We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

1. Vorbereiten Zellen für Proliferationsassays Hinweis: Vorbereiten der zwei Zelllinien in der gleichen Weise und Saatgut in demselben Format für jede Methode analysiert werden. <ol><li> Wachsen MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 7 - Zellen zu 75-80% Konfluenz in T 75 cm 2 Gewebekulturflaschen mit Phenolrot-freiem Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 200 mM L-Glutamin, 2 &amp; mgr; g / ml Insulin und 1 &amp; mgr; g / ml Puromycin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Behandeln Sie Zellen in einem sterilen Biosicherheitsschrank Klasse II. Anmerkung: Die Menge der Zeit es braucht, um die Zellen zu Konfluenz wachsen variiert je nach der Aussaat Verdünnung. In Vorbereitung für die Plattierung der Zellen für die Proliferationsassays, Samen, die Zellen in einer 1: 3-Verdünnung in DMEM, ergänzt und in normalen Wachstumsbedingungen für 3 Tage, bis 75-80% Konfluenz erhalten. </li><li> Um die Zellen aus dem Kolben zu entfernen, abgießen, die Medien ineinen Abfallbehälter. Ab sofort waschen Sie die Zellschicht mit 2 ml vorgewärmten 2x Trypsin. Absaugen Trypsin. Fügen eine weitere 2 ml vorgewärmtes Trypsin zu der Zellschicht und in einen Inkubator für 5 min bei 37 ° C mit 5% CO 2. <ol><li> Sobald die Zellen lösen, waschen Sie die Zellen mit 10 ml erwärmter frisches DMEM ergänzt. Übertragen die Zellsuspension in ein steriles 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 491 g für 5 min bei RT. vorsichtig absaugen und entsorgen Überstand. </li></ol></li><li> Zellpellet in 5 ml frischem ergänzten DMEM. Durchführen einer Zellzahl die richtige Dichte zu bestimmen, die Zellen in 96-Well-Platten auf Saatgut. <ol><li> Verdünnte 100 ul der Zellsuspension in 900 ul 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS). Legen Sie eine neue 60 &amp; mgr; m-Sensor auf der automatisierten Zellzähler. Halten Sie den Kolben nach unten und tauchen Sie den Sensor in der verdünnten Zellsuspension. Geben Sie langsam den Kolben auf der Zellzähler. Entfernen Sie den Sensor aus der Zelle counter wenn sie abgeschlossen sind. Anmerkung: Die Zellzahl wird auf der Zellzähler in Zellen / ml angezeigt. </li></ol></li><li> Samenzellen in einem Endvolumen von 100 &amp; mgr; l (in DMEM) in einer 96-Well - Platte bei ~ 20% Konfluenz zu ermöglichen Raum für das Zellwachstum und die Messung der Proliferation über 3-5 Tage (siehe Tabelle 1). Samen alle Zelllinien in dreifacher Ausfertigung. Hinweis: Bei diesem Experiment wurden drei verschiedene Zelldichten beurteilt die optimale Zelldichte zu bestimmen. Die erforderlichen Zellzahlen sind in Tabelle 1. Seed - Zellen mit einer geringeren Dichte , wenn die Messung von mehr langfristiges Wachstum zusammengefasst erforderlich. <ol><li> Für die Hämozytometer und Lumineszenz-basierten Assays, bereiten eine Platte pro Zeitpunkt (dh 4 Platten pro Test). Für die Zell Imager Assay vorbereitet nur eine Platte für die Dauer des Experiments. </li></ol></li><li> Pflegen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol> 2. Festlegung der Zellzahl Using einem Hämocytometer <ol><li> Vorwärmen sowohl mittlere als auch Trypsin bis 37 ° C in einer Zellkultur-Inkubator, Ofen oder Wasserbad. Aspirat Medien von Zellen in einen Abfallbehälter, wäscht einmal mit 30 ul 2x Trypsin und Trypsin die anzusaugen. </li><li> Wash-Zellen wieder mit 30 ul 2x Trypsin und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht Rand der Platte Zellen von der Platte zu entfernen. Zugabe von 50 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt und mischen Zellen durch Pipettieren, bis die Zellen eine Einzelzellsuspension zu bilden. </li><li> Bereiten Sie Hemocytometer durch Oberfläche und Glasabdeckung mit 70% Ethanol reinigen. </li><li> Legen Sie die Glasdeckglas über Zählkammern und bringen bis &quot;Newtons Refraktion Ringe&quot; werden kann zwischen den Deckglaskanten und der Hemocytometer gesehen. Hinweis: Diese zeigen an, dass das Deckglas richtig an den Hemocytometer eingehalten hat. </li><li> Pipette vorsichtig 20 &amp; mgr; l der Zellsuspension unter dem Deckglas, durch kapillare Bewegung der Zählkammer füllt.Legen Sie Hämozytometer unter 10-facher Vergrößerung eines Mikroskops und visualisieren die Zählkammern im Grid-Layout. </li><li> Zählen von Zellen in den vier äußeren Plätzen der Grid-Layout. Zur Verbesserung der Genauigkeit, die Anzahl der Wiederholungen von zusätzlichen äußeren Quadrate , falls erforderlich, oder bis der Zählwert hat 70 erreicht - 100 Zellen 14,15. <ol><li> Berechnen Zellkonzentration pro ml wie folgt: Durchschnittliche Zellzahl pro x Verdünnungsfaktor Quadrat (falls verwendet) x 10 4 </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 alle 24 Stunden für 96 Stunden nach der Aussaat. </li></ol> 3. Bestimmung der Zellproliferation eine Lumineszenz-basierten Assay unter Verwendung von Anmerkung: Dies ist eine Endpunktmessung. Sobald das Reagens zu den Zellen gegeben wird, kann die Platte nur einmal quantifiziert werden. <ol><li> Auftau Lumineszenzreagenz in einem 22 ° C Wasserbad für 30 min. </li><li> Vorsichtig mischen Reagenz durch die Flasche Umkehren um eine homogene Mischung zu erhalten. </li><li> Äquilibrieren einer Platte gesäten Zellen (aus Schritt1.5) bei RT für 30 min. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l Lumineszenzreagenz zu jeder Vertiefung. Mischungs Inhalt auf einem Orbitalschüttler für 2 min. Lassen Sie Platte für 10 min bei RT inkubiert. </li><li> ein Lumineszenz-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Plattenleser Software einrichten. <ol><li> Schalten Sie Multi-Mode-Plattenlesegerät und öffnen Sie die Software. In der &quot;Task-Manager&quot;, wählen Sie &quot;Experimente&quot; und Datei &quot;von Seite Symbolleiste, und unter&quot; Protokoll &quot;Registerkarte, wählen Sie &#39;Verfahren&#39; &#39;new&#39;.Select schaffen&#39;. </li><li> Wählen Sie &#39;Grenier 96 Flachboden&#39; Plattentyp, und überprüfen Sie die &quot;Verwendung Deckel&quot; Box. Wählen Sie &quot;lesen&quot; Aktion unter &quot;Leseverfahren&quot; ein. Wählen Sie &#39;Lumineszenz&#39; Nachweisverfahren. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Im Schritt Feld zu lesen, wählen Sie die Vertiefungen unter der &quot;vollen Teller &#39;Tab gescannt werden, und wählen Sie Brunnen als leere Brunnen zu handeln. </li><li> Stellen Sie den Filter auf leeren Filter (zB Stecker, Em: Loch, Spiegel: keine). Stellen Sie die Verstärkung135, mit einer Integrationszeit von 0,5 sec pro Vertiefung und eine Lese Höhe von 6,5 mm. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; Einstellungen für die Lumineszenz Lese zu speichern. </li></ol></li><li> Durchführen eines lumineszenten lesen <ol><li> Auswurfplattenhalter von &quot;Gerätesteuerung&quot; Auswahl der Registerkarte, und klicken Sie auf &#39;Teller out&#39;.Place 96-Well-Platte auf den Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Schließen Sie den Plattenhalter durch einen Klick auf &quot;Platte in&quot; unter &quot;Gerätesteuerung&quot; Tab. Klicken Sie auf &quot;jetzt&quot; in der Symbolleiste Leuchtlese auszuführen. </li><li> Exportieren Sie die relativen Leuchteinheit (RLE) Messungen für jede Vertiefung in eine Tabelle für die weitere Analyse. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 Proliferation alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach dem Aussäen Zellen aufzuzeichnen. </li></ol> 4. Bestimmung Zellzahl unter Verwendung eines Zell-Imager <ol><li> Einrichten eines Cell-Imaging-Experiment unter Verwendung der Multi-Mode-Zelle Imager Software <ol><li> Schalten Sie Multi-Mode-Zelle-Imager und offen the Software. </li><li> In der &quot;Task-Manager&quot;, wählen Sie &quot;Experimente&quot; Tab und &quot;erstellen new&#39;.On &#39;Datei&#39; Symbolleiste, klicken Sie auf&quot; Protokoll &quot;Registerkarte und offene&quot; Verfahren &quot;tab.Select&quot; Soll-Temperatur &quot;Aktion. Set Inkubator &#39;auf&#39; und setzen die Temperatur auf 37 ° C und prüfen &#39;vorwärmen&#39;, bevor mit dem nächsten Schritt &quot;Box weiter. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; die Einstellungen zu speichern. </li><li> Wählen Sie &quot;lesen&quot; Aktion. Klicken Sie auf &quot;Bild&quot; Erkennungsmethode, wählen Sie &#39;Endpunkt / kinetische&#39; lesen Art und &#39;Filter&#39; Optik-Typ. Klicken Sie auf &quot;OK&#39;.Click auf&quot; Vollplatte &quot;Menü und wählen Sie Vertiefungen auf der Platte abgebildet werden. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Einstellungen zu speichern. </li><li> Wählen Sie das 2.5X Ziel aus dem Dropdown &quot;Ziele&quot; Optionen. Unter Registerkarte &quot;Kanäle&quot;, wählen Sie zwei Kanäle: GFP 469, 525 und dem Hellfeld. Überprüfen Sie &#39;auto&#39; Belichtung für beide Kanäle und wählen Sie die automatische Belichtung gut. </li><li> Um zu bestimmen, auto Fokuseinstellungen, wählen Sie &quot;Autofokus&quot; und klicken Sie auf &quot;Optionen&quot;. Für die Autofokus-Optionen, wählen Sie die &quot;Scan und dann Autofokus&quot; -Methode. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; die Einstellungen zu speichern. </li><li> Stellen Sie die horizontalen und vertikalen Versatz von der Mitte des gut (um) bis 0.Select mehrere Bilder pro Vertiefung in einem 3 x 2 Montage, mit horizontalen Abstand (um) = 2881 und vertikalen Abstand (um) = 2127 zu scannen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; -Verfahren Einstellungen zu speichern. Hinweis: Siehe Tabelle 2 für den Leseparameter. </li></ol></li><li> Performing lesen Experiment zu ausgewählten Platte <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Gerätesteuerung&quot; Menü und wählen Sie die &quot;plate out&quot; function.Place 96-Well-Platte in Plattenhalter, den Deckel zu gewährleisten eingeschaltet ist. Unter der Registerkarte &quot;Gerätesteuerung&quot;, wählen Sie die &quot;Platte in&quot; Funktion. Wählen Sie &quot;jetzt&quot; von der Platte Registerkarte. Wiederholen Sie alle 24 Stunden bis zu 96 Stunden nach der Aussaat lesen. </li></ol></li><li> Die Analyse der Zellzahl unter Verwendung derHandy Imager Software. <ol><li> Um ein Bild zu analysieren, klicken Sie auf den &quot;Daten&quot; auf die Registerkarte bebilderte Platte, wählen Sie &#39;Bild [GFP 469, 525 + Hellfeld]&#39;. Klicken Sie doppelt auf ein gut abgebildet. </li><li> Klicken Sie auf ein geladenes Bild. Wählen Sie &quot;analysieren&quot; und wählen Sie ein einzelnes Bild der Montage analysiert werden. Klicken Sie auf &quot;OK&#39;.Check die&quot; GFP &quot;Kanal nur, und Parameter wie in Tabelle 3 dargestellt. Klicken Sie auf&quot; START &quot;Parameter auf die abgebildeten Zellen anzuwenden. </li><li> Beobachten der Zellzählung Maske über den abgebildeten Zellen gegeben, die verwendet wird, um die Zellzahl pro Bild zu bestimmen. Klicken Sie auf &quot;Änderungen übernehmen&quot; und halten Sie diese Einstellungen für jede Platte während des gesamten Experiments abgebildet. </li><li> Wieder zurück auf der bebilderte Platte, klicken Sie auf den Drop &#39;data&#39; down-Menü und wählen Sie &quot;Zellzahl&quot;. Dadurch wird die Gesamtzellzahl pro Vertiefung erzeugen. </li><li> Exportieren Sie alle Daten in eine Tabelle auf der &quot;Export&quot; Register für die weitere Analyse o durch einen Klickf die Zellzahl pro Vertiefung. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+p53,+guardian+of+the+genome.">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li><li>Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+mutations+in+human+cancers:+origins,+consequences,+and+clinical+use.">TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).</li><li>Olivier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+value+of+somatic+TP53+gene+mutations+in+1,794+patients+with+breast+cancer.">The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).</li><li>Bourdon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+isoforms+can+regulate+p53+transcriptional+activity.">p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity.</a> Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+variants+of+p53+are+expressed+in+human+melanoma+cells+and+are+induced+by+the+DNA-damaging+agent+cisplatin.">Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin.</a> Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+mRNA+expression+of+p53+isoforms+in+breast+cancer+is+associated+with+clinical+features+and+outcome.">The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome.</a> Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).</li><li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+&amp;#34;gene+ontology&amp;#34;+(LeGO)+vectors+for+functional+gene+analysis.">A multicolor panel of novel lentiviral &amp;#34;gene ontology&amp;#34; (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology. , 25-31 (2006).</li><li>Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+to+measure+cell+proliferation+in+two+and+three+dimensions.">The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions.</a> Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).</li><li>Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).</li><li>Banks, P., Brescia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays.">Cell Viability Assays.</a> Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).</li><li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research.">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll drei verschiedene Methoden der Zellproliferation in kultivierten Zellen Messung untersucht. Jede Methode der Lage war, reproduzierbare und genaue Messungen der Zellproliferation über 96 h, und die Ergebnisse waren vergleichbar zwischen jedem der Verfahren getestet (Abbildung 2 und 3). Sowohl die Lumineszenz basierenden Assays und Zellbildgebungsverfahren erzeugt die robusteste Ergebnisse, linearen Anstieg der Zellproliferation nach 96 h zeigt , (2b, c). Zusätzlich dargestellt Cell Imaging im Laufe der Zeit keine signifikanten Unterschiede in den Wachstumsraten zwischen den transduzierten und nicht-transduzierten Zelllinien (Abbildung 4). Es gibt viele Vorteile und Nachteile für jede Methode in diesem Protokoll untersucht, siehe Tabelle 5 für eine Zusammenfassung. Die herkömmliche Zelle Zählverfahren eine Zählkammer ist eine kostengünstige Methode, die sehr wenig zusätzlichen Reagenzien oder effo erfordertrt vorzubereiten und auszuführen. Darüber hinaus quantifiziert diese Methode eine absolute Zellzahl in Zellen / ml 14. Es gibt jedoch schwerwiegende Nachteile, was die zeitraubende Natur der Zellzählung umfassen Raten hoch Fehler, der in großen Standardabweichungen zwischen Zählungen führt, und die Tatsache, daß ein hoher Bereich von Zellzahlen notwendig sind für eine genaue Zellzählungen. Dies kann in Figur 2a zu sehen ist, wo die Zellzählung Hämozytometer zeigten unterschiedliche Ergebnisse bei den niedrigen Zelldichten und eine große Standardabweichung bei den späteren Zeitpunkten. Diese Nachteile machen diese Methode nützlich für die Zellzählung von kleinen Probengrößen und unzureichend für größere Hochdurchsatzmessungen, wo kleinere Plattengrößen und Einsaatdichten erforderlich sind. Diese Einschränkungen können gelindert werden, wenn die Zelldichte erhöht wurde, so daß die minimale Anzahl von Zellen bei einer Schwelle von mehr als 100 Zellen gezählt begann. Je mehr die Zellsuspension verdünnt oder in die Zelle d senkenichte, die größere Chance Zählen weniger als 100 Zellen und daher die Variabilität Erhöhung zwischen 15 nachbildet. Jedoch ist dieses Verfahren ungeeignet für eine 96-Well-Platte, aufgrund der geringen Zelloberflächenbereich und damit die unzureichende Anzahl von Zellen, die in der Analyse verwendet werden kann. Dies unterstreicht den Mangel an hohen Durchsatz Fähigkeiten dieses Verfahren und ein klarer Nachteil für die Benutzer, die diese Fähigkeit benötigen. Die Lumineszenz basierenden Assays bestimmt durch Messung der Menge an ATP Lebensfähigkeit der Zellen, die 16 ist ein Maß für die Anwesenheit von metabolisch aktiven Zellen ist. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening von mehreren Proben in einer 96-Well-Plattenformat ausgelegt Zellproliferation zu bestimmen. Diese einfache Methode quantifiziert Zellproliferation als eine relative Lumineszenz-Einheit (RLU) mit einem Plattenleser verwendet, die auf die ATP, die in den metabolisch aktiven Zellen proportional ist. Jedoch ist der Hauptnachteil dieser Methode ter Kosten für das Reagens und die Abhängigkeit der Messung auf der Stoffwechselaktivität der Zellen. Verschiedene Zellkulturbedingungen, wie Temperatur oder Zellzyklus - Zeitpunkten, kann leicht die Menge an ATP von den Zellen produziert beeinflussen, die direkt proportional zu dem Leuchtsignal wird durch den Test 17 ​​erzeugt. Daher ist es wichtig, empirisch zu bestimmen, dass die Bedingungen des Versuchs nicht mit der Stoffwechselaktivität der Zellen stören und potenziell die relative Lumineszenzsignal von den Zellen erzeugten behindern. Das dritte Verfahren zur Bestimmung von Zellproliferation untersucht war eine Lebendzell Imager und Software eine relative Zellzahl auszuführen. Die Zelle hat Imager Hochdurchsatz-Funktionen, da es automatisiert werden kann mehrere Bilder für jede Vertiefung, in Echtzeit zusammen mit Temperatursteuerung, unter Verwendung der gleichen Zellen über die Dauer des Tests zu erfassen. Wie in 4 gezeigt ist , kann die Zellproliferation m seinonitored in der gleichen Platte über einen Zeitverlauf, die zusammen mit Zellzählung Analyse zusätzliche Informationen über die Zellpopulation zur Verfügung stellen kann. Dies ist sehr vorteilhaft, da sie Querplatte Variabilität und Zellaussaat Fehler beseitigt, die in 96-Well-Plattenformate alltäglich ist. Die Software der Zellenabbildungsvorrichtung begleitende ermöglicht die quantitative Bestimmung von Zellzahlen , die Parameter in Tabelle 2 und 3 skizziert werden. Es ist daher sinnvoll, in einem Hochdurchsatzaufbau und kann leicht an andere Assays gemultiplext werden, um zelluläre Funktionen wie die Apoptose oder die Zytotoxizität zu messen. Ein wesentlicher Nachteil des Systems ist die Software, die in ihrer Fähigkeit, zu spalten rührenden Objekte beschränkt ist. Während es diese Funktion in unteren Einmündung Zellen durchführen kann, ist es eine wesentliche Einschränkung des Assays und somit zelltypspezifische Optimierung erfordert. Auch während eines einzelnen Versuche Imager unter Verwendung sehr geringen Kosten auf einer Platte-für-Platte Maßstab Dieses Verfahren würde aufly kostengünstig sein, wenn das Gerät bereits in einem Labor eingerichtet ist. Daher stellt dies ein neuartiges Verfahren für die Zellproliferation von kultivierten Zellen zu messen, und hat den großen Vorteil, keine zusätzlichen Reagentien erfordern, und in der Lage ist 96-Well-Platte automatisierte Zählung dieses Verfahren geeignet für Hochdurchsatzanalyse zu machen. Dies ist eine wesentliche Verbesserung auf dem konventionellen Hämozytometer Zell Zählverfahren und ist ein kostengünstiger Option zur Lumineszenz basierenden Assays. Der entscheidende Schritt, wenn die Zelle-Imager unter Verwendung ist bei der Analyse der aufgenommenen Bilder und anschließender Zellzahl pro Bild. Diese Bilder können unter Verwendung einer Anzahl von Zellbildgebungsplattformen verarbeitet werden. Es ist daher von größter Bedeutung, die am besten geeignete Software für den Zelltyp in Untersuchung zu bestimmen. Es wäre nützlich, um die Zellzahlen aus den Bildern von der Zelle Imager mit unterschiedlichen Imaging-Software erworben zu validieren. Dieses Protokoll könnte ein angewendet werdeny kultivierten Zellen, jedoch sind die Analyseparameter definiert für jede Zelllinie werden müssten. Dies kann Zeit sein, auf den ersten raubend, aber sobald die Parameter eingestellt worden sind, kann das Verfahren zu einem Zeitpunkt, zu Bild ganze Platten automatisiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Assays in der Tat ein indirektes Maß für die Proliferation sind, da sie die Zellzahl (Hämozytometer, Zell Imager) messen, oder die Stoffwechselaktivität (Lumineszenz basierenden Assays), die über einen Zeitraum. Diese Methoden können leicht zu messen andere wichtige Faktoren geändert werden, die Proliferation beeinflussen können. Zum Beispiel kann das Trypanblau-Ausschluss - Verfahren leicht in beiden Verfahren die Zählkammer oder Zell Imager integriert werden tote Zellen auszuschließen und damit die Lebensfähigkeit der Zellen 13 bestimmen. Die Lumineszenz basierenden Assays kann mit einem Zytotoxizitätstest gemultiplext werden, um zusätzliche Informationen über die Zellgesundheit zu schaffen, und die Stoffwechselaktivität bei diesem Test gemessen wird, ist auch eine Messung der Zell viabikeit 12. Daher kann die Flexibilität dieser Assays mit anderen Assays gemultiplext zusätzliche Informationen bereitzustellen zellulare ist ein starker Vorteil, jede dieser Methoden. Dieses Protokoll verwendet, um die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MCF-7, die mit dem lego-iG2-puro + Vektor enthält das GFP-Gen stabil transduziert wurden. Dies ermöglicht die Verwendung des GFP-Optik Filter zur Bild die Zellen, ohne die Notwendigkeit, irgendwelche Farbstoffmittel in das Kulturmedium hinzuzufügen. Dieses Verfahren kann leicht an image GFP-negativen Zellen oder primäre Zelllinien modifiziert werden, entweder durch die Zellen Abbilden des Hellfeldoptik-Typ, oder durch Markierung der Zellen mit einem Proliferationsmarker verwenden. Die Verfahren im Vergleich in diesem Protokoll sind robust genug, um in einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien verwendet werden, aber die optimale Protokolleinstellungen für jede einzelne Zelllinie sollte zuerst bestimmt werden. Imaging von Zellen des Hellfeldkanals unter Verwendung stellt die beste Option für die primäre cells oder solche, die langsam wachsen, aufgrund der langfristigen Charakter dieser Methode sind. End-Punkt-Assays, wie beispielsweise die Lumineszenz basierenden Assays, sind nicht gut geeignet für die Analyse von Langzeit-Zellwachstum. Dieses Protokoll wurde zur Messung der Zellproliferation in vitro drei unterschiedliche Verfahren beschrieben. Jede Methode kann routinemäßig im Labor durchgeführt werden, das Zellwachstum zu messen und die meisten Labors würden die notwendigen Fähigkeiten besitzen eine dieser Methoden durchzuführen. Allerdings gibt es auch eine Reihe von anderen Assays für sich teilende Zellen zu messen. Diese können Verfahren umfassen , die DNA - Synthese zu messen, metabolische Aktivität, assoziierte Antigene der Proliferation oder ATP - Konzentration 9. Zum Beispiel wurde eine Reihe von Tests wurde die Rate der DNA-Synthese der Zellen durch Markierung Zellen mit einer radioaktiven Substanz, wie beispielsweise 3 H-Thymidin gemessen entwickelt. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die offensichtliche Verwendung radioaktiver Substanzen und deren Entsorgung. AndereMethoden , die zur Messung der Zellproliferation routinemäßig verwendet werden , umfassen die Verwendung von BrdU - Markierung von DNA neu gebildet, die unter Verwendung von Durchflusszytometrie 18 gemessen werden kann. Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um sowohl die Zellzahl als auch Zellzyklus Informationen zu analysieren. Dies kann ein vorteilhaftes Ergebnis für bestimmte Versuche sein, jedoch sind die Nachteile dieses Verfahrens umfassen die zusätzliche Zeit und Schritte, teure Reagenzien und eine erhöhte Benutzer ausgebildeten Fähigkeiten, um 18 das Durchflusszytometer und Analyse der resultierenden Daten zu betreiben. Daher gibt es viele verschiedene Assays zur Verfügung Wissenschaftler das Wachstum von Zellen zu bewerten, und die gewählte Methode ist weitgehend abhängig von der verwendeten Zelltyp, dem Benutzer und deren Fähigkeitsniveau und die Art der Daten am Endpunkt des Versuches erforderlich. Abschließend wurden drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation im Vergleich Brustkrebszellen verwendet wird. Jede Methode hat viele Vorteile und disadvantages und ist daher benutzerabhängig und basierend auf ihren Anforderungen für jedes Experiment in Bezug auf die am besten geeigneten Assay-Bestimmung Zellzählung durchzuführen.

Der Tumor - Suppressor - Gen, p53, ist ein wesentlicher Regulator von einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 1. Es ist verantwortlich für genomische Stabilität beibehalten wird, und ist daher von entscheidender Bedeutung, das Gleichgewicht von Zelltod und Zellwachstum aufrechtzuerhalten. Mutationen in p53 sind häufig in Krebs und sind die Hauptursache der p53 - Inaktivierung zu unkontrollierter Zellproliferation Krebs führenden 2. Interessanterweise p53 - Mutationen in machen nur etwa 25% der Brustkrebse 3, was vermuten lässt , dass andere Mechanismen für den Verlust der p53 - Funktion verantwortlich sind. Die kürzlich entdeckten p53 - Isoformen wurden in einer Reihe von menschlichen Krebsarten überexprimiert gezeigt zu werden, und kann p53 - Funktion 4,5 modulieren. Wir haben gezeigt, dass die zuvor p53 Isoform, Δ40p53, ist die stark exprimiert Isoform bei Brustkrebs und deutlich in Brustkrebszellen hochreguliert wird, wenn in den normalen benachbarten tiss verglichenue 6. Im Anschluss daran transduzierten wir stabil den menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-7 Δ40p53 mit dem lego-iG2-puro + Vektor (GFP +) 7 überexprimiert. Diese Zellen wurden verwendet, um zu untersuchen, ob hohe Δ40p53 Ausdruck erhöht die Zellproliferationsraten in Brustkrebszellen. Es gibt viele direkte und indirekte Methoden der Zellproliferation von kultivierten Zellen in vitro 8,9 gemessen wird . Diese können entweder als kontinuierliche Messungen über die Zeit durchgeführt werden, oder als Endpunkt - Assays 10. Herkömmliche Verfahren sind immer noch nützlich, wie beispielsweise Zellzählung unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieser Assay ist eine kostengünstige und direktes Maß für die Zellzahl, es gibt aber verlassen sich auf große Zellzahlen und hoch qualifizierten Trainingsfehler und großen Standardabweichungen von den Zählungen zu minimieren. Die Notwendigkeit, die Messungen durchführen kompatibel mit Hochdurchsatz-Format hat zur Entwicklung von Multi-Well-Platte-Assays führte. Diese Lumineszenz-basierten Assays Measure Zellzahlen auf einem Leuchtsignal basiert, die auf die Stoffwechselaktivität der Zelle 11,12 proportional ist. In jüngerer Zeit hat die Einführung von hohen Gehalt Bildgebungsplattformen für neue Werkzeuge erlaubt , die Zellproliferation zu überwachen , während quantitative und qualitative phänotypischen Datenerfassung, und enthält eine Vielzahl von Systemen 13. Alle diese Verfahren bieten Wege Zellwachstum entweder durch kontinuierliche Messung oder Endpunktassays und besitzen jeweils eine Reihe von Vor- und Nachteile in Bezug auf Empfindlichkeit, den Durchsatz von Musternummern und Zelleninformation, welche alle entsprechend abgewogen werden je kann zu messen auf die Forschungsfrage. Dieses Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation in vitro, wobei jedes Verfahren verschiedene Bereiche der Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Multi-Well - Plattenformate verwendet. Dieses Protokoll zum Ziel, die Verwendung eines Hämocytometer Zählen cha zu vergleichenmber eine Lumineszenz basierenden Zelllebensfähigkeitstest und Zell Imager, in der Messung der Zellproliferation über einen Zeitverlauf 96 Stunden. Dazu wurde das Wachstum von Vektor-transduzierten Zellen (MCF-7-LeGo) im Vergleich zu Zellen transduziert zu überexprimieren Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), drei unterschiedliche Zelldichten verwenden. Zellproliferation wurde alle 24 Stunden gemessen, bis zu 96 Stunden. Jede Methode wurde gefunden, seine eigenen Vorteile und Nachteile haben, und je nach dem Ziel des Experiments jeweils noch eine wertvolle Methode für Informationen über die Proliferationsrate bereitstellt.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &amp;micro;g/ml insulin and 1 &amp;micro;g/ml puromycin</td></tr><tr><td>L-glutamine solution (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Dilute to 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask, 75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;growth area</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate, flat bottom</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Improved Neubauer Hemocytometer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Luminescence-based assay</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging</td></tr><tr><td>Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparison of three different methods for determining cell proliferation in breast cancer cell lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

Zur Untersuchung der verschiedenen Methoden, die Proliferation von kultivierten Zellen zu messen, die Zellproliferation von MCF-7-Zellen transduziert Δ40p53 wurde im Vergleich zu den nicht-transduzierten MCF-7-LeGo Brustkrebszelllinie. Die drei Verfahren , die verglichen wurden , - das herkömmliche Verfahren Hämozytometer, die Lebensfähigkeit der Zellen Lumineszenz - Assay und Zellabbildungs ​​Auswertung- in der schematischen Darstellung (Abbildung 1) beschrieben werden. Jede Methode hat Vorteile und Nachteile genau Zellzählung über die Zeit zu messen und die effektivste Methode hängt von den Anforderungen Endpunkt des Experiments und die Informationen, die für eine Zellpopulation erfasst werden kann. Das Wachstum von MCF-7-Lego und MCF-7- Δ40p53 Zellen wurden 4 Tage nach 24 h gemessen. Wie in 1 gezeigt ist , wurden die beiden Zelllinien bei drei verschiedenen Zelldichten ausgesät (1,5 x 10 3 </snach oben&gt;; 3 x 10 3; 5 x 10 3 Zellen / Vertiefung) und Zellzählung wurde durchgeführt , 24, 48, 72 und 96 h nach dem Aussäen. Jede Methode zeigte erhöhte Zellproliferation, die unter Verwendung eines Hämozytometers, eine Lumineszenz basierenden Assays, und eine Zelle Imager (Figuren 2a, b und c, jeweils) über 96 Stunden. Die größte Zunahme der Zellproliferation wurde bei der höchsten Zelldichte (5 x 10 3 Zellen) zu sehen, und zeigte auch die am besten reproduzierbaren Ergebnisse zu jedem Zeitpunkt, was darauf hindeutet , das die optimale Zelldichte in diesen Zellen zur Messung der Proliferation zu sein. Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der Zellproliferation zwischen den Zelllinien. Die Messung der Zellproliferation zwischen den verschiedenen Methoden wurde durch eine lineare Regressionsanalyse 6 (; Tabelle 4 3) verglichen. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen jeder der verschiedenen Verfahren getestet, bei einem Vergleich cell - Proliferation bei allen Zelldichten in beiden Zelllinien (3a und b). (; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, Figur 3a und b jeweils R 2 = 0,8899, p ≤0.0001) die stärkste Korrelation zwischen dem Vergleich der Lumineszenz basierenden Assays, und der Zellenabbildungsvorrichtung beobachtet. Eine visuelle Darstellung der Zellproliferation , die Zell Imager gezeigt (Abbildung 4). Da dieses Verfahren kontinuierliche Messungen einer einzelnen Platte verwendet, können die Zellen alle 24 Stunden abgebildet werden, bis die Zellen nahe an 100% Konfluenz erreichen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die Wachstumsraten der MCF-7-lego und MCF-7-Δ40p53 Zellen in allen Zeitpunkten vergleichbar. Diese Methode liefert nützliche zelluläre Informationen, einschließlich in der Lage, visuell das Zellwachstum über mehrere Tage zu überwachen, und die Zellgröße und Zell Morpho vergleichenlogie zwischen den verschiedenen Zelllinien. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der drei verschiedenen Methoden Zellproliferation Messzellen wurden bei drei verschiedenen Zelldichten ausgesät in mehrere 96-Well - Platten und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für bis zu 96 Stunden.. Jede 24 Stunden, die Zellproliferation entweder durch Verwendung eines Hämocytometer, einen Lumineszenz-basierten Assays oder Cell Imaging gemessen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Zellproliferation Messungen nach 96 Stunden Zellzählungen wurden alle 24 Stunden für 96 Stunden in MCF-7-LEG gemessenO und MCF-7-Zellen Δ40p53 an drei unterschiedlichen Zelldichten beimpft. Zellzählungen wurden unter Verwendung eines (a) Hämocytometer in Zellen / ml, (b) unter Verwendung eines Lumineszenz basierenden Assays in relativen Lumineszenz - Einheiten (RLU) oder (c) eine kontinuierliche Zellzahl unter Verwendung einer Zelle Imager in Zellen / Bild gemessen. Die Bedingungen für die Zelle Imager in Tabelle 2 Alle Versuche stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten ± SD gezeigt werden <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig3.jpg" /> Abbildung . 3: Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Messung von Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien Eine lineare Regressionsanalyse wurde durchgeführt , um die korrelative Beziehungen zwischen den verschiedenen m zu vergleichen<html> ethoden zur Messung der Zellproliferation in (a) MCF-7-Zellen LeGo und (b) MCF-7-Zellen untersucht Δ40p53. Ein Pearson-Korrelationskoeffizient wurde berechnet und die Signifikanz wurde bestimmt (p &lt;0,05) zwischen den verschiedenen Meßmethoden Zellproliferation. Alle Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54350/54350fig4.jpg" /> Abb . 4: Bilder von GFP-positiven MCF-7-Lego und MCF-7-Brustkrebszellen Δ40p53 Repräsentative Bilder der Zellen von 5 x 10 3 ausgesäten Zellen alle 24 Stunden unter Verwendung eines Zell - Imager erfasst. Der Maßstab repräsentiert 1000 um. Parameter für die Zell-Bildgebung sind in Tabelle 2 zusammengefasst.<html> href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Zelldichte (Zellen / Vertiefung) </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> 1,5 x 10 3 </td><td> 3,0 x 10 3 </td><td> 5 x 10 3 </td></tr><tr><td> MCF-7-lego </td><td> 76 &amp; mgr; l in 8,4 ml Medium </td><td> 152 &amp; mgr; l in 8,3 ml Medium </td><td> 254 &amp; mgr; l in 8,2 ml Medium </td></tr><tr><td> MCF-7-Δ40p53 </td><td> 93 &amp; mgr; l in 8,4 ml Medium </td><td> 185 &amp; mgr; l in 8,3 ml Medium </td><td> 308 &amp; mgr; l in 8,2 ml Medium </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zellbesiedelung von Volumes für 96 - Well - Platten. &quot;Fo: keep-mit-next.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Parameter lesen </td></tr><tr><td> Plattentyp </td><td> 96 gut </td></tr><tr><td> Modus </td><td> Image </td></tr><tr><td> Objektiv </td><td> 2.5X </td></tr><tr><td> Farbe </td><td> GFP (469, 525), Hellfeld </td></tr><tr><td> Belichtung </td><td> Auto </td></tr><tr><td> Fokus </td><td> Auto (Scan dann Autofokus) </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Parameter lesen für Cell Imaging Mit dem Handy Imager. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Imaging-Parameter </td></tr><tr><td> Schwelle </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> Minimale Objektgröße (um) </td><td> 30 </td></tr><tr><td> Maximale Objektgröße (um) </td><td> 300 </td></tr></tbody></tLage&gt; Tabelle 3: Bildgebungsparameter für Zellzählung Analyse. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> MCF-7-lego </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> R - Quadrat </td><td> p-Wert </td></tr><tr><td> Hemocytometer vs. Lumineszenz-basierten Assays </td><td> 0,6301 </td><td> 0,0021 </td></tr><tr><td> Handy - Imager vs. Hemocytometer </td><td> 0,7524 </td><td> 0,0003 </td></tr><tr><td> Lumineszenz-basierten Assays vs. Zelle Imager </td><td> 0,8899 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> MCF-7-Δ40p53 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> R - Quadrat </td><td> p-Wert </td></tr><tr><td> Hemocytometer vs. lumineszenz basierten Assay </td><td> 0,8983 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> Handy - Imager vs. Hemocytometer </td><td> 0,9303 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> Lumineszenz-basierten Assays vs. Zelle Imager </td><td> 0,9805 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Die lineare Regressionsanalyse der drei verschiedenen Verbreitungsmethoden getestet. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Methode </td><td> Vorteile </td><td> Nachteile </td><td> Technische Hinweise </td><td> Die fertige Ausgabe </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hemocytometer </td><td> Kostengünstig </td><td> Hohe menschliche Fehler </td><td> mehrere Male Pipette auf Einzelzellsuspension herzustellen </td><td rowspan="4"> Zellen / ml </td></tr><tr><td> Erfordert minimale Ausrüstung </td><td> Erfordert Einzelzellsuspension </td><td> Führen Sie mehrere Zählungen Genauigkeit zu erreichen </td></tr><tr><td> Direkte Zellzahl </td><td> Hohe Anzahl von Zellen für die genaue Beurteilung der Zellzahl erforderlich </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Endpoint </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> Lumineszenz basierenden Assays </td><td> Verwenden Sie mit Multi-Well-Plattenformate </td><td> Teure Reagenzien </td><td> Vor Licht schützen </td><td rowspan="6"> Relative Leuchteinheiten (RLU) / Well </td></tr><tr><td> Leicht durchzuführen </td><td> Erfordert Leuchtplattenleser </td><td> Fügen Sie Kontrollvertiefungen Hintergrund Lumineszenz zu bestimmen </td></tr><tr><td> Schnell-Test </td><td> Temperaturempfindliche </td><td></td></tr><tr><td> Bietet die Lebensfähigkeit der Zellen Informationen </td><td> Variabel in Abhängigkeit von Stoffwechselaktivität von Zellen</td><td></td></tr><tr><td></td><td> indirekte Messung </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Endpoint </td><td></td></tr><tr><td rowspan="6"> Handy - Imager </td><td> Kontinuierliche Messung </td><td> Teure Imager </td><td> Stellen Sie sicher, Zelle Imager ist auf 37 ° C </td><td rowspan="6"> Zellen / Bild </td></tr><tr><td> Temperaturkontrolle </td><td> Geschicklichkeit intensive </td><td> Vermeiden Sie unnötige Erschütterungen oder Unterbrechung der Zellen </td></tr><tr><td> Bietet zellulären Informations </td><td> Variable je nach Zusammenfluß von Zellen </td><td></td></tr><tr><td> Kostengünstige (wenn Sie den Imager) </td><td> Relative Zählung </td><td></td></tr><tr><td> Eine direkte Messung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Automatische Abbildung von Multi-Well-Plattenformat </td><td></td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabelle 5: Vergleich der Vor- und Nachteile der verschiedenen Zell Zählverfahren.

Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines at JoVE.com

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

comparison-three-different-methods-for-determining-cell-proliferation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Aufrufe.  Hunter Medical Research Institute. This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Serie: Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Forschung

Krebsforschung

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

Zerstörungsfreie Bewertung der regionalen Zelldichte innerhalb von Tumoraggregaten nach medikamentöser Behandlung

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Herstellung und Analyse von<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Biotechnik

Pharmakologisches Targeting von Ionenkanälen zur Behandlung solider Tumore

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Rolle von Ionenkanälen bei Krebs: Charakterisierung und mögliche Behandlungsansätze 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Immunologie und Infektion

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biologie

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Zerstörungsfreie Bewertung der regionalen Zelldichte innerhalb von Tumoraggregaten nach medikamentöser Behandlung

Herstellung und Analyse von

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Screening von Ionenkanälen in Krebszellen

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes