Name: observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans at

Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&amp;D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health &amp; Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).

1. בדיקות תיוג עם Digoxigenin-dUTP ידי PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תיוג PCR עם 10x תמהיל dNTP המכיל digoxigenin-dUTP כפי שתואר לעיל 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מוצר PCR עם טיהור ספין-טור על פי ההוראה של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החללית היא קצרה יותר מ -200 נ&quot;ב, להסיר digoxigenin-dUTP חינם עם כרומטוגרפיה ספין-טור מתערובת התגובה ולא טיהור ספין-טור. </li></ol></li></ol> 2. הכנת שקופיות מצופות polylysine הערה: התהליך כולו אורך כ -2 שעות. רוב השלבים מתבצעים בטמפרטורת חדר למעט שלב הייבוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות במיכל פלסטיק ולשטוף את השקופיות בקצרה עם מים מזוקקים (DW). הסר את המים ולמלא את המיכל עם DW המכיל נוזל לניקוי זכוכית 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתסיס את השקופיות במשך 15 דקות ב 50 סל&quot;ד בטמפרטורת החדר (RT). שטפו את השקופיות עם DW 3פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות עם אתנול 70% במשך 15 דקות עם תסיסה. מחק 70 אתנול% ומקום השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש במשך 15 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי polylysine של שקופיות זכוכית רבות גם הערה: ציפוי polylysine זכוכית שקופית הוא צעד חשוב, שכן הוא מספק את ההידבקות המדגמת לאורך כל ההליך המכתים. גרוע שקופיות מצופות תגרומנה לאובדן של מדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון polylysine המניה ל -0.01% (w / v) במים מזוקקים. הוסף 20 μl של% 0.01 בדילול (w / v) polylysine אל הבארות של שקופיות זכוכית נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות הזכוכית במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות על גוש יבש 65 ° C ו-אוויר יבש 1 hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות polylysine בתיבת אבק חינם. </li></ol></li></ol> 3. קיבוע של תולעים בשקופית זכוכית (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים הכנות לקראת FISH הערה: תולעים קציר לפני כל tהוא מחיידקים שבמזון הוא נצרך על ידי צפיית תקשורת הצמיחה תחת מיקרוסקופ. רעב מפחית ייצור ביצים של תולעים בוגרות ומגביר בקיעת ביצה. שיטות מפורטות מתוארות 14,15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התולעים 50 מ&quot;מ פטרי צלחת פי שיטות סטנדרטיות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל אוכל החיידקים הוא נצרך, לחתוך את התקשורת אגרה רבעון עם מרית. לעקר את המרית לפני החיתוך על מנת למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את כל פיסת אגר על צלחת התקשורת צמיחה נמטודות 100 מ&quot;מ (NGM). להפוך את הפיסה אגרה במהופך עבור התולעים להגיע מזון חיידקים הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 עד 72 שעות, לאסוף את התולעים עם חיץ M9. להוסיף 3 - 5 מ&quot;ל של חיץ M9 על צלחת NGM. חיץ פיפטה M9 על פני השטח של NGM לשטוף את התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הנוזל עם תולעים ולהוסיף שפופרת 15 מ&quot;ל. הערה: אם ישן לכלוך אגר לאחר הקציר, צנטריפוגה התולעים בתמיסת 30% סוכרוז. בעוד ופסולת pelleted, תולעים לצוף עלהשטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ M9 לפצות את נפח עד 15 מ&quot;ל. גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות ולהסיר את רוב למאגר M9. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. הערה: אם התולעים עדיין צפו לאחר צנטריפוגה, להגדיר את רמת הבלם של צנטריפוגות כדי מעריכה = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ לשאוב M9. הוסף פתרון הלבין את התולעים. לפי 0.5 מ&quot;ל של תולעים, להוסיף 6.5 מ&quot;ל של DW, 2 מ&quot;ל של תת-כלורי, 1 מ&quot;ל של 5 M KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תולעים עם נדנדה ב RT במשך 3 דקות ב 50 סל&quot;ד. תולעים וורטקס למשך 15 שניות כדי לגזור את התולעים מכאניות ולחשוף את הביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהלך לבן. ודא כי תולעים נחתכים בחצי וביצים משתחררות. כאשר רוב של הגוף הבוגר נמס, להוסיף למאגר M9 לפצות את נפח עד 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות. לשאוב רוב M9 ולהוסיף חיץ M9 טרי לפצות את הנפח עד 15 מיליליטר. צעד חוזר על לשטוף 3 פעמים. הערה:הימנע משימוש כמות מוגזמת של תולעים, כפי שהם לעכב את התהליך הלבן. שמור את זמן התגובה הכולל פחות מ -8 דקות עד בכביסה. יתר מולבן ביצים לייצר autofluorescence החזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פוספט בופר עם polysorbate-20 (PBST) עד 200 μl ו -200 μl של paraformaldehyde 4% (PFA) כדי להפוך 2% PFA. זהירות: מאז PFA הוא מסרטנים, ללבוש ביגוד מגן, כפפות מגן עין לפני שימוש PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של ביצים 2% PFA על הבאר של שקופית מצופה polylysine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בתא לח דגירה במשך 15 דקות ב RT. סגור את בתא הלח מייד אחרי המגלשות ממוקמות בתוך. הערה: הביצים ליישב לתחתית של שקופית בעת היותו קבועה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת בלוטות המין גזור לדגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים בוגרות קציר גדל על 50 מ&quot;מ NGM צלחת על ידי pipetting 1 מ&quot;ל של חיץ M9. תולעים קציר לפני מחיידקים שבמזון ייגמרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התולעים מכל שנינות חיידקיםh חיץ M9, 2 פעמים. הערה: שיירי חיידקים עלולים להפריע בלוטות מין הגזורים יידבקו שקופיות מצופות polylysine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התולעים על ידי צנטריפוגה ב 300 x ז. הסר M9 ולהעביר את התולעים לצלחת NGM ריק ידי micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של חיץ M9 המכיל levamisole 2 מ&quot;מ על באר שקופיות מטופלים polylysine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ M9 לצינור 1 מ&quot;ל. השתמש חיץ זה להעביר את התולעים על ידי פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את קצה פיפטה בפה עם חיץ M9 ידי הצבת נימי בצינור 1 מ&quot;ל המכיל למאגר M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, הכניס את קצה הפה פיפטה ממש מול ראש פיפטה בפה תולעת וגרור מבוגר כך שהראש של תולעים נכנס פיפטה בפה. לאחר ראש התולעים נכנס הקצה, הגוף כולו של תולעת יצויר אל הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התולעים לשקופית מצופה polylysine באמצעות פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לחתוך שלf הראש או קצה הזנב של תולעים בשקופית. כאשר התולעת הוא חתך, בלוטות המין תצוץ. בלוטות המין ידבק שקופיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לפחות 30 תולעים היטב אחד. עוד בארות יכולות לשמש 30 תולעים אחרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופית בתא לח לשאוב את למאגר M9 עם פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המדגם על ידי הוספת 20 μl של 2% PFA ב RT במשך 15 דקות בתא לח. </li></ol></li></ol> 4. קיבוע ו Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בלוק אלומיניום על קרח יבש ולאחסן אותו במקפיא עמוק (-80 ° C). מתנול אצטון אחסן -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב קיבעון PFA 3.1.15 או 3.2.11, להסיר מקבע באמצעות micropipette עוזב ~ 5 μl של מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במילים אחרות שקופיות מצופה polylysine בשקופית המדגם. הסר את מקבע עם מגבת נייר אם הפתרון הוא מוגזם. אל תזיז את השקופיות פעם הם תקועים יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את השקופיותעל בלוק אלומיניום עבור 15 דקות לפחות. הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד השקופיות מוקפאות, הכניס את הצנצנות המכילות מתנול קר אצטון על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השקופיות החוצה ולסובב אותם להקפיא-לפצח את המדגם. מחק את השקופית העליונה. מיד להשרות את השקופית לתוך מתנול קר קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות אצטון קר כקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות 3 פעמים עם PBST במשך 5 דקות כדי להסיר מקבע שיורית. המשך לשלב הבא או לאחסן את השקופיות אתנול 100% ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הדגימות יכולות להיות מאוחסנות במשך לפחות 2 - 3 ימים. </li></ol> כלת 5. של תאים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון RNase (PBST המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​RNase). דגירת השקופיות בתא הלח ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית פעמיים ציטראט מלוחים ונתרן 2x עם polysorbate-20 (2x SSCT) במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μl של פתרון הכלאה וקבע בתא לח בחממה 37 מעלות צלזיוס. אחרי השעה 1, להסיר את פתרון הכלאה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסרת פתרון הכלאה, להכין את החללית. אם חללית גדילים כפולה DNA, לפגל חלליות על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על גוש יבש. לאחר חימום, לקרר את החללית על בקצרה קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון הכלאה המכיל בדיקות המדגם. עבור בדיקת PNA, ריכוז שימוש ביחס של 1: 2,000 ועבור בדיקת DIG שכותרתו, ריכוז שימוש ביחס של 1: 200. מכסים את המדגם עם מכסה זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים מגבת נייר ספוגה במים על הגוש החום (80 מעלות צלזיוס). לשים כיסוי קופסת פלסטיק על גוש חום כדי לשמר את הלחות והטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטמפרטורה של גוש החום התייצבה (עד 80 מעלות צלזיוס), במקום להחליק המדגם על מגבת נייר המחוממת לכסות את הדגימות עם כיסוי קופסא הפלסטיק. לפגל את המדגם עבור 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incאובאטה השקופיות בתא לח לילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 6. מתרחץ Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הפתרון לשטוף הכלאה (2x SSC, 50% לפוראמיד) ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם ב PBST פעמים ב RT במשך 5 דקות. הסר את מכסה הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם בפתרון לשטוף הכלאה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שקופית המדגם ב PBST 3 פעמים ב RT. הערה: בצע את כל השלבים הבאים בתא לח ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון חסימת דגירה במשך שעה 1 ב RT בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון חסימת ולהוסיף FITC פתרון נוגדן אנטי digoxigenin מצומדות (1: 200) במשך 3 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> שמה ותצפית 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השקופית מדגם עם PBST 2 פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של פתרון הרכבה עם DAPI. החזר את מכסה הזכוכית ולחץ בעדינות. הסר פתרון עודףעם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אידוי של פתרון גובר, לאטום את הקצוות של זכוכית המכסה עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב תחת מיקרוסקופ confocal. אל תכלול עובר עם רקע גבוה. דגש על תחום בעל 4 - 20 גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות על פי ההוראה של היצרן עם עדשה אובייקטיבית 100X. הערה: Excite המדגם עם לייזר 405 ננומטר עבור DAPI, עם 555 ננומטר לייזר עבור Cy3, עם 488 ננומטר לייזר עבור FITC. </li></ol> 8. כימות איתותים הטלומרים הערה: כימות נעשה כפי שתואר לעיל 16. כל התמונות כי הם להיות לעומת צריך לקחת עם אותה הגדרה כולל זמן חשיפה ומקור אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את התמונה .tif בפורמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן את תוכנת ניתוח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו את התוכנה וניתוח תמונה ולחץ מסכים כפתור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן פתוח. פתח את התמונות עם FISH הטלומרים ידי לחיצה כפולה על קובץ התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נְקִישָׁה[עריכה] - [אזור עיבוד בחר], באזור הנבחר של ריבית על ידי שמאל לחץ וגרירה. אל תכלול את כל המכתים הלא ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ [מידה] - [נקודת צפיפויות אופטיות], בחר בערוץ עם אות הטלומרים והזן את שם הקובץ כדי לשמור את התוצאות בקובץ .txt. הערה: העמודה של התוצאות לפי הסדר הבא: הקרינה של נקודה, עוצמת רקע של ספוט שטח של המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב את הספרות ולחסר עוצמת רקע של מקום מן הקרינה של נקודה. הערכים כעת ניתן לנתח סטטיסטית. </li></ol>

<ol>
	<li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review.">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li><li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions.">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189 (2015).</li><li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+lengthening+of+telomeres:+models,+mechanisms+and+implications.">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li><li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase.">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li><li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+measurement+by+quantitative+PCR.">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).</li><li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans.">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30 (2005).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis.">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes.">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li><li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li><li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways.">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, 305-313 (2013).</li><li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li><li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+meiosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans.</a> Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , 171-195 (2009).</li><li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR.">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019 (2012).</li><li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy.">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li><li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery.">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li><li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads.">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans.">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+(Q-FISH).">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, 14 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא הפשטות של ההליך ללא נזק בולט את המורפולוגיה של המבנה התאי. צעדים אחדים היו אופטימיזציה עבור ג elegans FISH בפרוטוקול זה. השלבים הקריטיים לדגים מוצלחים כוללים תיוג של בדיקות, קיבעון של עוברים וחדירים. שיטת תיוג Digoxigenin-dUTP מספקת שיטת תיוג קלה לשימוש על ידי PCR או ניק-תרגום. כדי לתייג רצף יעד ארוך, ניק-תרגום הוא מועדף. במקרה זה, חלליות צריך להיות מעוכל עם אנזים הגבלה מתאים כדי להקל על החדירה של בדיקות. התג ביוטין-dUTP אינו מומלץ בגלל בדיקות שכותרתו ביוטין מיוצרות סכום עודף של אות רקע מן הציטופלסמה. למרות מגיב חסימה ביוטין אנדוגני זמין מסחרי, זה לא היה ניסיון. פרוטוקול זה משתמש עוברי מבודד כדי להגדיל את הצפיפות של תאי כימותים יעילים. גרעיני מעיים של C. elegans הם גדולים, והם נמצאים polyploid, אשר תורמים מספר מוגזם ועוצמת כתמים הטלומרים בהשוואה לשאר גרעינים סומטיים. מסיבה זו, התולעת כולו אינה מתאימה כימות של הטלומרים ב C. elegans. לעומת זאת, עובר מתאימים להערכת אורך הטלומרים כפי שהם מספקים תאים הומוגנית ללא השפעת polyploidy. פרוטוקול זה משתמש 2% מקבע PFA כי עבד מצוין לדגים הטלומרים. למרות glutaraldehyde מדווח לגרום אות רקע נמוך קיבעון יותר ב RNA הכלאה באתרו, glutaraldehyde גדל autofluorescence 18 באופן משמעותי. רקע עודף זה לא בוטל לאחר טיפול של borohydride נתרן, אשר מפחית קבוצת אלדהיד unreacted. מסיבה זו, glutaraldehyde לא היה בשימוש. אם יחס אות לרעש נמוך, זמן של prehybridization יכול להתארך עד כמה שעות כדי לחסום אתרים הלא ספציפיים מחייבים. בבנוסף, זמן של כביסה מחמירה ניתן להגדיל להקטין את רמת רקע. טכניקה מכתימה ב סי אלגנס יכול להיות אתגר עבור טיפול permeabilization נכון. ג elegans מכיל שלד cuticular עבה אשר מעכב חדירת נוגדנים בדיקות. שיטה מכתימה נוגדן מסורתי כרוכה בטיפול collagenase, אשר דורש הרבה זמן תהליך האופטימיזציה. השיטה חדירה האנזימטית גם נזקים המורפולוגיה של תולעים בתמורה של יעילות החדירה. Freeze-סדק וטיפול מתנול-אצטון שמש להקל על חדירת בדיקה. Freeze-הסדק הוא פשוט ומהיר בהשוואה לטיפול chitinase או yatalase 19. התייבשות או התייבשות של סדרת מתנול לא נראה להשפיע על איכות FISH. צעדים אלה היו פשוט יותר בפרוטוקול זה. למרות זאת נמסרה כי עיכול proteinase K נדרש עבור RNA כלאה באתרו19, הבדל ברור לא נצפה בין תוצאות FISH הטלומרים עם ובלי טיפול K proteinase. בנוסף, להקפיא פיצוח של עוברים בתנאי שיטה קלה לשימוש המאפשר הדמיה תאים רבים בעת ובעונה אחת על מטוס בודד מוקדי לניתוח כמותי גדול. באמצעות בדיקת PNA, אות הטלומרים הוגדלה באופן משמעותי בהשוואה לזו המתקבלת עם בדיקת DNA. זה יכול להיות בגלל זיקה מחייבת גבוהה עבור היעד שלה משלימים גודל קטן יותר שלה (3 חוזרים לעומת 4 חוזר). Fluorescently שכותרתו בדיקת PNA גם ישירות נקשרת היעד שלה, מזעור השלבים הבאים. זיקה חזקה מתוחזק בשלבי immunofluorescence הבאים הופכת את הפוסט-הקיבעון מיותר, אשר ניתן למנוע רעש רקע. עם זאת, מספר מגבלות קיימות בטכניקה זו. האחת היא כי permeabilization צעד פוגע המורפולוגיה מעט במחיר של חדירת בדיקה יעילה. טיפול של בלוטת מיןים ועובר עם מתנול אצטון מעווה מעגלי של גרעינים לעומת קבוצת ביקורת. בניסויים הדורשים מורפולוגיה שמורה להפליא, שיטת permeabilization שונה צריכה להיות ניסיון. נוסף הוא כי האות הטלומרים הוא לכמת ביחידות כלשהן. זאת בעיקר בשל הבדלים בין ניסויים עצמאיים. דנ&quot;א ריבוזומלי עשוי להיחשב בקרה פנימית לנרמל כל דגימה. ניתן למצוא עוד שיטות שימושיות בהתייחס 20. פרוטוקול FISH הטלומרים פשוט מתואר כאן, מחייב צעדים מינימאליים. צעדים רבים מופחתים לניתוח של כמות גדולה של עוברים. עם זאת, שינוי נוסף יכול להתבצע עבור אות חזקה, כגון טיפול chitinase לחדירה, וניסויים חדשניים אחרים. בשילוב עם שיטת תרבית תאים, הדמיה סופר-רזולוציה עשויה להיות אפשרית. פרוטוקול זה עשוי לעזור כדי לגלות את מנגנון תחזוקת הטלומרים רומן ב C. elegans.

הטלומרים מגן קצוות כרומוזומליות מן ההיתוך והשפלה סוטים. הטלומרים יונקים מורכב G-עשיר חזרות hexameric, TTAGGG, מתחמי shelterin. רצף חוזרים הטלומרים של נמטודות דומה לאלה של יונקים (TTAGGC). רוב אאוקריוטים לנצל טלומרז להוסיף חזרות הטלומרים למטרות כרומוזומליות שלהם. עם זאת, 10 - 15% של תאים סרטניים לנצל מנגנון עצמאי טלומרז, המכונה אלטרנטיבי הארכת הטלומרים (ALT) 3. בעבר, דיווחנו כי חזרות הטלומרים הרצפים הקשורים אליו, כפי ששמו tAlt, היו מוגברים הטלומרים של קווים מוטנטים טלומרז ששרדו עקרות 2 קריטיות. אורך הטלומרים נמדד על ידי PCR כמוני או על ידי כתם דרום, מספק אורך ממוצע של הטלומרים הכוללים 4,5,6,7. ספירה קראו חוזרים הטלומרים בנתוני רצף הגנום כולו הוא גם אינדיקטור של תוכן הטלומרים הכולל 8. למרות החטאאורך הטלומרים GLE ניתוח (Stela) עשוי לספק אורך הטלומרים יחיד, זה לא יכול לספק מידע מרחבים של הטלומרים 9. בעוד POT-1 :: חלבון הכתב mCherry מספק את המידע המרחבי של הטלומרים in vivo, זה לא יכול לייצג אורכי הטלומרים פעמיים תקועים, כמו POT-1 הוא הטלומרים חד גדיל חלבון מחייב 10. בעוד שיטות הנ&quot;ל לספק את המידע הממוצע של רצפים חוזרים, קרינת הכלאה באתרו (FISH) מאפשרת להתבונן בכמויות ובדפוסים המרחבי של רצפים בודדים של עניין בסולם כרומוזומליות. במקום טיהור DNA, רקמות או תאים מקובעים לשמר את המידע המרחבי יליד בדגים. לפיכך, FISH הוא כלי כמותי ואיכותי הן לצורך השגחה של רצפים חוזרים הפרט, כגון חזרות הטלומרים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה עבור זיהוי סימולטני של שני teloחזרות גרידא אחרות המבוססות על שיפורים מן השיטות שתוארו קודם לכן 11,12. ג זחלים או מבוגרים elegans הם אורגניזם רב-תאי עם תאים מובחנים מאוד. ההטרוגניות של תאים מעכבים על ניתוח כמותי של מספר רב של נקודות הטלומרים. כדי למקסם את מספר התאים נתחו, עובר מבודדים להפיץ בשקופיות מצופות polylysine לדגים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול גם להיות משולב עם immunofluorescence. כהוכחה כי הפרוטוקול עובד, אנו מראים כי אפשר לצפות ולכמת שני רצפים חוזרים שונים. בדיקת DNA נגד TALT1 נוצרה עם PCR פשוט שילוב digoxigenin-dUTP. ואז זה בדיקה TALT1 ו בדיקת PNA הטלומרים שכותרתו קרינה היו הכלאה זמנית. בהמשך לכך, digoxigenin זוהה על ידי שיטות immunofluorescence הקנונית. אנו מציגים כאן את התמונות נציג שבו TALT1 colocalized עם הטלומרים ב TRT-1 </em&gt; ניצולים.

<table><tbody><tr><td>PNA probe</td><td>PANAGENE</td><td>custom order</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>use 1:200 diluted in PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenin-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizaiton solution</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 &amp;#956;g/ml heparin, 100 &amp;#956;g/ml yeast tRNA , 100 &amp;#956;g/ml sonicated salmon sperm DNA</td></tr><tr><td>Hybridizaiton wash solution</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 50% formamide</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>BIONEER</td><td>C-9012</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>make 10 mg/ml for stock solution</td></tr><tr><td>Dextran sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Commercial name is Tween-20</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>prepare fresh 0.01% w/v solution before use</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH</td></tr><tr><td>Antibody buffer</td><td></td><td></td><td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)</td></tr><tr><td>illustra Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L, adjust pH to 7.0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0.1% tween-20</td></tr><tr><td>10x digoxigenin-dUTP mix</td><td></td><td></td><td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR purification columns</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Glass cleaner / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan pure chemicals</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well glass slide</td><td>MP biomedicals</td><td>96041205</td><td></td></tr><tr><td>Nematode growth media</td><td></td><td></td><td>To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.</td></tr><tr><td>Humid chamber</td><td></td><td></td><td>Plastic box filled with paper towel soaked in DW</td></tr><tr><td>Image Analysis Software&amp;nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flintbox.com/public/project/502&quot;&gt;http://www.flintbox.com/public/project/502&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

observation and quantification of telomere and repetitive sequences using fluorescence in situ hybridization (fish) with pna probes in caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

זה היה בעבר דווח כי ניצול ALT יכול לצאת מן מוטציה טלומרז מחסר, TRT-1 (ok410), בתדירות נמוכה ידי שכפול מקומי פנימי &#39;תבנית של ALT&#39; (tAlt) רצפים לצורך תחזוקה הטלומרים 2. באמצעות בדיקת PNA, הצלחנו לחזות הטלומרים ב בלוטות המין הגזורות (איור 2 א). האות הטלומרים הקלוש זוהה הוא TRT-1 (ok410) וניצולת ALT. האות מטושטשת היה חפפו רק עם DAPI, דבר המצביע על כך שהם לא יכולים להיות autofluorescence. הטלומרים דמויים ביניים חוזרים (ITR) הוא ציין באופן עקבי assay TRF בחקר ג elegans הטלומרים 4,10. בהתחשב סגולי גבוהה של חללית PNA, הם צפויים להיות ITR התפזר לאורך הגנום. מספר כתמי הטלומרים היה כ -9 גרעין pachytene ב TRT-1 (ok410).במחקר הקודם, 12 מוקדים נצפו על ידי POT-1 :: חלבון mCherry, אשר נקשר ל- DNA הטלומרים התקועים היחיד 10. מרבים של 24 מוקדים לכל גרעין נצפו עובר הסוג הבר 17. התוצאה מראה כי שיטת הכתב mCherry עדיף לניסוי שבו מספר הטלומרים צריך לספור. עם זאת PNA FISH הוא מסוגל לזהות DNA הטלומרים פעמיים תקועים כמו גם DNA הטלומרים חד גדילי בפרופורציה עם אורך הטלומרים. לעומת זאת, מספר המקומות הטלומרים היה כ 7 ניצול ALT, אשר התמזג הכרומוזומים (N = 3) 2. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם התחזית כי כתמים הטלומרים יהיו 6 ניצול ALT. הגענו למסקנה כי עוצמת האות של ניצול ALT הייתה מספיק כדי לשים לב. אות הטלומרים היה colocalized עם TALT1 ב הניצול ALT, דבר המצביע על כך TALT1 משמש כתבנית עותק הטלומרים בהעדר telomerase (איור 3). אות הטלומרים של ניצולי ALT גדל בהשוואה לזו של מוטציה הורית TRT-1 (ok410), המציין כי הטלומרים נשמרו וחסון בשורדי ALT ללא טלומרז (איור 4). האות של חללית PNA הייתה גדולה יותר מזה של תווית בדיקה-digoxigenin (איור 4). בדיקות עיצוב עם oligomer PNA עלולות לגרום אות חזקה יותר תיוג digoxigenin. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig1.jpg" /> איור 1:. סקירה כללית של ניסוי FISH ביצים נקצר על ידי תולעים בוגרים הלבנה ומותק 2% PFA בשקופית מצופה polylysine. דוגמאות הן להקפיא-סדוק permeabilized עם מתנול אצטון לחדירת בדיקה. בדיקות מתווספות מדגם הכלאה בין הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. החללית שכותרתו Digoxigenin הוא זוהה על ידי immunofluorescence. הדגימות הם צילמו ואז quantifieD על ידי תוכנת ניתוח תמונה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig2.jpg" /> איור 2:. הטלומרים דגים הגזורים בלוטות המין (א) הטלומרים (אדום) זוהה על ידי Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 בקצה הדיסטלי של בלוטות מין (ראש החץ). עוצמת ניצול ALT הוא גדול יותר מזה של TRT-1 (ok410). תמונת Z- מחסנית ניתנה עם הקרנת מקסימלית. גרעינים שמציינים חץ לבן הוא מוגדלים על הפינה הימנית העליונה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (ב) מספר נקודות הטלומרים לכל גרעין בשלב pachytene נמדד על ידי בדיקה ויזואלית. N = 50. ברי שגיאה, SEM. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig3.jpg" /> איור 3:. הטלומרים ו TALT1 הדגים עוברים תמונה מייצגת של הטלומרים (אדום) ו TALT1 (ירוק) FISH. הטלומרים ואת חללית TALT1 היו הכלאה עוברת בו זמנית. ה- DNA היה counterstained עם DAPI (כחול). סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54224/54224fig4.jpg" /> איור 4:. כימות FISH נתונים הטלומרים ועוצם TALT1 מתרשים 3 כומתו בתוכנת ניתוח תמונה (מתנת ד&quot;ר פיטר Lansdorp). מקום כל היה לכמת עם OV רמת סףאה 15 להוציא הלא ספציפי רקע. T-test שימש להערכת מובהקות סטטיסטית. (* P &lt;0.001). ברי שגיאה, SEM. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54224/54224fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans at

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

10.3K Views.  Seoul National University. We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT). 

Video: Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Genetics

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

תורשה אפיגנטית ו- ChIP ב - Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through factors such as non-coding RNAs and chromatin modifications. The phenomenon of RNA interference (RNAi) inheritance in the nematode Caenorhabditis elegans is an effective model to investigate TEI that takes advantage of this model organism's short life cycle, self-propagation, and transparency. In RNAi inheritance, exposure of animals to RNAi leads to gene silencing and altered chromatin signatures at the target locus that persist for multiple generations in the absence of the initial trigger. This protocol describes the analysis of RNAi inheritance in C. elegans using a germline-expressed nuclear green fluorescent protein (GFP) reporter. Reporter silencing is initiated by feeding the animals bacteria expressing double-stranded RNA targeting GFP. At each generation, animals are passaged to maintain synchronized development, and reporter gene silencing is determined by microscopy. At select generations, populations are collected and processed for chromatin immunoprecipitation (ChIP)-quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to measure histone modification enrichment at the GFP reporter locus. This protocol for studying RNAi inheritance can be easily modified and combined with other analyses to further investigate TEI factors in small RNA and chromatin pathways.

מחבר זרקור: RNAi Inheritance ו- ChIP ב- C. elegans 

This protocol describes an RNA interference and ChIP assay to study the epigenetic inheritance of RNAi-induced silencing and associated chromatin modifications in C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes such as development are affected. The Caenorhabditis elegans germline is a great model system for studying PPIs that are related to the regulation of stem cells, meiosis, and development. There are a variety of well-developed techniques that allow proteins of interest to be tagged for recognition by standard antibodies, making this system advantageous for proximity ligation assay (PLA) reactions. As a result, the PLA is able to show where PPIs occur in a spatial and temporal manner in germlines more effectively than alternative approaches. Described here is a protocol for the application and quantification of this technology to probe PPIs in the C. elegans germline.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates use of the proximity ligation assay to probe for protein-protein interactions in situ in the C. elegans germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Developmental Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Immunology and Infection

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Neuroscience

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

בסיסי

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב