This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

<ol>
	<li>Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesions+of+the+vestibular+labyrinth.">Selective lesions of the vestibular labyrinth.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).</li><li>Dodson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+and+survival+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+guinea+pig+after+intracochlear+perfusion+with+aminoglycosides.">Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides.</a> Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).</li><li>Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-related+vestibular+and+cochlear+effects+of+transtympanic+gentamicin.">Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin.</a> The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).</li><li>Lee, K. S., Kimura, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ototoxic+drug+administration+to+the+endolymphatic+sac.">Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).</li><li>Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+application+to+the+round+window+of+the+gerbil+cochlea:+a+model+of+auditory+neuropathy+and+apoptosis.">Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).</li><li>Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window:+a+model+of+metabolic+presbyacusis.">Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).</li><li>Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocochlear+potential+and+endolymphatic+K++changes+induced+by+gap+junction+blockers.">Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers.</a> Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).</li><li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse.">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).</li><li>Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+administration+of+gentamicin:+a+new+method+for+the+study+of+ototoxicity+of+cochlear+hair+cells.">Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells.</a> Hearing research. 125, 109-119 (1998).</li><li>Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+gentamicin+application:+an+inner+ear+hair+cell+damage+protocol+for+the+mouse.">Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse.</a> Hearing research. 162, 65-74 (2004).</li><li>Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Bungarotoxin+application+to+the+round+window:+an+in+vivo+deafferentation+model+of+the+inner+ear.">beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear.</a> Hearing research. 265, 70-76 (2010).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+furosemide+treatment+and+age+on+cell+division+in+the+adult+gerbil+inner+ear.">Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+induces+apoptotic+cell+death+in+type+I+spiral+ganglion+neurons,+but+not+type+II+neurons.">Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+the+cochlea+of+an+auditory-neuropathy+animal+model:+effects+of+timing+after+injury.">Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).</li><li>Stevens, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heptanol+application+to+the+mouse+round+window:+a+model+for+studying+cochlear+lateral+wall+regeneration.">Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).</li><li>Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hearing+in+80+inbred+strains+of+mice+by+ABR+threshold+analyses.">Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses.</a> Hearing research. 130, 94-107 (1999).</li><li>Hequembourg, S., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+ligament+pathology:+a+major+aspect+of+age-related+cochlear+degeneration+in+C57BL/6+mice.">Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).</li><li>Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical-to-basal+gradients+in+age-related+cochlear+degeneration+and+their+relationship+to+'primary'+loss+of+cochlear+neurons.">Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons.</a> The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-related+genes+change+their+expression+with+age+and+hearing+loss+in+the+mouse+cochlea.">Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).</li><li>Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+select+genes+from+RMA+normalized+microarray+data+using+functional+hearing+tests+in+aging+mice.">Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice.</a> Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss:+GABA,+nicotinic+acetylcholine+and+NMDA+receptor+expression+changes+in+spiral+ganglion+neurons+of+the+mouse.">Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse.</a> Neuroscience. 259, 184-193 (2014).</li><li>Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+intracochlear+drug+delivery+enhanced+by+induced+advection.">Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea:+relations+to+age-related+hearing+deficits.">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279 (2014).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear.">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li></ol>

לא מתחרה אינטרסים כלכליים. יש המחברים אין לחשוף.

תוצאות הפרוטוקול והנציג שתוארו לעיל התקבלו במודל של עכברי CBA / CaJ כולל שני המינים. זן טהור זה מבוסס היטב כסטנדרט &quot;שמיעה טובה&quot; ומודל &quot;הזדקנות נורמלית&quot; בשמיעת מחקר. 16-23 תיאור של שימוש בפרוטוקול זה במודלים של יונקים אחרים הוא מעבר להיקף של הטקסט הזה. הקורא צריך לציין, עם זאת, כי יישום טכניקת RWN מציעה מספר יתרונות ללימוד האוזן הפנימית היונקים. מבין אלה, הבולטים ביותר הוא שזה ימנע שיבוש ישיר של המבנה האנטומי העדין והדרגתיות ביוכימיים שקיימים בתוך הקירות של הקפסולה otic. יש נהלים כגון cochleostomy וההשתלה של משאבות עירוי הנטייה להפר ישירות מבני אוזן פנימיים מובילים למשמרות סף קבועות; עובדה שיש לקחת בחשבון בעת ​​ניתוח תוצאות. שיבוש של מבני קיר לרוחב שבלול ידי metho פולשניתDS יכול גם להגביל את השימוש בסוכני ototoxic כגון פורוסמיד או heptanol, שספציפי אזור של השפעה מוגבלת למיקום זה. 15,24 גישות לא פולשנית אלטרנטיביות כגון הזרקת טרנס-התוף והזרקת parenteral כבר סובלים מתוצאות ולא אמינות / או רעילות מערכתית למודל החיה. שיטת יישום זה הוכיחה את עצמו להימנע משני חסרונות אלה, להשגת רמה של עקביות מתקרבת לזה של השיטות פולשניות יותר שנדונו לעיל. יתרונות נוספים של שיטה זו כוללים היא התחולה רחבה שלה למספר מודלים של בעלי חיים וההיתכנות לשלב תשתיות מעבדה קיימות. לגבי האחרון, אין חומרים כימיים או כימיקלים מיוחדים נדרשים מלבד הסוכנים, ההרדמה ומשככי כאבי ototoxic בחרו. סוכני ototoxic מנוצלים בדרך כלל בריכוז קבוע ומעורבים במספיק נפח גדול של פתרון (5 מיליליטר) ליימשכו זמן רב לשקולing כל יישום משתמש כ -10 μl (בעכברים). לפיכך, לאחר הרכש הראשוני של ציוד ומכשירים, חוקרים חופשיים יחסית מהכנת פתרון זמן רב או החלפה תכופה של חומרים. טכניקה זו מציעה גם הפחתה בזמן ניתוח, אשר עשוי להיות משמעותיים בהשוואה להליכים הכרוכים בהשתלה של משאבות עירוי perilymphatic או cochleostomies. עם הגיע לרמה של מיומנות טכנית, זמן הסיום הממוצע שלנו מחתך ראשוני לסגירה היה בדרך כלל 20 דקות לשעה 1.5 תלוי באורך של החשיפה הרצויה לסוכן ototoxic. שלושה או ארבעה ניתוחים עשויים בקלות להסתיים ביום אחד, ומאפשרים להתייעלות ופוטנציאל גבוה להשגת תוצאות מוצלחות. כפי שתואר לעיל, טכניקה זו יכולה גם להיות מיושמת בקלות למגוון רחב של מודלים של מכרסמים הכוללים עכברים, חולדות, חזירי ים וגרבילים. מגבלות של שיטה זו מרוכזות עלבינוני עקומה למידה תלולה דרושה כדי לשלוט בה וירידה בתוצאות הצפויות עד למיומנות טכנית. כפי שנדונו ביתר פירוט בהמשך, טעויות קטנות בגישה הניתוחית או ההדמיה מספקת של התחום כירורגית כמעט תמיד יובילו לתוצאה גרועה. ממצאים עדינים שטירון עלול להיכשל להכיר, כגון גישה תת מילימטר עבה בועת אוויר חסימה של סוכן הקרום העגול חלון או נוזל ביניים דילול הסוכן, לקחת את הזמן כדי להעריך ולפתח את כישורי פסיכו נדרשו לתקן אותם. עם זאת, עם ביצועים חוזרים ונשנים של ההליך המכשולים הללו בקלות להתגבר ומהווים אתגר טכני פחות מרתיע לחוקרים מחלק מהשיטות חודרניות האמורות. לבסוף, טכניקה זו קשורה למגבלה ביחס שפציעת שבלול יכולה להיגרם רק בנקודה אחת בזמן במהלך החשיפה כירורגית. זה ניתן להתגבר במידה מסוימת, על ידי מילוי RWN עם ספוג ג&#39;לטין נספג ספוג בסוכן כפי שתואר על ידי Heydt et al. 10 ספוג ג&#39;לטין נספג יהיה ממחזר לאורך זמן, אך יכול לאפשר לתקופה ארוכה יותר מהחשיפה הוא בר השגה באמצעות יישום של תמיסה מימית לבד. על מנת לממש את חוקר היתרונות מלאים של טכניקה זו ולהימנע מכל מלכודות, זה קריטי להכיר את שני אלמנטים קריטיים של טכניקה זו: 1) לשמור על ההדמיה של חלל האוזן התיכון וRWN באופן עקבי; ו 2) יכולת לשמור תחום כירורגית חופשי של נוזל ו / או דם ביניים. בהשגת לשעבר של אלה, חשיבותו של ראש-בעל נכון לא יכולה להיות הדגישה-על. קיבעון מאובטח של הראש של החיה מבטיח נוף יציב מתחת למיקרוסקופ; החשיבות שהופכת להיות ברורה בקלות כאשר מכשור עדין בצורה קיצונית משנה את מיקומם של מבנים בהגדלה. שעות טובותבעל EAD שניתן לסובב על הציר מקורי, הזנב של החיה גם מאפשר שינויים דינמיים חשובים בקו של החוקר של אתר. לעתים קרובות, כמה מילימטרים של סיבוב על ציר זה יכול להיות ההבדל בין ההדמיה של RWN ויזואליזציה של רק עצם כמוסת otic. היכולת לשנות את התצוגה כל הזמן היא גם בעל חשיבות עליונה להבטחת נוזל ביניים הוסר כראוי ממעמקי הנישה וגם כי סוכן ototoxic הוסר באופן מלא בין יישומים כפי שנדון בחלק 5. בניסיון, הדם, ההתעבות, או נוזל ביניים שלנו שנכנס לחלל האוזן התיכון היכולת להתערב בניסוי כולו. הדבר אינו מפתיע, שכן הכמות הקטנה של סוכן ototoxic להחיל חלון העגול (~ 10 μl) בקלות יכולה להיות מדוללת על ידי באים במגע עם אף כמויות קטנות של נוזל זר. מסיבה זו, לנתיחה כירורגית מוקפדת, פתיחה וכלת טיפין טיפין של הבולה התוף וpreservat זהירהיון של עורק stapedial הוא בבחינת תוצאות ניסוי מוצלחות. אם השלבים הקריטיים מעל הם נצפו ותוצאות צפויות עדיין לא הושגו, פתרון בעיות צריכה להתחיל. מניסיוננו, הוא לעתים קרובות מועיל לבצע וריאציות משפטם של שני אלמנטים פרוצדורליים. הראשון הוא לשנות את התדירות שבה סוכן ototoxic מתחדש בחלון העגול. בהתאם לסוכן בשימוש, הכולל זמן חשיפה הוא בין 30 דקות ושעה 1, עם הפתילה מלאה והחלפה הבאה של הסוכן כל 10 דקות. אם חשיפה לתקופות קצרות יותר, להגדיל את החשיפה כוללת עשוי לאפשר הסוכן יותר זמן כדי לפזר על פני חלון הקרום העגול. חשיפה וreplenishing נוספים עשויות גם לעזור כדי למנוע דילול רצוי של סוכן ototoxic על ידי דם, התעבות, או ביניים כפי שפורטו לעיל. זהירות יש לשמור בעת שימוש בגישה זו, עם זאת, כפי שהוא נוטה להגדיל את הסיכון של היסח דעתly נפגע עורק stapedial ו / או החדרת נוזל ביניים לRWN. טכניקה זו היא משמעותית במה שהיא מציעה לחקירות של פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה שבלול. טכניקה זעיר פולשנית מאפשרת מחקר מפורט של תהליכים ביוכימיים עדינים והייתה בבחינת בקידום המחקר שלנו במטרה להעריך פוטנציאל התחדשות שבלול. 12,24 גישה ניתוחית זו וחשיפה גם הוא לשחזר פני מגוון רחב של טכניקות שלוחה אחרות, ותוצאות מוצלחות באמצעות זה שיטה דווחו במחקרים של השתלת תאי גזע שבלול. 14 רבים נותר עלומה על השבלול, עם זאת, טכניקה זו, יחד עם הארסנל הרחב יותר זמין לחוקרים, תסייע בצמצום פער הידע הזה.

חוקרים השתמשו במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים כדי ללמוד את התפקוד התקין של מערכת השמיעה, כמו גם את הפתופיזיולוגיה של אובדן שמיעה. מודלים אלה הם גם מאוד שימושיים לביצוע מחקרי התערבות נגד תהליכים פתולוגיים שונים ומשמשים כבסיס ליישומי translational בבני אדם. עבור רוב המחקר מעורב השבלול והמסלולים השמיעתיים הקשורים אליו, במידה מסוימת של נזק או שיבוש חייבת להיות הציגה את המערכת. לעתים קרובות, הנזק מכוון בכוונה כדי ליצור נגע ספציפי, המאפשר לחוקרים לבחון את ההשפעה של נגע שעל תפקוד תקין, כמו גם את יכולת השבלול להתאושש מזה. בעת בחירת דגם מסוים של בעלי חיים ו / או טכניקה (ים) להחדרת נזק, מספר גורמים יש לקחת בחשבון על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר האפשרית. מודלים של בעלי חיים שונים עשויים להגיב באופן שונה להתערבויות, ואילו השפעות הישירות ועקיפות של טכניקה יכולות להיותלחלוטין מזיק לתוצאה הרצויה. ברוב המקרים, פרוטוקול הנזק באוזן הפנימי האידיאלי יהיה למנוע רעילות מערכתית, במהירות ובאופן אמין לייצר נזק, ליצור נגע מדויק ועקבי, ולהיות לשרוד כדי לאפשר מחקר נוסף של שינויים תפקודיים, תאיים ומולקולריים. באופן אידיאלי, שיטות אלה היו גם לשמר את שיפועי מייקרו-ארכיטקטורה ואלקטרוכימיים העדינים של השבלול למידה המרבית האפשרית. עד כה, חוקרים הצליחו בהקמת מספר הטכניקות כדי לגרום לפגיעה באוזן פנימית. רוב אלה כרוכים חושפים את השבלול לסוכן ototoxic או מערכתי או באמצעות גישה ניתוחית. טכניקות כוללות הזרקת parenteral, הזרקה תוך הצפק, הזרקת טרנס-התוף, הזרקת שק endolymphatic, וcochleostomy עם זלוף perilymphatic. טכניקות אלה היו בשימוש כדי להציג מגוון רחב של סוכני ototoxic, כגון פורוסמיד, גנטמיצין, ouabain, וheptanol. 1-5בעוד מוצלח ביצירת נגעי שבלול ספציפיים, הטכניקות לעיל גם הכירו את מגבלות. זריקות מערכתיות יכולות להיות רעילות מאוד לבעלי החיים ועשויות להיות קשורה עם עלבונות שבלול לא מכוון ותוצאות לא עקביות. החסרון האחרון גם נקשר עם זריקות טרנס-התוף. טכניקות כגון cochleostomy וזלוף perilymphatic, בעוד מסוגל גרימת נגעים מהירים ואמינים ביותר, הן באופן ישיר פולשנית למבנה אוזן פנימי ותפקוד. רבים מהגישות הכירורגיות קשורים גם עם רמה גבוהה של קושי טכני ועשויים לדרוש עוזבים חפצים זרים בבעלי החיים, כגון infuser micropump. 2-4,6-8 אין טכניקה אחת היא ללא חסרונות, וחוקרים צריכים לבחור שיטות בזהירות כדי שיתאימו לצרכימים הניסיוניים שלהם. כאן אנו מתארים, בפירוט, טכניקת יישום חלון הנישה העגולה (RWN) למסירה אקטואלית של סוכני ototoxic בעכברים בוגרים. אינטרנט אלחוטיתיארו ראשון על ידי אח הוזמן אל בשנת 1998 בזמן לימודי ההשפעה של גנטמיצין על ניוון תא שיער חושי במודל עופות, טכניקה זו נמצאה מסוגלת לייצר נגעים באופן משמעותי יותר אמין יותר מאשר יישום גנטמיצין מערכתי, תוך הימנעות הרעילויות כרוכות בכך. 9 מאז, מספר חוקרים אחרים, כוללים המעבדה שלנו, ניצל את הטכניקה הזו להצלחה גדולה. בשנת 2004, Heydt et al. התאים אותו למודל של עכברים ותיארו יכולת משופרת לשלוט בגודל נגע על ידי מילוי RWN עם ספוג ג&#39;לטין נספג ספוג בריכוזים שונים של גנטמיצין. 10 Palmgren et al., בשנת 2010, חקרו את השפעות ototoxic של בטא-bungarotoxin, חזק אלמנט בארס של הטיוואנית התאגדו ארגז, על ידי יישום צורה מימית שלו לRWN של חולדות מבוגרות. 11 בנוסף, מספר המחקרים קודמים מהמעבדה שלנו ניצל את גישת חלון העגולה כדי לחקור את ההשפעות של ototoxic furosemidדואר, ouabain, וheptanol. 5,6,12-15 תוצאות של מחקרים אלה הוכיחו את החשיבות של נוזל שבלול והומאוסטזיס יון בשמיעה נורמלית, גילה יכולת שגשוג תאים בגנגליון הספירלה וקיר לרוחב שבלול, וקדם את ההבנה שלנו הקשורות לגיל אובדן שמיעה. הגישה הבאה כרוכה בניתוח בגישה לאוזן התיכונה דרך חתך postauricular וunroofing החלקי של הבולה התוף הגרמית. זה מאפשר לחשיפה מצוינת של RWN והקרום שסוכן ototoxic נבחר ניתן להחיל באופן ישיר. הסוכן הנוזלי אז בריכות בחלולות כמו הכוס-של RWN (או לאט מנקז מנישא ספוג ג&#39;לטין רווי נספג ארוז בתוך RWN) ומפזר דרך הממברנה החלון העגולה לתוך חלל perilymphatic של פרוזדור השבלול. אין cochleostomy הישיר נעשה בגישה זו. יתרונות של שיטה זו כוללים שימור של אוזן הפנימית מייקרו-ארכיטקטורה, הימנעותרעילות מערכתית, קצבה של אוזן שליטת הפנים-חיה, הופעה מהירה של השפעה, ניוון סלקטיבית בסוגים מסוימים של תאי שבלול (למשל., סוג אני ספירלה נוירונים גנגליון עם חשיפת ouabain וסוג השבלול השני fibrocytes הנגרם על ידי הטיפול בheptanol), ותוצאות לשחזור / אמינות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עם כמה שינויים בין מיני מכרסמים אחרים, כוללים חולדות, חזירי ים, וגרבילים. חסרונות כוללים עקומה תלולה טכנית למידה וההגבלה היחסית של עלבון ototoxic שמוגבלת לנקודה אחת בזמן.

<table><tbody><tr><td>1-Heptanol 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2805&amp;nbsp;</td><td>&lt;a&gt;PubChem Substance ID 24895536&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ketaset Injectable&amp;nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637&amp;nbsp;</td><td>Concentrate 100mg/ml</td></tr><tr><td>(Ketamine HCl)</td><td>10 ml</td><td>Schedule CIII controlled substance</td><td></td></tr><tr><td>Anased Injectable</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NADA# 139-236</td><td>Concentrate 20mg/ml</td></tr><tr><td>Buprenex Injectable&amp;nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280&amp;nbsp;</td><td>Concentrate 0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>(Buprenorphine HCl)</td><td>5 ampules per box</td><td>Schedule CIII controlled substance</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Skin Prep Solution</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__&quot;&gt;MDS093941&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>1 Quart screw top bottle</td></tr><tr><td>0.9% Sterile Saline</td><td>Variable</td><td></td><td>For mixing solutions and injections</td></tr><tr><td>Operating Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>32192</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td><td>Industrial Acoustics Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical Head Holder</td><td>Custom Made &amp;ndash;&amp;nbsp;</td><td>Please see Figure 3</td><td></td></tr><tr><td>Medical University of South Carolina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch</td><td>World Precision Instruments</td><td>555801L</td><td>Maximum spread 20 mm</td></tr><tr><td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&amp;nbsp;</td><td>Emesco</td><td>Vintage Item</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle Size 6</td><td>Bard-Parker</td><td>MEDC-011990</td><td></td></tr><tr><td>#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&amp;nbsp;</td><td>Bard-Parker</td><td>SKU: 097-7215</td><td>50 Blades/Box</td></tr><tr><td>Via ACE Surgical Supply Code</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight Tip Jewelers Forceps&amp;nbsp;</td><td>Bernell</td><td>MIL17304</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors Curved</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__&quot;&gt;DYND04026&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors Straight</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__&quot;&gt;DYND04025&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111&quot;&gt;MDG3222111&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td><td>MytaMed</td><td>Item# 6.56.00</td><td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td></tr><tr><td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td><td>MytaMed</td><td>Item# 6.56.01</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Delicate Task Wipers&amp;nbsp;</td><td>Kimtech Science</td><td>CODE 34155&amp;nbsp;</td><td>White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td></tr><tr><td>House Ear Curette, 6&amp;rdquo; shaft, light angle</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486&quot;&gt;MDG0396486&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td><td>Medline</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201&quot;&gt;IIS34201&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>Substitutions may be made</td></tr><tr><td>Cotton pellets #3 4 mm</td><td>Richmond</td><td>Manufacturer Code 100108</td><td></td></tr><tr><td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td><td>Elmed</td><td>List No. 52-5770</td><td>Bipolar and Monopolar Capable</td></tr><tr><td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&amp;rdquo; length needle</td><td>BD</td><td>Product Number: 329410</td><td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td></tr><tr><td>23G, blunt tip, 1&amp;rdquo; length needle</td><td>Kendall</td><td>Product Code 8881202397</td><td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td></tr><tr><td>Surgical Mask</td><td>U-line</td><td>S-10478</td><td></td></tr><tr><td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td><td>U-line</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free&quot;&gt;S-12549&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Precision Hair Clippers</td><td>Wahl</td><td></td><td>Multiple models may be substituted</td></tr><tr><td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&amp;nbsp;13 mm 3/8 circle needle</td><td>Ethilon</td><td>1855G</td><td>Substitutions may be made.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Instant Sealing Sterilization Pouch</td><td>Fisher</td><td>01-812054</td><td></td></tr><tr><td>Dry Sterilizer</td><td>ROBOZ</td><td>Germinator &lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 500</td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

במחקר שנערך לאחרונה על ידי סטיבנס et al ניצול הפרוטוקול לעיל, עכברי CBA / CaJ מבוגרים משני המינים נחשפו באמצעות חלון דיפוזיה העגולה לheptanol. 15 Heptanol הוא בלתי-מצמד צומת פער ידוע לייצר ממוקדים, פגיעת ההשבה לתאים של קיר לרוחב שבלול. מטרת המחקר הייתה לייצר מודל אמין לנזק שבלול ממוקד, המאפשר לחקירה של התחדשות לאחר ניתוח של כל גורמים שנפגעו. ספי שמיעה ניתוחי פוסט טרום ניתוחיים ושימשו כנקודת קצה פונקציונלית. מיקרוסקופית וטכניקות צביעת immunohistochemical שמשו ללמוד שינויים מורפולוגיים. עליות משמעותיות בסף ABR נצפו בעכברים שטופל heptanol (איור 9). בעלי החיים שליטת קבלת ניתוח דמה, עם משלוח של תמיסת מלח במקום heptanol, לא הפגינו משמרות סף משמעותיות בכל תדרים נבדקים. Immunostaining נגד תיקון כלפי פניםערוץ אשלגן (Kir) 4.1 שימשו כשיטת עקיפה להמחשת נזק / התאוששות של מבני שבלול. זה הוכיח הבדלים מאוד לשחזור בין אוזני טיפול ושליטה. עוצמת צביעה בסך הכל הייתה במידה ניכרת ירד בvascularis stria (STV) ובין fibrocytes של רצועת הספירלה (SLF) 1-3 ימים לאחר חשיפת heptanol, המציין כמויות גדולות של נזק ממוקד לאזורים אלה. חלה ירידה מסוימת בעוצמת 4.1 צביעת קיר, באזורים מהסוג השני והסוג הרביעי SLFs (איור 10) וSTV (איור 11). עדות לשלמות שיבשו גרעינית ועיבוי כרומוזומליות / שלפוחיות אופייניות לאפופטוזיס הסלולרי נתפסה גם על counterstains הגרעיני באזורים אלה שבלול (איור 10). אזורי Vacuolated של קיר, 4.1 מכתימים נפתרו במידה ניכרת ב7 ימים ונעדרו לחלוטין בגיל 14 ימים. כאשר 4.1 עוצמת צביעת הקיר, הייתה לכמת בתחומי STV, אוזניים טופלו הפגינו initiשוקת אל ואחרי שינוי משמעותי (p &lt;0.05) חזרה לכיוון עוצמת שליטה 7 ימים לאחר חשיפת heptanol (איור 12). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> מכשיר 1. איור להגדיר. תיאור של הגדרה טרום ניתוחית של מכשור. כל הציוד צריך להיות נגיש בקלות בתחום ניתוח סטרילי. מכשור טיפוסי כולל 2 מספריים חדים לנתיחה, 2-3 ישר ו / או מלקחיים של Jeweler קצה המעוגל עם מגרדות אוזן, מרים otologic פיר מעוגל (מאוחר יותר הוחלף עם רוזן מרים - לא מוצג), ויחידת אלקטרו-כויה עם המלקחיים של Jeweler קצה המעוגל בסדר כיסוי ראש. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img aLT = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. אספקה ​​כירורגי. אספקה ​​נוסף לשמירה על איכות סביבת RWN. מגזרות labwipe מעוקרות להיווצרות פתיל נייר (משמאל), נייר בנוי היטב פתילות עשויים ממגבונים מעוקרים מעבדה (במרכז), ו -4 כדורי כותנה מ&quot;מ (מימין) משמש כדי לנגב את נוזלים עודפים והצפת דם בחלון הנישה העגולה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> איור 3. בעל ראש בעלי חיים. תמונה המתארת ​​את בעל הראש ובלוק נשיכה. החורים בבלוק להתאים ולאבטח את השיניים החותכות העליונות המרכזיות. מהדק מתהדק בעדינות על חוטם הגב כדי לאבטח את בעלי החיים במקום. שימוש בבעל ראש הוא קריטי עבור outc כירורגית מוצלחשת. באופן אידיאלי, זה צריך להיות מסוגל לסובב על הציר מקורי, הזנב של החיה כדי לייעל צפיות כירורגית של הבולה במהלך ההליך. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> איור 4. מ &#39;Cleidomastoideus.. גרף סכמטי המתאר את האנטומיה הבסיסית של שרירי צוואר רחם המכרסמים והקשר שלה עם וריד הצוואר החיצוני. שריר cleidomastoideus הוא השריר הכי המזוהה בקלות בגישה הניתוחית. שחרורו של fascia העוטף אחרי נסיגה אחורית / גב של גוף השריר ינחה נתיחה כירורגית כלפי הבולה התוף (העיגול שחור). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה באל</a>גרסת arger של נתון זה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> איור 5. אזור חשיפה כירורגית. מתאר את החשיפה לאחר הנתיחה דרך שכבות שומן תת עורי עורי ו. ציוני דרך מבניות של פתק כוללים סניף של XI עצב גולגולת שמעל שריר cleidomastoideus (), וריד הצוואר החיצוני (B), ורקמה חשופה הפרוטיד (C). סניף XI עצב הגולגולת קשור לעתים קרובות עם כלי שיט קטנים וחייב להיות מחולק לפני ההליך. מימין לשמאל בתמונה מתאימה לציר מקורי, הזנב של החיה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> איור 6. חשיפת buLLA. חשיפה של הבולה התוף לאחר נסיגה של cleidomastoideus ומבנים סמוכים. ציוני דרך בולטים ניתן למנות גוף שריר cleidomastoideus () בא לידי ביטוי בדיעבד / dorsally, עצב הפנים (ב &#39;), והכיפה המבריקה של periosteum התוף הבולה (C). כמו כן, שים לב לכניסה של שריר sternomastoideus בהיבט הזנב השמאלי של הבולה התוף (הכוכבית). נוכחותו של עצב הפנים בהיבט הגב ומקורי של הבולה היא ציון דרך קריטית לזיהוי נכון של הבולה. מימין לשמאל בתמונה מתאימה לציר מקורי, הזנב של החיה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> איור 7. חשיפת חלון נישה עגולה אני. תמונה המתארת ​​את tympaהבולה NIC נחשפה במלואו לאחר הנתיחה של periosteum שמעליה. חור הטייס ממוקם הטוב ביותר בנקודה באמצע הדרך בין קצה הזנב של כיפת הבולה וקו עדין אטום דמיין בתוך ההיבט מקורי הבולה (המייצגת את התוף). חור טייס שני, סמוך עשוי להקל בלתי קירוי קל יותר של עצם הבולה. הימנעות מקידוח עמוק יש לנקוט כדי לא לפגוע בעורק stapedial הבסיסי. האובייקט בחלק התחתון של התמונה הכהה, המתכתי הוא מפשק רקמות רכות טיטניום. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> איור 8. חשיפת חלון עגול נישה השנייה. בולה הסירה את מכסת התוף עם חשיפה של הנישה העגולה חלון (חץ) ועורק stapedial (מבנה אדום1-2 מ&quot;מ לרוחב הנישה) כפי שנצפה בהגדלה 20x. הנישה לעתים קרובות מטילה תחובה מתחת לזווית החדה שהוקמה על ידי כיפת הבולה עם הקפסולה otic בהיבט הזנב של הכיפה. זה הכרחי כי הדמיה מלאה של הנישה תושג לפני היישום של סוכן ototoxic או הפתילה. הסרת עצם מופרזת במהלך היא פתחה גם יש להימנע כנוזל / דם ביניים נטה להציף את החלל כאשר חורים גדולים נוצרו. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> איור 9. נציגי תוצאות -. ספים (ABR) הפסד Heptanol מושרה שמיעה והתאוששות ממוצעות הבדיקה ABR (dB SPL) זממו כפונקציה של PIP הטוןתֶדֶר. מדידות מקובצים לפי מראש חשיפה (שחורה-בקרה) ויום שלאחר ניתוח (POD) 1, 7, ו -14 (אדום). ברים שגיאה מייצגים SEM. איור מחדש זמם מאל סטיבנס et. 2014. 15 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> איור 10. נציגי תוצאות - ממוקדות נזק שבלול לאחר חשיפת חלק heptanol I. שינויים באשלגן פנימי מיישר (Kir) ערוץ 4.1 צביעה בתוך vascularis stria (STV) של אוזניים שטופלו בheptanol ולשלוט אוזניים. () רגיל Kir 4.1 מכתים אופייניים לאוזני שליטה עם זיקה חזקה לתא strial Kir 4.1 (ירוק). אוזן (ב) טיפול בPOD1. אזורי vacuolized הגדולים של decrזיקה הקלה Kir 4.1 נתפסות בתוך STV (ראשי חץ), יחד עם ירידה הכוללת בעצמה 4.1 מכתימה STV Kir. גרעינים counterstained עם יוד propidium (אדום) (ב). בר סולם = 15 מיקרומטר. איור מחדש זמם מסטיבנס et al, 2014 15 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> איור 11. נציגי תוצאות - ממוקדות נזק שבלול לאחר חשיפת חלק heptanol השנייה שינויים ברצועת הספירלה (SL) של אוזן טופלה heptanol לעומת שליטת אוזן.. הכתמה () רגיל Kir 4.1 (ירוק) בתוך SL הטיפוסי של אוזן שליטה בשנייה fibrocytes סוג המופיע נורמלי ספירלת רצועה (II). (ב) לא Heptanolאוזן reated עם ירידה ניכר בעוצמת 4.1 צביעת קיר, באזור של השני fibrocytes סוג ספירלת רצועה, שיבוש גרעיני ועיבוי כרומוזומליות / שלפוחיות בקנה אחד עם אפופטוזיס (חיצים). גרעינים counterstained עם יוד propidium (אדום). בר סולם = 15 מיקרומטר. איור מחדש זמם מסטיבנס et al, 2014 15 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> 12. תוצאות איור נציג -. שחזור של עוצמת מכתים שבלול בעקבות חשיפת heptanol ממוצעת בהירות היחסית של קיר, 4.1 מכתים זממה כפונקציה של יום לאחר החשיפה. בהירות יחסית תחושב כקיר, 4.1 בעוצמה רעיוני תחת מיקרוסקופ confocal בפינוק heptanolאוזני אד נלקחו כאחוז מאותו הדבר באוזני שליטה. נתונים POD14-28 הערה הם אספו כנקודה אחת על העקומה. חוגים מוצקים מייצגים ערכים ממוצעים ואילו ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע. התאוששות משמעותית של בהירות ביחס הודגמה בין 7 POD ומועדים מאוחרים יותר (עמ &#39;מבחן t של הסטודנט &lt;0.05, כוכבית). איור מחדש זמם מסטיבנס et al., 2014 15 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration at JoVE.com

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

the-mouse-round-window-approach-for-ototoxic-agent-delivery-rapid

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

17.2K Views.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

Video: The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) has been shown to be a useful approach to local drug delivery into the inner ear. The goal of this article is to describe, in detail, the surgical techniques involved in canalostomy in both adult and neonatal mice. As indicated by fast-green dye and adeno-associated virus serotype 8 with the green fluorescent protein gene, the canalostomy facilitated broad distribution of injected reagents in the cochlea and vestibular end-organs with minimal damage to hearing and vestibular function. The surgery was successfully implemented in both adult and neonatal mice; indeed, multiple surgeries could be performed if required. In conclusion, canalostomy is an effective and safe approach to drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice and may be used to treat human inner ear diseases in the future.

Here we describe canalostomy procedure which allows local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice through the semicircular canal with minimum damage to hearing and vestibular function. This method can be used to inoculate viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse inner ear.

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Genetics

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Neuroscience

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and genetic mechanisms that contribute to hearing loss. Introduction of vectors into the inner ear must be done in a way that widely distributes the agent throughout the cochlea while minimizing injury to the existing structures. This manuscript describes a post-auricular surgical approach that can be used for mouse cochlear therapy using molecular, pharmacologic, and viral delivery to mice postnatal day 10 and older via the round window membrane (RWM). This surgical approach enables rapid and direct delivery into the scala tympani while minimizing blood loss and avoiding animal mortality. This technique involves negligible or no damage to essential structures of the inner and middle ear as well as neck muscles while wholly preserving hearing. To demonstrate the efficacy of this surgical technique, the vesicular glutamate transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) mice will be used as an example of a mouse model of congenital deafness that recovers hearing after delivery of VGLUT3 to the inner ear using an adeno-associated virus (AAV-1).

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Bioengineering

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Trans-Tympanic Drug Delivery for the Treatment of Ototoxicity

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could interfere with the chemotherapeutic efficacy of the primary drugs. This is especially true for the drug cisplatin, whose anticancer actions are attenuated by antioxidants which provide adequate protection against hearing loss. Other current or potential otoprotective agents could pose a similar problem, if administered systemically. The application of various biologicals or protective agents directly to the cochlea would allow for high levels of these agents locally with limited systemic side effects. In this report, we demonstrate a trans-tympanic method of delivery of various drugs or biological reagents to the cochlea, which should enhance basic science research on the cochlea and provide a simple way of directing the use of otoprotective agents in the clinics. This report details a method of trans-tympanic drug delivery and provides examples of how this technique has been used successfully in experimental animals to treat cisplatin ototoxicity.

We present a technique for localized administration of drugs through the trans-tympanic route into the cochlea. Drug delivery through this route would not interfere with the anti-cancer efficacy of the chemotherapeutic drugs such as cisplatin.

משלוח סמים טרנס-Tympanic לטיפול Ototoxicity

The systemic administration of protective agents to treat drug-induced ototoxicity is limited by the possibility that these protective agents could ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...