Name: isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes at JoVE.com

NKS is supported by NIH award K08 AI108690.

כל המחקרים נערכו בבדיקה הנחיות קפדניות על פי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, אשר עומדת בסטנדרטים וטרינריים שקבעה האגודה האמריקאית למדע בעלי חיים מעבדה (AALAS). 1. הילוכים אופקיים של חיידקים באמצעות Co-דיור (אופציונלית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער זיהום אקסוגניים (במיוחד אם באמצעות עכברי gnotobiotic), לתרגל את הטכניקה ספטית בעוד רכבת כלובים פנויים סטרילי, באמצעות מזון ומים כי יש את שניהם כבר autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו אגרופי אוזן או תגים בנפרד לסמן 6 בן שבוע C57BL / 6 עכברים כי נמל microbiotas שונה לשכן אותם באותו כלוב. בהתחשב בכך עכברים קופרופאגי ולאכול כדורי צואה מן רצפת הכלוב, חיידקים יועברו באופן טבעי אופקי בין העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co-בית עכברים ≥1 בשבוע כדי לאפשר זמן העברת חיידקים ושינוי אימונולוגית לפני הניתוח. </li></ol&gt; 2. הכנת תרחיף תא בודד משכבת ​​אינטרה-אפיתל קטן-מעי Lamina propria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת החילוץ (מחיר המעי הדק): 30 מ&quot;ל RPMI + 93 μl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 μl 0.5 M EDTA + 500 μl עוברי בסרום שור (FBS). מוסיפים את DTT מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת העיכול (מחיר המעי הדק): 25 מ&quot;ל RPMI + 12.5 מ&quot;ג dispase + 37.5 מ&quot;ג collagenase II + 300 FBS μl. מוסיפים את dispase ו collagenase מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל incubations ביצע ב 37 מעלות צלזיוס, פתרונות prewarm ל -37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי מחנק 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצד הגבי העכבר למטה ולרסס את הבטן עם אתנול 70%. השתמש במספריים לבצע פיום בטן ברצף על ידי חיתוך העור ולאחר מכן fascia הצפק לאורך קו האמצע הגחון הלוך ושובמ &#39;מאחת הערווה לתהליך xiphoid, ובכך חושף את חלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי להפריד את המעי הדק מהקיבה על ידי חוצים את הסוגר השוער. הוצא בעדינות את המעי הדק מן הצפק, מנסה לשחזר את שומן mesenteric. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את המעי הדק היטב, לעשות חתך שני בצומת ileo-cecal. מניח את המעי הדק מבודד לתוך קר (כלומר., 4 ° C) RPMI המכיל 10% FBS כדי למקסם כדאי תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות חתיכות גדולות של שומן באמצעות מלקחיים מעוקלים. היזהר כדי למנוע קריעה של רקמת המעי עצמו בעת שניסה להסיר שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר תוכן המעיים, המעיים סומק בעדינות עם 15 - 20 מ&quot;ל של PBS קר באמצעות מחט האכלה 18 G מודבקת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים שיחתוך PPS, ולהכניס אותם לתוך RPMI קר המכיל FBS 5%. PPS ממוקמים בצד antimesenteric של המעי הדק להופיע בתור רב lobulated לבןמסה. בהתאם לזן הספציפי, עכבר בדרך כלל יש 8 - 12 PPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הדק לתוך 3 - 4 מגזרים אינץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שומן שייר ידי גלגול בכל מגזר קטן-מעיים על מגבת נייר טבולה RPMI, באמצעות אזמל משעמם להקניט את השומן מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הרקמות מבפנים החוצה על ידי cannulating מגזרי המעיים עם מלקחיים מעוקלים לתפוס את הקצה הדיסטלי של הרקמה. לאחר מכן השתמש זוג ישר מלקחיים כדי להסיר את קטע הרקמה בעדינות מן המלקחיים המעוקלים (החל בסוף הפרוקסימלי), וכתוצאה מכך הרקמה להיות הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קטעי רקמה בתוך כוס המכילה 30 מ&quot;ל של התקשורת החילוץ ובר ומערבבים. אבטח את המכסה על הכוס, ומערבבים ב 500 סל&quot;ד במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; ערבוב צריך להיות נמרץ אבל לא מעורבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להשתמש מסננת פלדה להפריד חתיכות רקמה מן supernatant המכיל האפיתל, שאמורה להופיע מעונן. supernatant זה מכיל iלימפוציטים ntraepithelial כי ניתן לנתח עוד יותר, אם תרצה בכך, על ידי שתמשיך סינון המדגם בצעדים 2.18 - 2.23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להתסיס את פיסות הרקמה ב RPMI לשטוף תקשורת חילוץ שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רקמות על מגבת נייר יבשה להעיף אותו מקצה אל מספר פעמים כדי להקל על הסרה של ריר שיורית כי לא שוחרר על ידי מדיום החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שברי רקמת צינור 1.5 מיליליטר עם 600 μl של מדיום עיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לקצץ את הרקמה עד חתיכות כבר לא מקלות על המספריים והפתרון נראה הומוגני. שלב זה הוא קריטי על מנת להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המעי הדק טחון כוס המכילה 25 מ&quot;ל של התקשורת העיכול. מערבבים ב 500 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. באמצע העיכול (כלומר., ב 15 דקות), pipet למעלה ולמטה עם pipet סרולוגיות לעזור לשבור את כל חתיכות גדולות של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מסננות מתעכלות (או epithשכבת elial משלב 2.12 אם IELs עיבוד) דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ&quot;ל. יש לשטוף את מסננת עם 20 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון המסונן XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן resuspended התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. לשטוף מסננת עם 20 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 2% FBS. </li></ol> 3. הכנת ההשעיה תא בודד מתוך תיקונים של Peyer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נכרת PPS לכוס עם 25 מ&quot;ל של התקשורת העיכול ובר ומערבבים. מכסה מאובטח, ספין ב 500 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן מתעכל PPS דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור 50 מ&quot;ל. אם כל הרמ&quot;א גושיםב, ללחוץ אותם דרך מסננת בעזרת קצה השטוח של הבוכנה של מזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מסננת עם 10 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 2% FBS. </li></ol> 4. מכתים שטחי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Aliquot המתאים של תאים (למשל., 200 μl של LPLs) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 90 μl של RPMI המכיל 2% FBS ו דילול 1: 100 של אנטי CD16 / 32 (בלוק Fc). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant למזוג ידיהיפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונליים) תאי כתם עם צבע כדאיות, אם ירצו בכך, על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בפורמלין 100 μl 1% לתקן את התאים. דגירה עבור שעה 1 בחושך ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μl PBS. לנתח תאים באמצעות cytometer זרימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+regulation+of+food+intake.">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease.">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li><li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases.">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li><li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+(normal+microflora),+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases.">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes.">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li><li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut.">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides:+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA.">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li><li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system.">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li><li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia.">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li><li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease.">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li><li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells.">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota.">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li><li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice.">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li><li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa.">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד וזרימת אפיון cytometric של לימפוציטים קטנים-מעיים, כולל LPLs, IELs, ואת הלימפוציטים PPS. למעוניינים בהערכה כיצד שינויי החיידקים להשפיע על המערכת החיסונית הקטנה-מעיים, נפרטנו את השלבים הפשוטים המעורבים בהעברה האופקית של אורגניזמים בין עכברי מחסה microbiotas שונה. למרות בפרוטוקול זה מתמקד המעי הדק, ההליך הוא זהה לניתוח של המעי הגס, עם ההבדל היחיד הוא שאין PPS להסיר (אם כי תיקונים גסים נוכחים, אלה הם בדרך כלל לא גסים גלויים). ישנם מספר צעדי מפתח בהשגת בידוד האופטימלי של לימפוציטים מרקמות קטנות-מעיים. הסרה קפדנית של רקמת שומן היא קריטית להבטחת כדאיויות הלימפוציטים ואת תשואה אופטימלית. בנוסף, DTT הוא mucolytic חיוני המשמש החילוץשל תאי אפיתל. בהתחשב באופי היציבה שלה, אנו מציעים אחסון aliquots-לייחד של פתרון 5% ≤-20 ° C ולא מחדש הקפאה כל נפח בשימוש. למרות EDTA משמש מדיום החילוץ כדי לסייע להסרת תאי אפיתל 15, נוכחותה - כמו גם עודף FBS או ריר - במהלך תהליך העיכול יכולה לעכב את collagenase. ריכוז collagenase בשימוש הודגם באופן דיפרנציאלי להשפיע ביטוי סמן פני שטח 13,16,17 כדאיות תא. יתר על כן, בהתאם על סמן משטח של עניין, זה יכול להיות כי בניסוח שונה של collagenase (למשל., סוג collagenase I, II, VI, או השמיני) הוא אופטימלי 13,17. חלק אופטימיזציה אמפירי ייתכן שיידרש בהתאם לשאלה הספציפית הניסיונית, בשל וריאציה הרבה-אל-הרבה, במגרש הספציפי ורמת פעילות היחסית של collagenase. יתר על כן, אופטימיזציה נוספת עשויה להידרש תלוי specific זן וגיל של העכבר בשימוש. לדוגמה, פעמים המפורטים כאן כבר אופטימיזציה עבור ~ 6 בשבוע העכבר C57BL / 6 הישן; עבור עכבר השויצרי וובסטר ~ 8 שבוע ישן, הפעם העיכול ניתן להעלות עד 40 דקות. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד של לימפוציטים קטנים-מעיים מן השכבה הרירית מיוחדת, שכבת intraepithelial, וה- PPS. לאחר משתלט עליו, אפשר לעבד סביר 4 ​​עכברים יש השעיות תא בודדות מוכנות מכתים ב ~ 4 שעות. למרות שאנו מתארים את המכתים המיידי של תאים אלה לאפיון התזרים cytometric, אפשר לחלופין לעורר תאים אלה כדי להעריך ייצור ציטוקינים, למיין תאים עבור תעתיק ו / או ניתוחי proteomic, או תרבות התאים להסתכל אינטראקציות במבחנה עם סוגי תאים אחרים. יתר על כן, בעוד התמקדנו אוכלוסיית הלימפוציטים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבחון תאים מיאלואידית. יחדיו, גישה יעילה זו כדי לבודד ce יחידאוכלוסיות ll מן התאים שונים מעיים מאפשרות לחקור הן כיצד גורמים שונים (למשל., חיידקים, אנטיגנים תזונתיים) משפיעים על ontogeny של מערכת חיסון במעי וגם איך תאים אלה עשויים להיות רלוונטיים במחלות חוץ-מעיים.

המשימה העיקרית של המעי הדק נחשב לעתים קרובות להיות עיכול וספיגה של חומרים מזינים 1. בעוד תפקוד המטבולי זה חיוני בבירור, המעי הדק יש תפקיד משמעותי לא פחות בהגנת המארח מן המטח המתמיד של אנטיגנים סביבה נמצאים בתוך לומן 2. המעי מפרידה בין העולם החיצוני (למשל., אנטיגנים לומינל) מהסביבה הפנימית של המארח עם שכבת האפיתל כי היא שכבה תא בודד רק עבה. ככזה, המערכת החיסונית הקטנה-מעיים יש את המשימה האדירה של איזון הסף שלה עבור תגובתיות, המאפשר אנטיגנים זרים מן חיידקי דיאטת commensal להיכנס רירי עם מינימאלי, אם בכלל, תגובה חיסונית תוך גובר תגובה חזקה נגד פתוגנים הפולשים &quot;מזיקים&quot; אנטיגנים אחרים. תגובות חיסוניות מוגזמות או לא מתאימות לאנטיגנים אלה יכולים להוביל למחלות פתולוגיים (למשל., Inflammaמחלות מעי טור, סוכרת מסוג I, טרשת נפוצה) ויש להימנע מהם 3-6. בסך הכל, מערכת העיכול הוא חשב לייצג את איבר החיסון הגדול ביותר בגוף, המכיל מעל 70% מכלל התאים מפרישי נוגדן 7. המערכת החיסונית קטן-מעיים מורכב מ -3 תאים עיקריים - שכבת הרירית המיוחדת (LP), השכבה intraepithelial, וטלאים של Peyer (PPS) - שכל אחד מהם מכיל קבוצה ייחודית של לימפוציטים 2. הלימפוציטים LP (LPLs) הם בעיקר תאי TCRαβ + T עם תאים ~ 20% B; לימפוציטים intraepithelial (IELs) מכילים תאי B מעט מאוד עם יותר תאי TCRγδ + T מאשר תאי TCRαβ + T; ו- PPS, שהן איברים הלימפה משני מוטבע בקיר הקטן-מעיים, מכיל ~ 80% תאי B. למרות שכל אחד האזורים האנטומיים הללו יש פונקציות נפרדות מעט ובסיסים אונטולוגית, הם מתפקדים אהאופנה armonized להגן המארח מפני עלבונות פתוגניים. יתר על כן, יש הערכה גוברת כי החיידקים הוא קובע קריטי להתפתחות של מערכת חיסון במעי, עם הכרה גוברת של קשר מאותו המקור בין חיידקים ספציפיים ואת ontogeny של שושלות תאים מסוימות 8,9. יתר על כן, בהתחשב בכך החינוך של מערכת החיסון במעי משפיע התגובה החיסונית לאתרים מרוחקים מבחינה אנטומית (למשל., דלקת פרקים, טרשת נפוצה, דלקת ריאות), זה הפך להיות ברור כי פיתוח של מערכת החיסון במעי רלוונטי יותר תהליכי מחלה מאשר שהוכר בעבר 10 -12. ככזה, עניין בהערכת כמותית מערכת החיסון במעי האריך מעבר אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עכשיו כולל אינטראקציות בין מאכסן commensal ואת בפתוגנזה של מחלות מערכתיות רבות גם כן. בהתחשב בשונות של שיטות קיימות בהבידוד של לימפוציטים מעיים, שיטה כי הוא מותאם במיוחד תשואה, הכדאיות, ועקביות תוך איזון ראוי בין הזמן הנדרש הוא קריטי יותר ויותר. פרוטוקולים שכוללים הדרגתיים Percoll הם זמן העבודה אינטנסיבית יותר, אשר נוטה טעות אנושה, מוביל התשואה משתנית ואת כדאיות 13. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבידוד והאפיון של לימפוציטים מכל 3 תאי החיסון קטנים-המעיים. בנוסף, עניין גובר נתון שינויים מושרי חיידק במערכת החיסונית ברירית, נכלולי צעדים שיכולים לשמש כדי לאפשר את ההעברה האופקית של מיקרואורגניזמים בין העכברים להעריך כיצד שינויים אלה כמותית להשפיע על המערכת החיסונית של המעי.

<table><tbody><tr><td>Sterile Gloves</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>sterile mouse cage</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding</td></tr><tr><td>Metal feeder</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Water bottle</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Card holder</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg</td></tr><tr><td>Collagenase, type II&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Feeding needle (18 G, 2&quot; length)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel (15 blade)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Multi-purpose cups, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Multi-position stir plate, 9-position</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel conical strainer, 3 inch&amp;nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate, round-bottom</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(Optional) Fixable viability dye eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin, neutral buffered</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes

המעיים - אשר מכילים את המספר הגדול ביותר של תאי מערכת החיסון של כל איבר בגוף - חשופים כל הזמן אנטיגנים זרים, הן חיידקים תזונתיים. בהתחשב שיש לנו הבנה גוברת כי אנטיגנים לומינל אלה לעזור לעצב את התגובה החיסונית וחינוך של תאים חיסוניים בתוך המעי הוא קריטי עבור מספר המחלות מערכתיות, שם כבר עלה עניין באפיון מערכת החיסון במעי. עם זאת, פרוטוקולים רבים שפורסמו הם מפרך זמן רב. אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט עבור הבידוד של לימפוציטים מתוך שכבת הרירית מיוחדת קטנה-מעיים, שכבת intraepithelial, והטלאים של Peyer כי הוא מהיר, לשחזור, ואינו דורש הדרגתי Percoll מייגע. אף על פי הפרוטוקול מתמקד במעי הדק, זה גם מתאים ניתוח של המעי הגס. יתר על כן, אנו מדגישים היבטים מסוימים שעשויות צריך אופטימיזציה נוספת תלויים בככפרו המדעי הספציפיtion. גישה זו גורמת לבידודה של מספר גדול של לימפוציטים קיימא כי לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח תזרים cytometric או אמצעים חלופיים של אפיון.

ניתוח תזרים cytometric של המתלים תא בודד של לימפוציטים קטנים-מעיים אמור להניב אוכלוסייה דיסקרטית של תאים בעלי מאפיינים דומים קדימה פיזור בצד כמו splenocytes (איורים 1 א ו -1 B). הלימפוציטים עשויים להתחיל למות אם הרקמה אינה נשמרת ב 4 ° C. במהלך השלבים הראשונים של בידוד, וכתוצאה מכך אוכלוסיית הלימפוציטים בעל פיזור קדימה נמוך ולהיות יותר קשה להפריד מתאי אפיתל מתים אחרים (איור 1 ג) . יתר על כן, אם הרקמה קטנה-מעיים לא ניקתה לחלוטין של שומן mesenteric שלה, אין כמעט אובדן מוחלט של לימפוציטים (איור 1D). תכונות אלה ממחישים כיצד עובד מהר (כלומר., שאינו מאפשר את הרקמה כדי להתחמם) ולשלם תשומת לב לפרטים (כלומר., הסרת אפילו כמויות קטנות של שומן mesenteric) הוא הכרחי על מנת להבטיח איכות המדגם. Typically, נקבל ~ 80% כדאיות עבור LPLs הקטן-מעיים (איור 1E). איור 2 א ממחיש עד כמה הרכב החיידקים יכולים להשפיע על מספרים מאוד של אוכלוסיות תאים ספציפיים. כפי שהראנו קודם לכן, ניבטו חינם (GF) עכברים, אשר נטולים לחלוטין של כל מיקרואורגניזמים, יש מערכת חיסונית קטנה-מעיים כי הוא לא בשלה במידה ניכרת לעומת הפתוגן ללא ספציפיים (SPF) עכברים, והתנחלות של עכברי GF עם חיידקי עכבר רגילים (MMB) תוצאות שחזור המערכת החיסונית קטנה-מעי 14. לעומת זאת, בעכברי gnotobiotic מחסה חיידקי אדם נורמלים (HMB) - ויש לי כי מספר ומגוון דומים של חיידקים צואתיים כמו עכברי MMB - יש מערכת חיסונית קטנה-מעיים כי הוא נבדל מזה של עכברי GF 14. ניצולהאופי קופרופאגי של עכברים, עכברי דיור שיתוף יחד מייצג שיטה חזקה פשוטה, אך עבור מאפשר העברה אופקית של אורגניזמים בין עכברים. גישה זו מאפשרת אחד כדי לבדוק אם השינוי וכתוצאה מכך החיידקים משפיע על מערכת החיסון הקטנה-מעיים. כדוגמא, הראינו כי עכברי שיתוף הדיור HMB עם עכברי MMB למשך 4 שבועות הביאו לנורמליזציה של מספר תאי CD3 + CD8 + T ב LP SI (איור 2 ב) 14. תוצאה זו מאשרת כי ההבדלים בין עכברי MMB ו HMB שנצפו איור 2A הוא עקב שינויי החיידקים בין עכברים אלה - הווריאציות כי הם להתגבר על ידי שיתוף דיור יחד העכברים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig1.jpg" /> יש באיור 1. מעיים לימפוציטים FSC ומאפייני SSC בדומה Splenocytes A -. ד Dמגרשים ot המתארים SSC ו FSC עבור splenocytes מוכן בצורה אופטימלית (א) ו שכבת הרירית המיוחדת קטן-מעיים (LP SI) תאים (B - D). .ב SI LP מדגם הוכן על פי הפרוטוקול המתואר. ג רקמת המעי הורשה בכוונה כדי לחמם מנת להוכיח כי SI LP התאים מתחילים להיות FSC נמוך. ד שומן mesenteric לא ניקה את המעי הדק לפני הכנת תאים בודדים, וכתוצאה מכך אובדן של אוכלוסיית הלימפוציטים להבחין SI LP. א המדגם המתואר בלוח B הוכתם בשלב 4.7 עם צבע כדאיות fixable (למשל., EFluor 780) על פי הוראות היצרן. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig2.jpg" /> איור 2. ההבשלה משפיע חיידקים של-intest הקטןהמערכת החיסונית Inal. א תאי CD3 + CD8 + T היו המנויים LP SI של SPF, MMB, HMB, ועכברים GF. העכברים ב HMB היו שיתוף שוכנו עם עכברי MMB למשך 4 שבועות לפני ספירת CD3 + CD8 + T תאי LP SI. עכברי MMB ו HMB שלא היו שיתוף שוכנו נותחו להשוואה. כל נקודת נתונים מייצגת עכבר פרט, ואת הפסים האופקיים משקפים את הממוצע. NS, לא משמעותי; *, P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001. דמויות הם לשכפל-באישור-בהפניה 14, עם שינויים קלים של B. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes at JoVE.com

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.3K Views.  Boston Children’s Hospital. There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization. 

Video: Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Biology

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, isolating intestinal lipoproteins is very difficult in vivo because they are first secreted from the small intestine into the mesenteric lymphatics. Chylomicron-containing lymph then empties into the subclavian vein from the thoracic duct to deliver components of the meal to the heart, lungs, and, ultimately, whole-body circulation. Isolating na&#239;ve chylomicrons is impossible from blood since chylomicron triglyceride undergoes hydrolysis immediately upon interaction with lipoprotein lipase and other lipoprotein receptors in circulation. Therefore, the original 2-day lymph fistula procedure, described by Bollman et al. in rats, has historically been used to isolate fresh mesenteric lymph before its entry into the thoracic vein. That protocol has been improved upon and professionalized by the laboratory of Patrick Tso for the last 45 years, allowing for the analysis of these critical lipoproteins and secretions from the gut. The Tso lymph fistula procedure has now been updated and is presented here visually for the first time. This revised procedure is a single-day surgical technique for installing a duodenal feeding tube, cannulating the mesenteric lymph duct, and collecting lymph after a meal in conscious mice. The major benefits of these new techniques include the ability to reproducibly collect lymph from mice (which harnesses the power of genetic mouse models); the reduced anesthesia time for mice during the implantation of the duodenal infusion tube and the lymph cannula; the ability to continuously sample lymph throughout the feeding and post-prandial period; the ability to quantitatively measure hormones and cytokines before their dilution and enzymatic hydrolysis in blood; and the ability to collect large quantities of lymph for isolating intestinal lipoproteins. This technique is a powerful tool for directly and quantitatively measuring dietary nutrient absorption, intestinal lipoprotein synthesis, and chylomicron secretion.

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

The present protocol describes a detailed surgical protocol for isolating flowing intestinal lymph in response to intraduodenal nutrient infusions in mice. This allows for the physiological determination of total intestinal lipid absorption and chylomicron synthesis and secretion in response to various experimental nutrients.

בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...