Name: isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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Alle Untersuchungen wurden unter strengen Überprüfung und Richtlinien durchgeführt nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Harvard Medical School, die die Veterinär Standards, die von der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) erfüllt. 1. Horizontale Übertragung von Bakterien über Co-Gehäuse (optional) <ol><li> Zur Minimierung von exogenen Kontamination (insbesondere, wenn gnotobiotischer Mäusen), üben aseptischen Bedingungen während sterile Einweg-Käfige montieren, mit Nahrung und Wasser, die haben beide autoklaviert worden. </li><li> Verwenden Ohr Schläge oder Tags einzeln markieren 6 Wochen alten C57BL / 6-Mäuse, die unterschiedliche microbiotas Hafen und beherbergen sie im selben Käfig. Da Mäuse sind Koprophagie und essen fäkalen Pellets aus dem Käfigboden, Mikroben wird natürlich horizontal zwischen den Mäusen übertragen werden. </li><li> Co-Hausmäuse für ≥1 Woche Zeit für die mikrobielle Transfer und immunologischer Veränderungen vor der Analyse zu ermöglichen. </li></ol&gt; 2. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Small-Darm-Intraepitheliale Schicht und Lamina Propria <ol><li> Herstellung von Lösungen <ol><li> Bereiten Extraktionsmedien (pro Dünndarm): 30 ml RPMI + 93 &amp; mgr; l 5% (w / v) Dithiothreitol (DTT) + 60 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA + 500 ul fötales Rinderserum (FBS). Fügen Sie den DVB-T unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie die Verdauung Medien (pro Dünndarm): 25 ml RPMI + 12,5 mg Dispase + 37,5 mg Kollagenase II + 300 ul FBS. Fügen Sie die Dispase und Kollagenase unmittelbar vor dem Gebrauch. </li><li> Für alle Inkubationen bei 37 ° C, vorwärmen Lösungen bis 37 ° C durchgeführt wird. </li></ol></li><li> Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte. </li><li> Platzieren Sie die Maus dorsalen Seite nach unten und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Mit einer Schere eine Laparotomie durchzuführen, indem der Reihe nach in die Haut schneiden und dann Peritonealdialyse Faszie entlang der ventralen Mittellinie herm die Schambeinfuge zum Xiphoidbasis, wodurch die Bauchhöhle ausgesetzt wird. </li><li> Mit einer Schere in den Dünndarm aus dem Magen zu trennen, indem Sie den Magenpförtner durchschneidet. Entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm aus dem Peritoneum, necken die mesenterialen Fett weg. <ol><li> Um voll und ganz in den Dünndarm zu entfernen, machen einen zweiten Schnitt am ileo-cecal Kreuzung. Platzieren Sie den isolierten Dünndarm in kaltes (dh., 4 ° C) RPMI 10% FBS enthält , die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig große Stücke von Fett mit einer gebogenen Pinzette. Seien Sie vorsichtig, zu vermeiden, dass die Darmgewebe reißen sich während Fett zu entfernen versuchen. </li><li> Zum Entfernen von Darminhalt, sanft spülen Darm mit 15 bis 20 ml kaltem PBS unter Verwendung einer 18 G Fütterung Nadel an einer Spritze befestigt. </li><li> Mit einer Schere PPs auszuschneiden, und legen Sie sie in kaltem RPMI mit 5% FBS. PPs sind auf der antimesenteriale Seite des Dünndarms befindet und erscheinen als mehr gelappte whiteMasse. Je nach dem spezifischen Stamm hat eine Maus typischerweise 8 bis 12 PPs. </li><li> Schneiden Sie den Dünndarm sich in 3 - 4-Zoll-Segmente. </li><li> Entfernen Restfett durch jede kleine-Darm-Segment auf einem Papiertuch rollen mit RPMI befeuchtet, ein stumpfes Skalpell, das Fett zu necken aus dem Gewebe entfernt. </li><li> Schalten Sie das Gewebe von innen nach außen durch die Darmsegmente mit einer gebogenen Pinzette Kanülierung und das distale Ende des Gewebes zu erfassen. Dann mit einem Paar von geraden Pinzette vorsichtig auf die Gewebesegment aus den gebogenen Pinzette entfernen (am proximalen Ende beginnend), die sich in das Gewebe invertiert wird. </li><li> Legen Sie Gewebesegmente in einer Schale mit 30 ml Extraktionsmittel und einen Rührstab. Sichern Sie den Deckel auf den Becher, und rührt bei 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bei 37 ° C; Rühren sollte kräftig, aber nicht turbulent sein. </li><li> Nach der Inkubation verwenden, um ein Wannensieb Gewebestücke aus dem Epithel enthaltenden Überstand zu trennen, die trübe erscheinen soll. Dieser Überstand enthält intraepithelial Lymphozyten, die weiter analysiert werden können, falls gewünscht, durch fortgefahren wird, die Probe in Schritten Filterung 2,18-2,23. </li><li> die Gewebestücke in RPMI manuell agitieren Restextraktionsmittel abzuwaschen. </li><li> Legen Sie Gewebe auf ein trockenes Papiertuch und drehen Sie sie über das Ende mehrmals am Ende Entfernung von Rest Schleim zu erleichtern, die nicht durch das Extraktionsmittel befreit wurde. </li><li> Platzieren Gewebefragmente in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 600 ul Digestionsmedium. </li><li> Mit einer Schere das Gewebe zu zerkleinern, bis Stücke nicht mehr auf die Schere halten, und die Lösung erscheint homogen. Dieser Schritt ist entscheidend vollständige enzymatische Verdauung des Gewebes zu gewährleisten. </li><li> Fügen Sie den gehackten Dünndarm zu einer Tasse, die 25 ml Verdauung Medien. Rühre bei 500 rpm für 30 min bei 37 ° C. Auf halbem Weg durch die Verdauung (dh., 15 min), pipettieren nach oben und unten mit einer serologischen Pipette alle großen Brocken von Gewebe brechen zu helfen. </li><li> Filter verdaute Gewebe (oder EpithElial Schicht aus Schritt 2.12, wenn die Verarbeitung IELs) durch ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sie das Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthält. </li><li> Zentrifugieren der filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> dekantieren sorgfältig den Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 10% FBS enthielt. </li><li> Filter resuspendierten Zellen durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthielt. </li><li> Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt. </li></ol> 3. Herstellung einer Einzelzellsuspension von Peyer-Plaques <ol><li> Transfer PPs zu einer Tasse mit 25 ml Verdauung Medien und einem Rührstab herausgeschnitten. Sichere Deckel und Schleudern bei 500 UpM für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Filter verdaut PPs durch ein 40 &amp; mgr; m Zelle Sieb in einen 50-ml-Tube. Wenn jeder Klumpen REMAin, drücken sie durch das Sieb aus einer 1-ml-Spritze das flache Ende des Kolbens verwendet wird. </li><li> Spülen Sieb mit 10 ml RPMI 10% FBS enthielt. </li><li> Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt. </li></ol> 4. Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Aliquotieren entsprechende Volumen von Zellen (z. B. 200 ul LPLs) in einer 96-Well - Rundbodenplatte. </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Resuspendiere Zellen in 90 &amp; mgr; l von RPMI, enthaltend 2% FBS und eine 1: 100-Verdünnung von anti-CD16 / 32 (Fc-Block). Inkubieren für 10 min bei 4 ° C. </li><li> In 10 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Decant Stand durchUmdrehen der Platte. </li><li> (Optional) Stain Zellen mit Lebensfähigkeit Farbstoff, falls gewünscht, durch das Protokoll des Herstellers folgen. </li><li> Die Zellen in 100 ul 1% Formalin, die Zellen zu fixieren. Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> In 200 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen in 200 ul PBS. Analysieren Sie die Zellen unter Verwendung eines Durchflusszytometers. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und durchflusszytometrische Charakterisierung von kleinen intestinalen Lymphozyten, einschließlich der LPLs, IELs und Lymphozyten in die PPs. Für Interessenten bei der Bewertung, wie sich Änderungen in der Mikrobiota die kleine-Darm-Immunsystem beeinflussen, wir ausführlich die einfachen Schritte in der horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen beteiligt verschiedenen microbiotas beherbergen. Obwohl dieses Protokoll auf den Dünndarm konzentriert, ist das Verfahren das gleiche für die Analyse des Dickdarms, mit dem einzigen Unterschied, dass es kein PPs zu entfernen sind (obwohl colonic Flecken vorhanden sind, sind diese typischerweise nicht grob sichtbar). Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Erreichung optimaler Isolierung von Lymphozyten aus kleinen Darmgewebe. Sorgfältige Entfernung von Fettgewebe ist absolut entscheidend Lymphozyten Lebensfähigkeit und eine optimale Ausbeute zu gewährleisten. Zusätzlich ist ein entscheidender DTT schleimlösende in der Extraktion verwendetenvon Epithelzellen. Aufgrund seiner instabilen Natur, empfehlen wir Lagerung Einweg-Aliquots einer 5% igen Lösung bei ≤-20 ° C und nicht wieder einfrieren nicht verwendete Volumen. Obwohl EDTA in dem Extraktionsmedium verwendet wird , bei der Entfernung von Epithelzellen zu unterstützen 15, seine Anwesenheit - sowie überschüssiges FBS oder Schleim - während des Verdauungsprozesses kann die Kollagenase inhibieren. Die Konzentration von Kollagenase verwendet wurde , unterschiedlich Oberflächenmarker Ausdruck und die Lebensfähigkeit der Zellen 13,16,17 beeinflussen demonstriert. Darüber hinaus, abhängig von der Oberflächenmarker von Interesse, kann es sein , dass eine andere Formulierung von Kollagenase (z. B. Kollagenase Typ I, II, VI oder VIII) 13,17 optimal ist. Einige empirische Optimierung kann erforderlich sein, abhängig von der spezifischen experimentellen Frage und aufgrund von Los zu Los Variation, die spezifische Menge und die relative Aktivität der Kollagenase. Des Weiteren können zusätzliche Optimierung je nach spezif erforderlichic Stamm und Alter der Maus. Beispielsweise aufgelistet die Zeiten hier wurden für eine ~ 6 Wochen alten C57BL / 6-Maus optimiert; für eine ~ 8 Wochen alten Webster Maus Schweizer kann die Verdauung Zeit auf 40 Minuten erhöht werden. Zusammenfassend haben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von kleinen intestinalen Lymphozyten aus der Lamina propria, intraepitheliale Schicht und PPs vorgesehen. Einmal gemeistert, kann man vernünftigerweise 4 Mäuse verarbeiten und haben Einzelzellsuspensionen bereit für die Färbung in ca. 4 Std. Obwohl wir die sofortige Färbung dieser Zellen für die durchflusszytometrische Charakterisierung beschreiben, kann man alternativ , diese Zellen zu stimulieren , um die Cytokin - Produktion bewerten, sortieren Zellen für die transkriptionale und / oder proteomische Analyse oder die Zellen Kultur bei in vitro - Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen zu suchen. Darüber hinaus, während man auf der Lymphozytenpopulation konzentriert, kann dieses Protokoll auch verwendet werden, myeloiden Zellen zu untersuchen. Zusammengenommen mit diesen optimierten Ansatz zu einzelnen ce isolierenll Populationen aus verschiedenen Darmfächer ermöglicht eine sowohl zu befragen , wie verschiedene Faktoren (z. B. Mikrobiota, Nahrungsantigene) beeinflussen die Ontogenese des intestinalen Immunsystems und auch , wie diese Zellen in Extra-Darm - Erkrankungen von Bedeutung sein können.

Die Hauptaufgabe des Dünndarms wird oft als 1 , um die Verdauung und Resorption von Nährstoffen ist. Während diese Stoffwechsel - Funktion deutlich von wesentlicher Bedeutung ist, hat der Dünndarm eine ebenso bedeutende Rolle in den Host aus dem ständigen Flut von Umweltantigene innerhalb des Lumens 2 gefunden zu schützen. Der Darmtrakt trennt die Außenwelt (z. B. luminale Antigene) aus der inneren Umgebung des Wirts mit einer Epithelschicht , die nur eine einzige Zellschicht dick ist. Als solche hat die kleine-Darm Immunsystem die gewaltige Aufgabe seine Schwelle auf Reaktivität auszugleichen, so dass fremde Antigene aus der Ernährung und commensal Mikroben die Schleimhaut mit minimal, wenn überhaupt, Immunantwort zu aktivieren, während eine robuste Antwort gegen eindringende Pathogene Montage und andere &quot;schädlich&quot; Antigene. Übermäßige oder unangemessene Immunantworten gegen diese Antigene zu pathologischen Krankheit führen können (z. B. inflammatory Darmerkrankung, Typ - I - Diabetes, Multiple Sklerose) , und 3-6 vermieden werden muss. Insgesamt ist der Gastrointestinaltrakt das größte Immunorgan im Körper darzustellen gedacht, mit über 70% der Antikörper-sezernierenden Zellen 7. Die Klein intestinale Immunsystem besteht aus 3 Hauptfächer - die lamina propria (LP), der intraepithelialen Schicht und Peyer-Plaques (PPs) - dass jede 2 eine besondere Gruppe von Lymphozyten enthält. Die LP - Lymphozyten (LPLs) sind in erster Linie TCRαβ + T - Zellen mit ~ 20% B - Zellen; intraepitheliale Lymphozyten (IELs) enthalten nur sehr wenige B - Zellen mit mehr TCRγδ + T - Zellen als TCRαβ + T - Zellen; und PPs, die in der kleinen Darmwand eingebettet sekundären lymphatischen Organe sind, die ~ 80% B-Zellen. Obwohl jede dieser anatomischen Regionen leicht unterschiedliche Funktionen und ontologischen Basen hat, funktionieren sie in aharmonized Art und Weise den Wirt vor pathogenen Beleidigungen zu schützen. Darüber hinaus gibt es wachsende Anerkennung , dass die Mikrobioten eine kritische Determinante für die Entwicklung des Darm Immunsystems, mit Anerkennung der kognaten Beziehung zwischen spezifischen Mikroben erhöht und die Ontogenese von bestimmten Zelllinien 8,9. Da darüber hinaus die Bildung des intestinalen Immunsystems in anatomisch entfernten Stellen Immunreaktionen beeinflusst (z. B. Arthritis, Multiple Sklerose, Lungenentzündung), ist es klar geworden , dass die Entwicklung des intestinalen Immunsystems zu mehr Krankheitsprozesse relevant ist , als bisher 10 erkannt -12. Als solches Interesse an quantitativ die intestinale Immunsystem Beurteilung hat sich über Wirt-Pathogen-Interaktionen erweitert jetzt Host-symbiotischer Interaktionen und die Pathogenese vieler systemischen Erkrankungen sowie umfassen. die Variabilität der derzeitigen Methoden in der gegebenenIsolierung von Darm-Lymphozyten, eine Methode, die während Ausgleich erforderlich, um die Zeit für den Ertrag, Rentabilität und Konsistenz optimiert wird zunehmend kritisch. Protokolle, die Percoll Gradienten sind zeit- und arbeitsintensiv und möglicherweise anfällig für menschliche Fehler, was zu einer variablen Ausbeute und Lebensfähigkeit 13 beinhalten. Hierin stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, die aus allen drei kleinen intestinalen Immun Abteilen. Zusätzlich, da ein zunehmendes Interesse an mikroben induzierte Veränderungen in der mukosalen Immunsystems beziehen wir Schritte, die verwendet werden können, für die horizontale Übertragung von Mikroorganismen zwischen Mäusen zu ermöglichen zu beurteilen, wie diese Veränderungen quantitativ die intestinale Immunsystem beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>Sterile Gloves</td><td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td>sterile mouse cage</td><td>Innovive</td><td>MS2-AD</td><td>contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding</td></tr><tr><td>Metal feeder</td><td>Innovive</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>Water bottle</td><td>Innovive</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>Card holder</td><td>Innovive</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable rodent chow (NIH-31M)</td><td>Zeigler</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg</td></tr><tr><td>Collagenase, type II&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Feeding needle (18 G, 2&quot; length)</td><td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel (15 blade)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>Multi-purpose cups, 120 ml</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>Multi-position stir plate, 9-position</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel conical strainer, 3 inch&amp;nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate, round-bottom</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (Fc block)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>(Optional) Fixable viability dye eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin, neutral buffered</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and flow cytometric characterization of murine small intestinal lymphocytes

Der Darm -, die die größte Anzahl von Immunzellen von jedem Organ im Körper enthalten - sind auf fremde Antigene ständig ausgesetzt sind, sowohl mikrobielle und Nahrungs. Gegeben helfen ein zunehmendes Verständnis, dass diese luminale Antigene, die Immunantwort zu gestalten und dass Bildung von Immunzellen im Darm für eine Reihe von systemischen Erkrankungen kritisch ist, hat es bei der Charakterisierung des intestinalen Immunsystems erhöht Interesse. viele veröffentlichte Protokolle sind jedoch mühsam und zeitraubend. Wir präsentieren hier ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus dem kleinen intestinalen Lamina propria, intraepitheliale Schicht und Patches Peyer, die eine schnelle, reproduzierbar ist, und erfordert keine mühsamen Percoll Gradienten. Obwohl das Protokoll auf den Dünndarm konzentriert ist es auch für die Analyse des Kolons geeignet. Darüber hinaus stellen wir einige Aspekte, die auf die spezifische wissenschaftliche ques je eine zusätzliche Optimierung benötigention. Dieser Ansatz führt zu der Isolierung einer großen Anzahl von lebenden Lymphozyten, die anschließend für die durchflusszytometrische Analyse oder alternative Mittel zur Charakterisierung verwendet werden können.

Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellsuspensionen von kleinen intestinalen Lymphozyten sollte eine diskrete Population von Zellen ergeben , die ähnliche haben Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften als Splenozyten (1A und 1B). Die Lymphozyten können beginnen zu sterben , wenn das Gewebe nicht bei 4 ° C während der ersten Phasen der Isolation gehalten, was in der Lymphozyten - Population eine niedrigere Vorwärtsstreuung aufweisen und schwierig zu trennen von anderen epithelialen und toten Zellen (1C) . Außerdem, wenn die kleine Darmgewebe nicht vollständig seiner mesenterialen Fett gereinigt, gibt es praktisch ein vollständiger Verlust der Lymphozyten (Figur 1D). Diese Funktionen zeigen , wie schnell arbeiten (dh., Nicht das Gewebe ermöglicht zum Aufwärmen) und Aufmerksamkeit zum Detail (dh., Das Entfernen bereits geringe Mengen an mesenterialen Fett) ist notwendig , Probenqualität zu gewährleisten. typically, so erhalten wir ~ 80% Lebensfähigkeit für kleine-Darm - LPLs (Abbildung 1E). 2A zeigt , wie die Zusammensetzung der Mikroflora stark die Anzahl von spezifischen Zellpopulationen beeinflussen können. Wie wir früher gezeigt haben, keimfrei (GF) Mäusen, die völlig frei von irgendwelchen Mikroorganismen sind, haben einen kleinen intestinalen Immunsystems, die deutlich unreifen im Vergleich zu spezifischen pathogenfreien (SPF) Mäusen und Kolonisierung von GF Mäusen mit einer normalen Maus microbiota (MMB) zu Wiederherstellung der kleinen intestinalen Immunsystems 14. Im Gegensatz dazu beherberge gnotobiotischen Mäusen eine normale menschliche microbiota (HMB) - und dass eine ähnliche Anzahl und Vielfalt von fäkalen Bakterien als MMb mice - haben einen kleinen intestinalen Immunsystems , die sich von der GF - Mäusen 14 ununterscheidbar ist. Einen Vorteil ziehen ausdie Koprophagie Natur von Mäusen, Co-Gehäuse Mäuse stellt zusammen eine einfache, aber leistungsfähige Methode zur horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht es, ob die sich ergebende Änderung der Klein intestinalen Immunsystems in der Mikrobioten zu testen auswirkt. Als Beispiel haben wir gezeigt , dass die Co-Gehäuse HMB Mäuse mit MMb Mäuse für 4 Wochen in der Normalisierung der Zahl der CD3 + CD8 + T - Zellen in der SI LP (2B) 14 geführt. Dieses Ergebnis bestätigt , dass die Unterschiede zwischen MMb und HMB Mäusen beobachtet in 2A zu Variationen in der Mikrobioten zwischen diesen Mäusen zurückzuführen ist - Variationen , die durch Zusammenbringen der Mäuse zusammen überwunden werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig1.jpg" /> Abbildung 1. Intestinale Lymphozyten haben FSC und SSC ähnliche Eigenschaften wie Splenozyten . A - D. Dot Plots Darstellung SSC und FSC für optimal vorbereitet Splenozyten (A) und des Dünndarms Lamina propria (SI LP) Zellen (B - D). B. Die SI LP Probe wurde nach dem beschriebenen Protokoll hergestellt. C. Das Darmgewebe wurde absichtlich erwärmen gelassen zu zeigen, dass SI LP Zellen beginnen, einen niedrigeren FSC zu haben. D. Die mesenterialen Fett wurde nicht in den Dünndarm vor der Herstellung einzelner Zellen gereinigt, was zu dem Verlust eines erkennbaren SI LP Lymphozytenpopulation. E. Die Probe in Feld B dargestellt wurde in Schritt 4.7 mit fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff gefärbt (z. B. eFluor 780) gemäß den Anweisungen des Herstellers. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54114/54114fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Mikrobiota Auswirkungen Ausreifung des Small-intestinal Immunsystem. A. CD3 + CD8 + T - Zellen wurden in SI LP von SPF, MMb, HMB und GF Mäuse gezählt. B. HMB Mäuse wurden gemeinsam untergebracht mit MMb Mäuse für 4 Wochen vor CD3 + CD8 + T - Zellen in der SI LP zu aufzählt. MMb und HMB-Mäuse, die waren nicht zusammengebracht wurden zum Vergleich untersucht. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Maus, und die horizontalen Balken entsprechen dem Mittelwert. NS, nicht signifikant; * P &lt;0,05; **, P &lt;0.01; *** P &lt;0,001. Die Zahlen sind wiedergegebenen mit berechtigungs von Referenz 14, mit einer leichten Modifikation von B. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54114/54114fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.3K Aufrufe.  Boston Children’s Hospital. There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization. 

Serie: Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Biologie

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, isolating intestinal lipoproteins is very difficult in vivo because they are first secreted from the small intestine into the mesenteric lymphatics. Chylomicron-containing lymph then empties into the subclavian vein from the thoracic duct to deliver components of the meal to the heart, lungs, and, ultimately, whole-body circulation. Isolating na&#239;ve chylomicrons is impossible from blood since chylomicron triglyceride undergoes hydrolysis immediately upon interaction with lipoprotein lipase and other lipoprotein receptors in circulation. Therefore, the original 2-day lymph fistula procedure, described by Bollman et al. in rats, has historically been used to isolate fresh mesenteric lymph before its entry into the thoracic vein. That protocol has been improved upon and professionalized by the laboratory of Patrick Tso for the last 45 years, allowing for the analysis of these critical lipoproteins and secretions from the gut. The Tso lymph fistula procedure has now been updated and is presented here visually for the first time. This revised procedure is a single-day surgical technique for installing a duodenal feeding tube, cannulating the mesenteric lymph duct, and collecting lymph after a meal in conscious mice. The major benefits of these new techniques include the ability to reproducibly collect lymph from mice (which harnesses the power of genetic mouse models); the reduced anesthesia time for mice during the implantation of the duodenal infusion tube and the lymph cannula; the ability to continuously sample lymph throughout the feeding and post-prandial period; the ability to quantitatively measure hormones and cytokines before their dilution and enzymatic hydrolysis in blood; and the ability to collect large quantities of lymph for isolating intestinal lipoproteins. This technique is a powerful tool for directly and quantitatively measuring dietary nutrient absorption, intestinal lipoprotein synthesis, and chylomicron secretion.

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

The present protocol describes a detailed surgical protocol for isolating flowing intestinal lymph in response to intraduodenal nutrient infusions in mice. This allows for the physiological determination of total intestinal lipid absorption and chylomicron synthesis and secretion in response to various experimental nutrients.

Die Isolierung von fließender mesenterialer Lymphe in Mäusen zur Quantifizierung der in vivo Kinetik der diätetischen Lipidabsorption und Chylomikron-Sekretion

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...