי של תאי נספר החל סף של יותר מ -100 תאים. ככל מדולל השעית התא, או להקטין את התא דensity, הסיכוי הגדול יותר של ספירה פחות מ -100 תאים ולכן הגדלת ההשתנות בין משכפל 15. עם זאת, שיטה זו אינה מתאימה צלחת 96 היטב, עקב שטח פן התא הנמוך, ולכן, המספר המספיק של תאים שיכולים לשמש בניתוח. זה מדגיש את חוסר יכולות העברת נתונים גבוהות של השיטה הזאת ואת נחיתות ברורה עבור משתמשים זקוקים יכולת זו. את assay מבוססי הארה קובע כדאיות התא על ידי מדידת כמות ATP, המהווה מדד של נוכחות של תאים פעילים מבחינה מטבולית 16. assay זה מיועד להקרנה תפוקה גבוהה של דגימות מרובות במתכונת צלחת 96 היטב כדי לקבוע התפשטות תאים. זו שיטה פשוטה quantitates תא התפשטות כיחידה הארה יחסית (RLU) באמצעות קורא צלחת, אשר עומד ביחס להווה ATP בתאים פעילים מבחינה מטבולית. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא tהוא לעלות של המגיב, ואת התלות של המדידה על הפעילות המטבולית של התאים. תנאי תרבית תאים שונים, כגון מועדים לפי שעון טמפרטורה או תא מחזור, יכולים להשפיע על כמות ATP בקלות המיוצר על ידי התאים, אשר עומד ביחס ישר האות הזורח שנוצר על ידי assay 17. לכן, חשוב לקבוע באופן אמפירי כי תנאי הניסוי לא להפריע את הפעילות המטבולית של התאים ואפשרות לעכב את האות הזורח היחסי שנוצר על ידי התאים. השיטה השלישית בחנה לקביעת התפשטות תאים הייתה תרמי תא חי ותוכנה לבצע ספירת תאים יחסית. משקפי התא יש יכולות תפוקה גבוהה כפי שהוא יכול להיות אוטומטי ללכוד תמונות מרובות עבור כל טוב, בזמן האמת יחד עם בקרת טמפרטורה, תוך שימוש באותה תאים על פני המשך של assay. כפי שניתן לראות בתרשים 4, התפשטות תאים יכול להיות מonitored באותה הצלחת מעל כמובן זמן, אשר יכול לספק מידע נוסף על אוכלוסיית התאים יחד עם ניתוח ספירת תאים. זהו יתרון מאוד כפי שהוא מבטל השתנות צולבת צלחת ותא שגיאת זריעה, וזה דבר שבשגרה 96 פורמטים הצלחת היטב. התוכנה המלווה את תרמי התא מאפשרת לכמת את ספירת תאים באמצעות הפרמטרים מפורטים בטבלה 2 ו -3. לכן הוא יעיל בסביבת תפוקה גבוהה והוא יכול להיות מרובב בקלות מבחני אחרים למדוד תפקודים תאיים כגון אפופטוזיס או רעיל. החיסרון העיקרי של המערכת הוא תוכנה, אשר מוגבלת ביכולתה לפצל חפצים נוגע ללב. למרות שזה יכול למלא את התפקיד הזה בתאי מפגש נמוכים, הוא מגבלה עיקרית של assay ולכן דורש אופטימיזציה ספציפית תאים מסוג. כמו כן, בעוד ניסויים בודדים באמצעות תרמי הם עלות נמוכה מאוד בסולם צלחת אחר צלחת, שיטה זו לא עלly להיות חסכוני אם המכשיר מוגדר כבר במעבדה. לכן, זה מספק שיטה חדשה למדידת תא התפשטות של תאים בתרבית, ויש לו את היתרון העיקרי של אין צורך ריאגנטים נוספים, והוא מסוגל 96 ספירה גם צלחת אוטומטית, מה שהופך שיטה זו מתאימה לניתוח תפוקה גבוהה. זהו שיפור משמעותי על שיטת ספירת תאים הקונבנציונלית hemocytometer, ומהווה אפשרות יעילה יותר עלות assay מבוסס ההארה. השלב הקריטי בעת שימוש תרמי התא הוא במהלך הניתוח של תמונות שנתפסו וספירת כדוריות עוקבת לכל תמונה. תמונות אלה יכולים להיות מעובד באמצעות מספר פלטפורמות הדמית תא. לכן חשיבות עליונה כדי לקבוע את התוכנה המתאימה ביותר לסוג התא תחת חקירה. זה יהיה שימושי כדי לאמת את ספירת תאים מהתמונות נרכשו על ידי תרמי התא באמצעות תוכנת הדמיה שונה. פרוטוקול זה יכול להיות מוחל עלתאים בתרבית y, אולם פרמטרי הניתוח יצטרכו להיות מוגדרים עבור כל קו תא. זה יכול להיות זמן רב בהתחלה, אבל ברגע הפרמטרים הוגדרו, השיטה יכולה להיות אוטומטית צלחות כולו תמונה בכל פעם. חשוב לציין כי מבחנים אלה הם למעשה אמצעי עקיף של התפשטות, כפי שהוא למדוד מספר סלולארי (hemocytometer, תרמי תא), או פעילות מטבולית (assay מבוסס הארה), על פני תקופה של זמן. ניתן שיטות אלה מתוקנים בקלות למדוד גורמים חשובים אחרים שיכול משפיעים על שגשוג. לדוגמא, שיטת ההרחקה הכחולה trypan ניתן לשלב בקלות לתוך לשיטת hemocytometer או תא תרמי להוציא תאים מתים ומכאן לקבוע תא כדאיות 13. את assay מבוסס ההארה יכול להיות מרובב עם assay cytotoxicity כדי לספק מידע נוסף על בריאות תא, ואת הפעילות המטבולית שנמדדה במהלך assay זה גם מדידה של התא viability 12. לכן, את הגמישות של מבחנים אלה כדי להיות מרובב עם מבחנים אחרים כדי לספק מידע סלולארי נוסף היא יתרון חזק של כל אחת משיטות אלו. פרוטוקול זה משמש קו תאים אנושיים של סרטן השד MCF-7 אשר כבר transduced ביציבות עם הגן לגו-iG2-פורו + וקטור המכיל את ה- GFP. זה מאפשר שימוש במסנן אופטיקה GFP לתדמית התאים, ללא צורך להוסיף כל סוכני צבע לתוך המדיום לתרבות. שיטה זו יכולה בקלות להיות שונה תאי GFP שלילי תמונה או אפילו שורות תאים ראשוניות, בין אם על ידי הדמית התאים באמצעות סוג אופטיקה בשדה הבהיר, או על ידי סימון התאים עם סמן התפשטות. השיטות לעומת בפרוטוקול זה הן חזקות מספיק כדי לשמש במגוון רחב של שורות תאים שונות, אולם הגדרות הפרוטוקול האופטימלי עבור כל קו תאים בודד צריכות להיקבע ראשונה. הדמיה של תאים באמצעות ערוץ השדה הבהיר מייצגת את האפשרות הטובה ביותר עבור ce העיקריLLS או כאלה שמכילים הרבה גדל לאט, בשל האופי ארוך הטווח של שיטה זו. מבחני נקודות קצה, כגון assay מבוסס ההארה, אינם מתאימים היטב לניתוח צמיחת תאים לטווח ארוך. פרוטוקול זה תאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה. לכל שיטה ניתן לבצע באופן שגרתי במעבדה למדוד צמיחת תאים, ורוב המעבדות תירשנה את הכישורים הדרושים כדי לבצע באחת השיטות הבאות. עם זאת, ישנם גם מגוון של מבחני אחרים הזמינים למדידת תאים מתחלקים. אלו יכולים לכלול שיטות המודדות סינתזה של DNA, פעילות מטבולית, אנטיגנים הקשורים מהפצה או ATP ריכוז 9. לדוגמא, מספר המבחנים פותח כדי למדוד את קצב סינתזת ה- DNA של תאים על ידי תיוג תאים עם חומר רדיואקטיבי כגון thymidine 3H. החיסרון של שיטה זו הוא השימוש הברור של חומרים רדיואקטיביים, וכן לרשותם. אַחֵרשיטות אשר משמשים באופן שגרתי למדידת התפשטות תאים לכלול את השימוש של תיוג BrdU של DNA שהוקמה זה עתה, אשר ניתן למדוד באמצעות זרימת cytometry 18. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לנתח הן את מספר הנייד וכן מידע מחזור התא. זה עשוי להיות תוצאת יתרון לניסויים מסוימים, אולם החסרונות של שיטה זו כוללים את הזמן נוסף וצעדים, ריאגנטים יקרים ומיומנויות מאומן משתמש מוגברות על מנת להפעיל את זרימת cytometer ולנתח את הנתונים המתקבלים 18. לכן, יש מבחנים שונים זמינים למדענים להעריך את הצמיחה של תאים, ואת השיטה שנבחרה תלויה במידה רבה בסוג התא בשימוש, משתמש ורמת המיומנות שלהם, ואת סוג הנתונים הנדרשים על נקודת הסיום של הניסוי. לסיכום, שלוש שיטות שונות למדוד התפשטות תאים הושוו באמצעות תאי סרטן השד. יש לכל שיטה יתרונות רבים disadvantages, ולכן הוא תלוי משתמש מבוסס על הדרישות שלהם עבור כל ניסוי, מבחינת קביעת assay המתאים ביותר לבצע ספירת תאים.

הגן מדכא גידולים, p53, הוא הרגולטור חיוני של מספר תהליכים תאיים, כולל עיכוב מחזור התא, אפופטוזיס והזדקנות 1. הוא אחראי על שמירה על יציבות גנומית, ולכן הוא חיוני בשמירה על האיזון של מוות של תאים וצמיחת תא. מוטציות ב- p53 נפוצים סרטן והם הגורם העיקרי של איון p53 המוביל התפשטות תאים סרטניים בלתי מבוקרת 2. מעניין, מוטציות ב- p53 רק מהווים כ -25% ממקרי סרטן השד 3, דבר המצביע על כך מנגנונים אחרים אחראים אובדן תפקוד p53. Isoforms p53 גילה לאחרונה הוכח להיות ביטוי יתר במספר סוגים של סרטן אנושי, והוא יכול לווסת p53 פונקצית 4,5. הראינו בעבר כי איזופורם p53, Δ40p53, הוא איזופורם הביע הגבוהה ביותר בסרטן השד, והוא upregulated משמעותי בתאי סרטן השד, בהשוואה Tiss נורמלי סמוכיםue 6. בעקבות זאת, אנחנו transduced הקו הסלולרי סרטן השד האנושי ביציבות MCF-7 כדי overexpress Δ40p53 באמצעות לגו-iG2-פורו + וקטור (+ GFP) 7. תאים אלו שמשו לחקור אם ביטוי Δ40p53 גבוה מגביר את קצב התפשטות תאים בתאי סרטן השד. ישנן שיטות ישירות ועקיפות רבות של מדידת תא התפשטות של תאים בתרבית במבחנה 8,9. אלה יכולים להתבצע גם כמו מדידה רציפה לאורך זמן, או מבחני סיום כמו 10. בשיטות מקובלות עדיין שימושיות, כגון ספירת תאים באמצעות hemocytometer. assay זוהי עלות נמוכה מדידה ישירה של המספר הסלולרי, אבל זה להסתמך על ספירה תאית גדולה אימון מיומן כדי למזער סטיות שגיאת תקן גדול מן הספירות. הצורך לבצע מדידות תואמות פורמטי תפוקה גבוהה הוביל את הפיתוח של מבחני multiwell צלחת. מבחני הארה מבוססת אלה צפחותמחדש מספרים סלולריים המבוססים על אות זורחת כי היא יחסית את הפעילות המטבולית של התא 11,12. ולאחרונה, את ההקדמה של פלטפורמות הדמיה תכולה גבוהה אפשרה כלים חדשים אשר לנטר התפשטות תאים תוך מתן איסוף נתונים פנוטיפי כמותיים ואיכותיים, וכולל מגוון רחב של מערכות 13. כל השיטות האלה לספק אפיקים למדוד צמיחת תאים, בין אם על ידי מבחני מדידה או נקודות קצה רציפים, וכל אחד להחזיק מגוון של יתרונות וחסרונות לגבי רגישות, תפוקה של מספרי מדגם, ומידע תא, כל מה שיכול להישקל בהתאם בהתאם על שאלת המחקר. פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות שונות למדידת התפשטות תאים במבחנה, עם כל שיטת ניצול טווחים שונים של רגישות, שחזור ותבניות צלחת רבה היטב. פרוטוקול זה נועד להשוות את השימוש של צ&#39;ה ספירת hemocytometermber, assay כדאיות התא מבוססי הארה, וכן imager התא, במדידה של התפשטות תאים על פני מהלך הזמן 96 שעות ביממה. לשם כך, את הצמיחה של תאים transduced וקטור (MCF-7-לגו) הושווה תאים transduced כדי overexpress Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), באמצעות שלוש צפיפויות תאים שונים. התפשטות תאים נמדדה כל 24 שעות עד 96 שעות. לכל שיטה נמצאה יש יתרונות וחסרונות משלו, בהתאם מטרת הניסוי, כל עוד הוא שיטה ערך למתן מידע על קצב הפרוליפרציה.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &amp;micro;g/ml insulin and 1 &amp;micro;g/ml puromycin</td></tr><tr><td>L-glutamine solution (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Dilute to 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask, 75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;growth area</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate, flat bottom</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Improved Neubauer Hemocytometer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Luminescence-based assay</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging</td></tr><tr><td>Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparison of three different methods for determining cell proliferation in breast cancer cell lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

כדי ללמוד שיטות שונות למדידת ההתפשטות של תאים בתרבית, התפשטות התאים של MCF-7-Δ40p53 transduced תאים הושווה MCF-7-לגו הלא transduced שורת תאי סרטן השד. השלוש השיטות שהושוו - את assay ההארה הקונבנציונלית hemocytometer שיטה, תא כדאיות, והדמית תא אנליזה מתוארת בתרשים סכמטי (איור 1). יש לכל שיטה יתרונות וחסרונות למדוד ספירת תאים במדויק לאורך זמן, ואת השיטה היעילה ביותר תלוי בדרישות הסיום של הניסוי והמידע שניתן לרכוש עבור אוכלוסיית תאים. הצמיחה של MCF-7-לגו MCF-7- תאים Δ40p53 נמדדו לאחר 24 שעות במשך 4 ימים. כפי שניתן לראות בתרשים 1, שתי שורות התאים היו זורעות בשלוש צפיפויות תאים שונות (1.5 x 10 3 </sעד&gt;; 3 x 10 3; 5 x 10 3 תאים / טוב) ותא ספירה בוצעו 24, 48, 72 ו -96 שעות לאחר זריעה. לכל שיטה הפגינה התפשטות תא מוגברת, באמצעות hemocytometer, assay מבוסס הארה, וכן תרמי תא (2a הדמוי, B ו- C, בהתאמה) מעל 96 שעות. העלייה הגבוהה ביותר התפשטות תאים נתפסה על צפיפות התאים הגבוה ביותר (5 x 10 3 תאים), וכן הראו תוצאות לשחזור ביותר בכל נקודת זמן, דבר המצביע על זה להיות צפיפות התאים האופטימלי עבור מדידת התפשטות בתאים אלה. לא נמצא הבדל משמעותי התפשטות תאים בין שורות תאים. מדידת התפשטות תאים בין השיטות השונות הושוותה על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית 6 (איור 3; טבלה 4). חוקרים מצא קורלציה משמעותית בין כל אחת מהשיטות השונות שנבדקו, כאשר משווים גell התפשטות הכלל של צפיפות התא בשתי שורות התאים (איור 3 א &#39;וב&#39;). המתאם החזק נצפה בין ההשוואה של assay מבוסס ההארה, ואת תרמי התא (R 2 = 0.8899, p ≤0.0001; R 2 = 0.9805, p ≤0.0001, איור 3 א &#39;וב&#39;, בהתאמה). ייצוג חזותי של התפשטות תאים באמצעות תרמי התא מוצג (איור 4). כמו שיטה זו משתמשת מדידות מתמשכות של צלחת אחת, התאים ניתן צלמו כל 24 שעות עד שהתאים להגיע קרוב ל 100% מפגש. כפי שניתן לראות בתרשים 2, שיעורי הצמיחה של תאי MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 היו דומים בכל נקודות הזמן. שיטה זו מספקת מידע שימושי הסלולר, כולל היכולת לפקח צמיחת תאים חזותי על פני מספר ימים, ולהשוות גודל תא מורפו התאמשעמם בין שורות תאים שונות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig1.jpg" /> איור 1: תרשים סכמטי של שלוש שיטות שונות מדידת התפשטות תאים תאים היו זורעים שלוש צפיפויות תאים שונים לתוך 96-גם הצלחות מרובות וטופחו על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עד 96 שעות.. כל 24 שעות, התפשטות תאים נמדדה על ידי אחד באמצעות hemocytometer, הדמית assay או מבוסס תאי הארה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig2.jpg" /> איור 2:. מדידות התפשטות תאים לאחר 96 שעות ספירת תאים נמדדו כל 24 שעות למשך 96 שעות ב MCF-7-רגלO ו MCF-7-Δ40p53 תאים זורעים שלוש צפיפויות תאים שונים. ספירת תאים נמדדו באמצעות (א) hemocytometer בתאים / מיליליטר, (ב) באמצעות assay מבוסס הארה ביחידות זורחות יחסית (RLU), או (ג) ספירת תאים רציפה באמצעות תרמי של תאי תאים / תמונה. תנאים עבור תרמי התא מוצגים בלוח 2. כל הניסויים מייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ± הס&quot;ד <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig3.jpg" /> איור 3:. השוואה של שלוש שיטות שונות מדידת התפשטות תאים בשורות תאי סרטן שד ניתוח רגרסיה ליניארית בוצע להשוות את היחסים הגומלים בין מ &#39;השונה<html> ethods בחן למדידת תא התפשטות ב (א) MCF-7-לגו תאים (ב) תאי MCF-7-Δ40p53. מקדם המתאם של פירסון חושב ואת המשמעות נקבעה (p &lt;0.05) בין השיטות השונות למדידת התפשטות תאים. כל התוצאות מייצגות את ממוצע ± הס&quot;ד של שלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig4.jpg" /> איור 4:. תמונות של תאי סרטן השד GFP חיובי MCF-7-לגו MCF-7-Δ40p53 נציג תמונות של התאים מפני 5 x 10 3 תאים שנזרעו שנתפסו באמצעות תרמי תא כל 24 שעות. סרגל הסולם מייצג 1,000 מיקרומטר. פרמטרים הדמיה תא מסוכמים בטבלה 2.<html> יעד href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> צפיפות התאים (תאי / טוב) </td></tr><tr><td> סוג תא </td><td> 1.5 x 10 3 </td><td> 3.0 x 10 3 </td><td> 5 x 10 3 </td></tr><tr><td> MCF-7-לגו </td><td> 76 μl ב 8.4 מ&quot;ל התקשורת </td><td> 152 μl ב 8.3 מ&quot;ל התקשורת </td><td> 254 μl ב 8.2 מ&quot;ל התקשורת </td></tr><tr><td> MCF-7-Δ40p53 </td><td> 93 μl ב 8.4 מ&quot;ל התקשורת </td><td> 185 μl ב 8.3 מ&quot;ל התקשורת </td><td> 308 μl ב 8.2 מ&quot;ל התקשורת </td></tr></tbody></table> טבלה 1: כרכים זריעת תאים עבור 96 צלחות היטב. &quot;FO: keep-עם-next.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> קראו פרמטרים </td></tr><tr><td> סוג פלייט </td><td> 96 גם </td></tr><tr><td> מצב </td><td> תמונה </td></tr><tr><td> מַטָרָה </td><td> פי 2.5 </td></tr><tr><td> צֶבַע </td><td> GFP (469, 525), באופן מואר </td></tr><tr><td> חשיפה </td><td> אוטו </td></tr><tr><td> מוֹקֵד </td><td> אוטומטי (סריקה ואז פוקוס אוטומטי) </td></tr></tbody></table> טבלה 2: פרמטרים קראו הדמית תא באמצעות Imager Cell. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> פרמטרי הדמיה </td></tr><tr><td> סף </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> גודל האובייקט המינימלי (מיקרומטר) </td><td> 30 </td></tr><tr><td> גודל מקסימאלי של אובייקט (מיקרומטר) </td><td> 300 </td></tr></tbody></tמסוגל&gt; טבלה 3: פרמטרי הדמיה לניתוח תא ספירה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MCF-7-לגו </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מרובע R </td><td> p-value </td></tr><tr><td> Hemocytometer לעומת assay מבוסס הארה </td><td> .6301 </td><td> .0021 </td></tr><tr><td> תא תרמי לעומת hemocytometer </td><td> .7524 </td><td> 0.0003 </td></tr><tr><td> Assay מבוסס הארה לעומת תרמי תא </td><td> .8899 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> MCF-7-Δ40p53 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> מרובע R </td><td> p-value </td></tr><tr><td> Hemocytometer לעומת luassay מבוסס minescence </td><td> .8983 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> תא תרמי לעומת hemocytometer </td><td> .9303 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td> Assay מבוסס הארה לעומת תרמי תא </td><td> .9805 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr></tbody></table> לוח 4: ניתוח רגרסיה לינארית של שלוש שיטות הפצת הנשק השונות שנבדקו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שִׁיטָה </td><td> יתרונות </td><td> חסרונות </td><td> הערות טכניות </td><td> פלט סופי </td></tr><tr><td rowspan="4"> hemocytometer </td><td> עלות נמוכה </td><td> טעות אנושה גבוהה </td><td> פיפטה מספר פעמים להכין השעית תא בודדת </td><td rowspan="4"> תאים / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> דורש ציוד מינימלי </td><td> דורש השעית תא יחיד </td><td> בצע ספירה מרובה כדי להשיג דיוק </td></tr><tr><td> ספירת תאים ישירה </td><td> מספר גבוה של תאי דרושי הערכה מדויקת של ספירת תאים </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Endpoint </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> Assay הארה מבוססת </td><td> השתמש עם פורמטי multiwell צלחת </td><td> ריאגנטים יקרים </td><td> להגן מפני אור </td><td rowspan="6"> יחידות פלורסנט יחסית (RLU) / טוב </td></tr><tr><td> קל לבצע </td><td> דורש קורא צלחת זורח </td><td> כלול בארות שליטה לקבוע הארת רקע </td></tr><tr><td> assay המהיר </td><td> טמפרטורה רגישה </td><td></td></tr><tr><td> מספק מידע כדאי תא </td><td> משתנה בהתאם לפעילות המטבולית של תאי</td><td></td></tr><tr><td></td><td> מדידה עקיפה </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Endpoint </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> תרמי נייד </td><td> מדידה רציפה </td><td> תרמי יקר </td><td> ודא תרמי תא מוגדר 37 ° C </td><td rowspan="6"> תאים / תמונה </td></tr><tr><td> בקרת טמפרטורה </td><td> מיומנות אינטנסיבית </td><td> הימנע טלטול או הפרעה מיותרת של תאים </td></tr><tr><td> מספק מידע הסלולר </td><td> משתנה תלוי מפגש של תאים </td><td></td></tr><tr><td> חסכוני (אם יש לך את תרמי) </td><td> ספירה יחסית </td><td></td></tr><tr><td> מדידה ישירה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הדמיה אוטומטית של פורמט multiwell צלחת </td><td></td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; לוח 5: השוואה בין היתרונות והחסרונות של שיטות ספירת תאים השונות.

Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines at JoVE.com

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

comparison-three-different-methods-for-determining-cell-proliferation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  Hunter Medical Research Institute. This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Video: Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Cancer Research

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Bioengineering

מיקוד פרמקולוגי של תעלות יונים לטיפול בגידולים מוצקים

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

מחבר זרקור: חקר תפקידן של תעלות יונים בסרטן: אפיון וגישות טיפול פוטנציאליות 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Immunology and Infection

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

השוואה של שלוש שיטות שונות לקביעת שגשוג תאים בשורות תאי סרטן השד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

הערכה לא הרסנית של צפיפות תאים אזורית בתוך אגרגטים סרטניים בעקבות טיפול תרופתי

הכנה וניתוח של

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי