Name: observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo at JoVE.com

This work was supported by a Project for Private Universities: matching fund subsidy from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan (T.I.) and Grants-in-Aid for Scientific Research (C) from MEXT (S.T. and K.N).

הפרוטוקולים ושימוש בחיות ניסוי אושרו על ידי ועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים באוניברסיטת של יאמאנאשי והאוניברסיטה ואסדה. טיפול בבעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. הכנת CPEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המנגנונים וחומרים הבאים: מיקרוסקופ סטריאו, מסוגל לשדר תאורה מלמטה רצוי; זוג המלקחיים שען (דומון # 3 או מס &#39;4), מעוקר להבה, מספריים הפעלה ישר, מעוקר להבה; שתי מנות 10 סנטימטרים פלסטיק סטרילית המכילות 20 בינוני ליבוביץ L-15 מיליליטר קר כקרח; זכוכית תחתונה מנות 35 מ&quot;מ המכילות 2 מיליליטר RT ליבוביץ בינונית L-15; כוס 100 מיליליטר המכילה 70% אתנול; גורי עכבר יילודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לטבול עכבר בילוד באתנול 70% ולהרדים במהירות על ידי עריפת ראש באמצעות המספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש מייד במדיום ליבוביץ L-15 קר כקרח בdi 10 סנטימטרים סטריליsh. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור ממִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת באמצעות זוג המלקחיים שען, לחתוך לפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת כדי לבודד את המוח כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח למנה חדשה המכילה בינוני ליבוביץ L-15 קר כקרח ולהתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולוודא כי המוח הוא שקוע לחלוטין במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את היבט הגב של המוח פונה כלפי מעלה, ולכוון את המוח כך שנורות חוש הריח מתגוררות במיקום השעה שלוש (לאנשים בידיים הנכונים). החזק את המוח בעדינות עם המלקחיים ביד השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לנתיחה הקנס (דומון # 3 או מס &#39;4) ביד ימין, חתך את כפיס המוח ומתחת parenchyma חיבור אונות המוח, לאורך בקע האורך של המוח הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את אונות המוח משם לצדדים לרוחב ולחשוף את סדק המוח הרוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את ההמיספרות על ידי צובט את הparenchyma דואר בין חצי הכדור והתלמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את מקלעת דמית העין חדרית הרוחב שמחוברת לצד לרוחב של ההיפוקמפוס ידי affixa lamina. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מקלעת דמית העין המבודדת לצלחת הזכוכית תחתונה 35 מ&quot;מ המכילה בינוני ליבוביץ L-15 טריים, וכיסוי במשקל (חומרי רשימה) בעדינות להחזיק את הרקמות במקום. </li></ol> 2. הדמית חיה של CPEC צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר אולטרה סגול נכון (UV) ומסנן לחתוך להסיק (IR) (ים) כדי לחסום אור קצר יותר מ -400 ננומטר ועוד מ 700 ננומטר, ושצפיפות ניטראלית (ND) מסננים (25% ו -6%) מוכנס בנתיב האור של מיקרוסקופ ההפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד של העדשה האובייקטיבית בערך לפי העין, ולאחר מכן להתאים את הקבל כך שהמרכז והמוקד כדי להתאים את תאורת קוהלר. פריזמה הכנס התערבות ההפרש לעומת זאת מתאימה (DIC), אלמנט דסק&quot;ש, כמו גם אלמנטי מנתח והמקטב בliדרך להילחם כדי להתאים אופטיקה דסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הניגודיות של תצוגה על ידי עמדת פריזמה דסק&quot;ש, כך שהמבנה של פני השטח הרקמה הוא מוכר ביותר. אם כל cilia של תאי המטרה הוא ניעתי, לא ניתן לקבל תצוגה ברורה של cilia ניע לפי העין בגלל התנועה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את נתיב האור למצלמת וידאו, והסר את מסנני ND להגדיל את כוח האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה בהתמקדות מצב כדי להתאים את שדה הראייה והמיקוד. במהלך התמקדות, שבתמונות וידאו מוצגות בזמן אמת על המסך, תצוגה ברורה של cilia ניע אינה זמינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה ב 200 הרץ עם זמן חשיפה של 0.1 מילים-שני לתקופה הרצויה (שניות עד דקות). לאחר רכישת מחסנית התמונה, מסגרות בודדות יציגו מבני הריסים ברורים. אם קצות הריסים הם מטושטשים, להגדיל את מסגרת הדולר או להשתמש זמן חשיפה קצר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התנועה של cilia CPEC בתוך 25-60 דק &#39;לאחר המתת חסד בליבוביץL-15 בינוני. </li></ol> 3. ניתוח של ריסי Motion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לעקוב אחר להכות דפוסים של כל cilium על צג המחשב. עמדות קצה ריסי מארק בכל מסגרת עם סמן העכבר, אשר התאסף למידע מסלול של כל cilium. או לנתח את מידע המסלול תוך שימוש באותה תוכנה או לייצא ליישומים כלליים יותר אחרים לניתוח נוסף. היעילות של צעד ניתוח זה מתואר בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג את המסלולים לשני מצבים של תנועה, גב ו-ושוב או סיבובי, לפי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תדירות פעימות הריסים (CBF) באמצעות הנוסחא הבאה: [CBF = (מספר הפריימים לשניה) / (מספר הפריימים ממוצע לפעימה אחת)] 14, שניתן להשיג מתרשים תנועת קצה הריסים (איור 3 ). חזור על חישוב זה למחזורי מכות הריסים מרובים, כי cilia האחר באותו התא יכול להפריע לתנועה של כל ciliuמ &#39;, וכתוצאה מכך אי סדירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האחידות הזוויתית של ריסי מכות צירים בתוך תא בודד, להגדיר את זווית θ מכות לכל מסלול (איור 4). למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים לקו ישר, ולהגדיר θ כזווית הקו עושה עם x -axis. למסלולים סיבוביים, שיתאים לעמדות לאליפסה, ולהגדיר θ כמו זווית הציר המרכזי של האליפסה עושה עם x -axis. פרטים של ההולם מתוארים בסעיף נציגי תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיאור כמותי של כל מסלול, לחשב AR יחס היבט הכללי. בקצרה, לסובב את המסלול על ידי - θ ולהגדיר AR כיחס בין הרוחב של ההפצה לאורך x - ו-axes y (איור 4). פרטים מוצגים בסעיף נציג תוצאות, והפרשנות, משמעות, וההגבלה של הפרמטר מתוארות בדיון. </li></ol> לדוגמא הכנה 4. לSEM הערה: SEM הוא שיטה חשובה להעריך את המצב של cilia על CPECs באופן מקיף. כדי להכין דגימות לSEM, הליך סטנדרטי שדווח בעבר 15 מועסקים בשינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתח את הרקמה מהמוח, להכין מקבע בבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר עם מכסה פוליאתילן. מקבע מורכב paraformaldehyde 2%, glutaraldehyde 2.5% (הפתרון של Karnovsky מחצית 16) במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרקמה מהמוח כמתואר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הרקמה המבודדת עם הפתרון של האנק המאוזן מלח (HBSS) בצלחת חדשה ולאחר מכן לתקן את הרקמות במקבעות בבקבוקון הזכוכית עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש טפטפות העברה חד פעמית ולטפל דגימות GEntly. לאחר השטיפה בHBSS, הרקמה הופכת דביקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעביר את הדגימות לפתרון מקבע, לגרש לאט כמות קטנה של תמיסה המכילה רקמה מפיפטה ההעברה כטיפה ומוסיף למקבעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לבטל את מקבע ולשטוף את הרקמה עם חיץ פוספט שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה בתמיסת סוכרוז 10% לשטוף את אלדהידים שנותרו. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מלא, לטבול את הדגימות בפתרון עבור 10 דקות ולאחר מכן לחזור פעמיים עם סוכרוז 10% טריים. שלב זה חשוב כדי להשיג פוסט קיבעון-נכון בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה בתמיסה של 1% tetroxide אוסמיום בחיץ פוספט למשך 30 דקות ולאחר מכן למקם על קרח להודעה קיבעון. לשפוט את מידת osmification על ידי צבע המדגם: כאשר אלדהידים יוסרו לחלוטין, המדגם הוא שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דגימות רקמה קבועות פוסט נרחב עם distille הכפולכמה פעמים מים ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הדגימות על ידי טבילה בריכוזים מדורגים של אתנול, בדרך כלל 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, ו -100%, במשך 10 דקות כל אחד. להשיג אתנול נטול מים על ידי הצבת הנפות מולקולריות ל99.5% אתנול מבקבוק חדש שרכש. חזור על התייבשות עם שלוש פעמים אתנול נטול מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות המיובשים לתוך אצטט isoamyl, מגיב חילוף לייבוש נקודה קריטי, במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מגיב זה מתאדה במהירות והמדגם יכול להיות יבש, וכתוצאה מכך הרס על ידי מתח פנים. לכן, לא לייבש את המדגם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חילופי הסופיים של אצטט isoamyl, להסיר את רוב הממס, מייד לעטוף את בקבוקון הזכוכית הפתוח בנייר אלומיניום, ומניח את הבקבוקון על קרח יבש. באמצעות מחט או מלקחיים בסדר, לעשות כמה חורים בנייר הכסף המכסה את הפה של הבקבוקון, כך שנוזל פחמן דו חמצני זורם בקלות לתוך הבקבוקון במייבש הנקודה הקריטי. להמשיך לשלב הבאמהר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, למזער את שריד של אצטט isoamyl לתוך התא של מייבש, אבל אל תנתנו לי המדגם להתייבש לפני ייבוש נקודה קריטי לחלוטין. בנוסף, אל תשאיר את המדגם על קרח יבש לזמן ארוך שלא לצורך, כדי למנוע היווצרות של כפור על הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בקבוקוני זכוכית עטוף בנייר האלומיניום המכילים דגימות הרקמה למייבש הנקודה הקריטית שמבטיח את המבנה של רקמות המשטח נותר בשלמותה בזמן שהכילו מים הסרת ברקמה. ניתן להשיג מידע מפורט על הפעלת מייבש הנקודה הקריטית מהוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית הדגימות באמצעות זהירות קיסם כדי למזער את הנזק מכאני. דגימות רקמה מיובשות וכתוצאה מכך הן שבירות. הר הדגימות של ספחי מתכת ומעיל עם זהב-פלדיום באמצעות גמגום יון. </li></ol> 5. תצפית על ידי SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב על ידי SEM ולהקליט תמונות עם מצלמה דיגיטליתמצויד למיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את נתוני תמונה דיגיטליים למחשב לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period.">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li><li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease.">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li><li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cilia+go+bad:+cilia+defects+and+ciliopathies.">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li><li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+in+vertebrate+development+and+disease.">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li><li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory.">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li><li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery).">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li><li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry.">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li><li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals.">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li><li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+vertebrate+cilia,+towards+a+new+taxonomy.">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li><li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry.">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li><li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+ciliary/flagellar+beating+of+Chlamydomonas.">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li><li>Lechtreck, K. -. F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain.">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li><li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow.">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O&#8217;Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li><li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A:+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-/-+mice+analysis.">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li><li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy.">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מאמר זה נועד בדיווח מתודולוגיה מפורטת להתבונן תנועתיות של cilia ברקמות מקלעת דמית העין מבודדת. חידושים מדעיים דווחו במחקרים קודמים 1,8.

פרספקטיבות של שיטה זו למרות שהטכניקה המתוארת כאן אינה מספקת ניתוח מפורט יותר של ריסים מאשר שיטות שפורסמו בעבר, את המשמעות של טכניקה זו מתגוררת בפשטות של המערכת ועלות האפקטיביות, אשר ניתן ליישם בקלות להקרנה בכל סוג של תנועתיות ריסי vivo לשעבר. בפרט, TI Workbench מספק ממשק פשוט וידידותי למשתמש המאפשר לחוקרים לבחון ולנתח תנועתיות הריסים בקלות רבה יותר. שיטות מעקב יעילות אוטומטיות לא פותחו עבור אובייקטי ניגודיות נמוכים כגון cilia בלא כתם במשופר וידאו ניגוד-דסק&quot;ש. למרות שהשיטה כדי לעקוב אחר תנועת הריסים היא ידנית בטכניקה זו, הסכום של מאמץ בניתוח מעקב אחר תנועת הריסים בצורה אופטימלית הוא מופחת בהשוואה לשימוש בחבילות תוכנה ייעודית לניתוח תמונה. נתיחת מדגם כדי להכין דוארדגימות vivo CPEC x, מניפולציות מהירות ועדינות נחוצות כדי לשמר את הכדאיות של הרקמות, אשר מבטיחה את תנועתיות של cilia vivo לשעבר. בגלל זיהום על ידי אריתרוציטים מטשטש את השדה של תצפית, שטיפה עדינה אך מורכבת של הרקמה גזור עם פוספט שנאגרו מלוח מומלצת מאוד. כדי להימנע מדימום, טיפול חייב להיות מופעל כדי למנוע את קריעת העורק דמית העין האחורית שיכול להיות מזוהה כמבנה דמוי חוט בולט אדמדם דבקו lamina affixa של מקלעת קולואיד. מיקרוסקופ מיקרוסקופ ההפוך מצויד באופטיקה דסק&quot;ש ומקור אור העברת הספק גבוה הוא חיוני לשיטה זו. בגלל מנורות כספית הן בדרך כלל אינן מסוגלות לעתים קרובות מיתוג לסירוגין, תריס מול דיור המנורה הוא הכרחי. כך או תריס ידני או חשמלי יכול לשמש למטרה זו. כדי להגן על דגימות וfr עיניו של הצופהUV אום ואור IR, מסננים אופטיים נדרשים כדי לאפשר רק אור הנראה (לעבור להקה 400-700 או שילוב של UV ומסננים לחתוך IR). מסנני ND גם צורך לשנות את כוח האור שמשתנה בהתאם למצב: ניטור על ידי העין, תוך התמקדות במצלמת וידאו, והקלטת הזמן לשגות במהירות גבוהה. עדשה אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה היא הכרחית לרזולוציה גבוהה. יש מרחק מסוים בין החלק העליון של coverslip והנקודה בגלל המורפולוגיה והעובי של רקמת מוקדי. לכן, עדשת טבילה במים ולא עדשת טבילת שמן עדיפה לאיכות תמונה טובה יותר. בידוד רעידות הוא גם הכרחי כדי להניב ערימות תמונה יציבה. שולחנות משליך סוג מיזוג שימושיים למטרה זו, אבל ריפוד פשוט של מיקרוסקופ על ידי הכנסת כדורי טניס מתחת לבסיס מיקרוסקופ עם שולחן יציב עשויים גם לעבוד. מצלמת וידאו מצלמת CCD מסוגל בלאהרח &#39;200 מסגרות / שנייה יש צורך לעקוב אחר התנועה של cilia. בעשור האחרון, מצלמות CCD עם שיעורי מסגרת מהר יותר (25-30 הרץ) שיעור וידאו הסטנדרטי הפכו זמינות בהרבה עלויות נמוכות יותר. מודלים מצלמה מסוגלים קצרות לחשוף פעמים מאשר מרווח המסגרת שימושיים להפחתת טשטוש עקב התנועה של cilia מבלי להגדיל את כמות הנתונים. זמן חשיפה של 0.1 מילים-שנייה ומרווח 5 אלפיות שני מסגרת (200 הרץ) הם תנאים מינימליים כדי להשיג תמונות הריסים של CPECs עם איכות מספקת. תוכנה הניתוח כדי לעקוב אחר התנועה של כל cilium זמן רב, במיוחד כאשר חבילות תוכנה ייעודית לניתוח תמונה משמשות למעקב אחר כל קצה הריסים. הפחתת מספר השלבים של משימות חוזרות ונשנות, כגון לחיצת עכבר על עמדת קצה הריסים על המסך, בחירת תפריט כדי להקליט את העמדה לחצה, ולחיצה על כפתור כדי לעבור למסגרת תמונה הבאה, תוצאות במחדש משמעותיduction של זמן ומאמץ. במחקר זה, שגרה מיוחדת התווספה לתוכנת TI Workbench מחוייט. במצב מעקב הריסים של תוכנת TI Workbench, המשתמש שומר looping פעולת שני שלבים פשוטים הבאה: הזזת סמן העכבר לקצה הריסים ולחיצה מקש חץ במקלדת כדי לקדם את המסגרת, אשר אינו דורשת ההעברה מצביע עכבר או עיניים של המשתמש להעביר (לתפריטים וכפתורים על מסך המחשב) מטיפי הריסים על מסך המחשב. התוכנה עוקבת אחר עמדות קצה הריסים, מציגה את המסלול המוקלט לסייע למשתמש, ויוצרת טבלה של מידע תנועת הריסים לניתוח נוסף. רוב התוכנות ייעודיות לניתוח תמונה מאפשרת פקודות מאקרו תכנות לעיבוד אצווה של משימות חוזרות ונשנות מסוג זה. תכנות מותאם אישית כגון להפחית צעדים חזרו מומלץ מאוד. ניתוח של מסלולים הפקת trajectories בוצע באמצעות תוכנת TI Workbench המותאמת אישית, כפי שתואר לעיל. ניתוח פשוט יחסית ועיבוד תמונה גם בוצעו באמצעות אותה התוכנה. עבור ניתוחים הולמים, מסלולו של כל קצה הריסים הועבר לתוכנת Pro איגור. גם תוכנת ניתוח מתקדם אחר כגון MATLAB יכולה לשמש למטרה זו. במחקר הנוכחי, בגלל הקשיים בסיווג המסלולים בגב ו-ושוב או מסלולים סיבוביים, המסלולים סווגו לפי העין בצורה עיוורת, אשר אושרו על ידי משקיף אחר, וכתוצאה מכך הסיווג עקבי. עם זאת, יותר מבחינה מתמטית קפדני אמצעים כדי לסווג את המסלולים ללא כל שרירות אפשרית יהיו עדיפים. אליפסה הולמת של המסלולים שנראה אידיאלי, אשר יכול לכמת את מידת סְגַלגַלוּת כיחס ההיבט של האליפסה המצויד () בשני-ושוב חזרה ותנועות סיבוביות. עם זאת, ניסיון להשתמש בהפצה של היחס הגובה-הרוחב להגדיר ערך סף לסיווג לא היה יעיל. הראוי לעתים קרובות נכשל למסלולי גב ו-ושוב, לעתים קרובות נכשלו הפרמטרים להתכנס, וראויים היה התכנסו חמקמק ככל הנראה. לכן, ראוי אליפסה לא אימץ לסווג מסלולים באופן אוטומטי או לכמת את סְגַלגַלוּת של כל מסלול. הראוי בוצע כדי לחלץ את כיוון הכאת הטיפים rotationally מרגשים כציר המרכזי של האליפסה המצויד. במחקר הנוכחי, AR הוצע לכמת את המידה שחורג ממסלול ליניארי אידיאלי תנועת גב ו-ושוב. הפרמטר הוא היחס בין הרוחב של הפצה בניצב לכיוון מכות שללאורך הכיוון. הערך צריך להיות אפס כאשר המסלול הוא קו ישר, ואחד, כאשר המסלול הוא מעגל, שמזכיר את יחס הממדים של האליפסה שהוזכר לעיל. בפועל, קבלת ערך AR יכולה להיות קלה יחסית על ידי החלפה של המסלול, כך שכיוון המכות הופך במקביל לx -axis (איור 4). כימות זה מוביל לערכים משמעותי ברורים לשני מצבים של תנועה, המצביע על פוטנציאל השימוש של הפרמטר לא רק לכמת את המאפיינים של כל מסלול, אלא גם לסווג יותר בקפדנות המסלולים. עם זאת, יש לציין שכיוון המכות עצמו הוא כבר התוצאה של תהליכים הולמים נפרדים לשני מצבים בשיטה הנוכחית. שיפור נוסף של הניתוח, כגון אלגוריתם הולם מתקדם יותר, עשוי לפתור את הבעיות של שרירות אפשרית. היבט לגבי סְגַלגַלוּת של המסלול הוא שהמכות של כל cilium CPEC לא ניתן מתרחשות במטוס שניצב בקפדנות x - y </em&gt; מטוס של התבוננות. למעשה, התוצאות של ההדמיה SEM משתמעות כי cilia CPEC לעתים קרובות מוטים, וההטיה עלולה להוביל לסְגַלגַלוּת או אנאיזוטרופיה של המסלולים נראות לעין. הכנה לSEM במהלך ההכנה לתצפית SEM, יש כמה נקודות חשובות שתבטחנה את הרכישה של תמונות באיכות גבוהות. ראשון, שלאחר קיבוע על ידי tetroxide אוסמיום חייב להתבצע בזהירות, כולל מראש כביסה עם תמיסת סוכרוז 10%. ללא קיבעון נכון על ידי הליך osmification, השלבים הבאים לא יכולים לשמור או לשחזר את המצב של הדגימות, שמוביל לאיכות נמוכה יותר של ההכנה. בגלל fixatives אלדהיד מצמצמים סוכנים, כל שנותרו אלדהידים בתוך הדגימה מעכבים את הפעילות של tetroxide אוסמיום, מגיב חמצון חזק. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מיותרים בדגימות, כביסה זהירה עם פתרון סוכרוז היא הכרחית. במקרים של פו הכי מוצלחST-קיבעון, הצבע של הדגימה אינו משתנה מחום עד שחור. שנית, היקף tetroxide אוסמיום חייב להיות לפחות פי 50 יותר גדולים מזה של המדגם. אחרת, לא ניתן לצפות קיבעון מספיק. שלישית, חשוב להימנע מייבוש של הדגימות מלאים, במיוחד במהלך תהליך ההתייבשות שמעסיק אתנול טהור ביותר ותצטטו isoamyl. ייבוש של הדגימה הורס את מבני משטח הדקים כגון cilia, וכתוצאה מכך תמונות עניות.

Cilia are hair-like projections on the surface of most vertebrate cells, which have attracted attention by medical researchers because of a class of diseases termed ciliopathies2&#8211;4. Despite the ubiquitous expression of the organelle, a wide variety of ciliary functions have been reported, including motility and biosensing. For example, motile cilia on the mucoepithelial surface transport mucus5 and epithelial debris to the outlet of tracts, thereby preventing disease by clearing the surface of epithelia. Moreover, during early developmental periods and embryonic stages, cilia regulate the proliferation of stem cells6, and are involved in the determination of left&#8211;right asymmetry of the vertebrate body7. 
Choroid plexus epithelial cells (CPECs) are derivatives of neuroepithelial cells that cover the surface of the choroid plexus tissue in the brain, which play important roles in maintaining homeostasis of the intracranial environment by production of cerebrospinal fluid (CSF). It has been previously demonstrated that CPECs have multiple non-motile cilia that regulate the production of CSF through G-protein-coupled receptors that are specifically concentrated on the cilia8. Although these cilia had been regarded as quiescent non-motile cilia, it was discovered that some CPEC cilia exhibit transient motility during the neonatal period1. This finding was quite important because it revealed that so-called non-motile cilia are not necessarily immotile from the beginning of development and might display transient motility during specific time windows, possibly in response to specific physiological demands and functions9. To precisely describe the motile nature of CPEC cilia, it is necessary to develop an ex vivo observation system that encompasses analysis of the kinetic profiles unique to CPEC cilia. 
With respect to motility, although several technical reports have described observations of the motile cilia of the tracheal epithelium5,10, motile single-cell flagella11, so-called conventional motile cilia12, and nodal cilia13, detailed analytical methods applicable to relatively undulated structures such as the choroid plexus have not been well documented so far. Moreover, a high time resolution is required to analyze the ciliary movement of CPECs, in which expensive high-speed cameras are indispensable. To circumvent this necessity and simplify monitoring the ciliary motility of various cell types, a low cost, high-speed camera has been introduced, and an easily accessible and convenient method to record the motility of motile cilia, especially to describe the speed and pattern of motion of each cilium, has been developed1. Moreover, original image analysis software &#8220;TI Workbench&#8221; has been used here to facilitate detailed analysis of motility. Collectively, this method provides a new concise strategy to analyze ciliary motion together with correlative scanning electron microscopy (SEM), which can be adopted in a wide range of cilium research.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Required reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for live cell imaging&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for SEM preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde&amp;nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>isoamyl acetate</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Sieves 4A 1/8&amp;nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>for preparation of anhydrous ethanol</td></tr><tr><td>phosphate buffer saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer, 0.1 M</td><td></td><td></td><td>To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1&amp;nbsp;M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 81.0 ml of 0.1&amp;nbsp;M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>monosodium phosphate (dihydrate)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>disodium phosphate (anhydrous)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>osmium tetroxide</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>dry ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tools and materials for dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for both live imaging and SEM preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>flat paper towel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Phi;10 cm plastic dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>straight operating scissors</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>watchmaker forceps</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 or -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for live cell imaging&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>glass bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for SEM preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>alminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml glass vial with a polyethylene cap</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>for specimen tranfer</td></tr><tr><td>toothpick</td><td></td><td></td><td>for specimen transfer</td></tr><tr><td>ion sputter with gold-palladium</td><td>Hitachi</td><td>E-1030</td><td></td></tr><tr><td>critical point dryer</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Microscopic equipment and materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for live cell imaging&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W mercury lump housing and power supply</td><td>Olympus</td><td>U-ULH and BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W mercury lamp</td><td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>DIC condenser, n.a. 0.55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>electrrical shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 and VMM-D1</td><td>manual shutter can be used.</td></tr><tr><td>band-pass filter (400-700&amp;nbsp;nm, &amp;Phi;45&amp;nbsp;mm)</td><td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>ND filter (&amp;Phi;45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combination of 25% and 6% ND filters are used</td></tr><tr><td>objective lens (water immersion) with DIC element</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td>high-speed video camera</td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&amp;#8805;200 Hz frame rate and 1 msec expose time</td></tr><tr><td>image acquisition / analysis software</td><td>in-hous software</td><td>TI Workbench</td><td>capable of acquisition at high frame rates.</td></tr><tr><td>PC for camera control / analysis</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>vibration isolation table</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>weight for tissue</td><td>Warner Instruments</td><td>slice anchor kits</td><td>It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed &amp;Phi;0.5&amp;nbsp;mm platinum wire.</td></tr><tr><td>cover glass (alternative weight for tissue)</td><td>Matsunami</td><td>made-to-order</td><td>A cover glass can be used as a tissue weight.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;for SEM&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>scanning electron microscope</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

סקירה של העבודה מוצגת באיור 1, כולל תמונות של המכשירים. תצפיות תנועה חיים של CPECs סרט 1 מציג סרט של CPECs מבודד מעכבר סביב הלידה, וסרט 2 מראה תצוגה מורחבת של התמונות בסרט 1. יש לציין כי טיפים הריסים בודדים הם פחות ברורים בתמונות סטילס בהשוואה לאלו בסרטים. איור 2 מראה מעקב של התנועה של שני cilia עם מצבים שונים של תנועה, גב ו-ושוב ותנועות סיבוביות, מהנתונים המוצגים בסרטי 1 ו -2. איור 3 מראה ניתוח פשוט של המסלולים של cilia, שבו הפרש המופע בשתי הקואורדינטות ברורה בתנועה הסיבובית. ניתוח של מסלולי קצה ריסי CPEC דה<html> שיטות זנב לנתח כל מסלול כמותית מוצגות באיור 4 עם איורים סכמטי של הגדרות θ זווית המכות () ותרשים זרימה של הניתוח עם תוצאות נציג (B). כדי להגדיר את זווית θ המכות למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים במהלך מחזורים מרובים לy = גרזן קו ישר + b, ולהגדיר את כיוון המכות כמו שלאורך הקו המצויד. הגדר את זווית המכות כאן כθ = Arc שיזוף. בגלל הקו ההולם לעתים קרובות לא מצליח לחלץ את הכיוון במקרים של תנועה סיבובית, להתאים את המסלולים סיבוביים לאליפסה, ולהגדיר את הכיוון שכלאורך הציר של האליפסה המצויד הארוך. לייתר דיוק, עמדות הקצה (x, y) במהלך מחזורי מכות מרובים מצוידות לפונקציה להלן. &quot;Width =&quot; 310 1.jpg &quot;/&gt; שם <img alt="משוואה 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52991/52991eq2.JPG" width="200" /> ראוי האליפסה כרוכה חמישה פרמטרים מתאימים: x 0, y 0, a, b, וθ. X - וקואורדינטות -spatial y של מרכז האליפסה הם x ו- y 0 0, בהתאמה. רדיוס הגדול והקטנה של האליפסה הוא A ו- B, בהתאמה. θ הזווית הוא הזווית שהציר המרכזי עושה עם x -axis, או זווית המכות. ייצוג סכמטי של פרמטרים אלה מוצג בלוח השמאלי של איור 4 א. הראוי מתבצע באמצעות תוכנת Pro איגור על ידי הגדרת הפונקציה המפורשת שתוארה לעיל. לאחר מכן, היסטוגרמה של מכות θ זווית לכל cilia לצפותד באותו התא הוא להתוות כמו היסטוגרמה עגולה (איור 2 באל Narita et. 8). התדירות מנורמלת מספר הטיפים הריסים ניתחו. יש לציין כי כל cilium מתפרש לשני θ ערכים בהיסטוגרמה המעגלית, למשל π / 4 ו3π / 4, שהוביל לחלוקה סימטרית של הכיוון. כדי להגדיר AR יחס היבט הכללי, עמדות קצה הריסים במהלך מחזורים מרובים מסובבות על ידי - θ (איור 4). על פי הסיבוב, שני-ושוב חזרה ומסלולים סיבוביים הפכו מופצים כ מקביל לx -axis, שבו הרוחב של ההפצה A ו- B, לאורך X- וy-צירים, בהתאמה, מוגדר כמחצית מ ההבדל בין המינימום והמקסימום. לכן, פרמטרים אלה הם רלוונטיים יותר לרדיוס הגדול והקטנים של האליפסה, A ו- B. AR אז מוגדר כיחס בין A ו- B על ידי AR = B /. תצפיות של האפיתל מקלעת דמית העין על ידי SEM SEM מאפשר התבוננות במבנה פני השטח הקנס של דגימות. הנוכחות של cilia על CPECs הוא אישר במהלך קורס הזמן התפתחותי. הופעתם של ריסים מרובים בCPECs הוא ציין ביום העוברי (E) 13, זמן קצר לאחר פיתוח מקלעת דמית העין מתחיל בחדרים לרוחב סביב E11. בשלב זה, התאים קטנים עם מראה משתנה בשלה, וטיפי הריסים פונים לכיוון כיוונים שונים. בE15, ציצה של cilia מרובה הוקמה בחלק העליון של משטח הפסגה, העומדים לצאת מmicrovilli שמסביב. ביום לידה (P) 2, cilia רבים קבוע בעמדה כפופה, המשקף את תנועתיות הריסים שנצפו על ידי הדמיה לחיות. בP14, רוב התאים בעלי ריסים מרובים שהם לא ניע, כמו גם microvilli w<html> ה- i מרקם עדין בהשוואה לשלבים המוקדמים יותר. איור 5 מראה תמונות SEM של CPECs עם ריסים בשלבים אלה. בהתבסס על הסרטים שמוצגים באיור 1 ו -1 סרטים, ברור שcilia ניע מוכר בקלות על ידי הדמיה לחיות. עם זאת, קשה להבחין cilia לא ניע על ידי מיקרוסקופ דסק&quot;ש. כתוצאה מכך, SEM הוא הכרחי כדי להבין מדינות הריסים הכוללות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig1.jpg" /> איור 1:. סקירה כללית של זרימת העבודה (א) מיקרוסקופ סטריאו. (ב) מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמת מכשיר טעון מצמידים (CCD). מסך (ג) מחשב במהלך ניתוח. (ד) יון גמגום. דגימה (ה) לSEM. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (ו). סרט 1.טען / 52991 &quot;target =&quot; / Figure_2.mov _ blank &quot;&gt; סרט של המבט מלמעלה של CPECs והריסים מגור עכבר P2 במיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה. בגלל המשטח לא סדיר של רקמת מקלעת דמית העין, תמונת מצב זו מכילה . שני האזור בתיבה מורחב בפוקוס ומטוסים מחוץ לפוקוס ולראות בסרט 2 בר סולם:. 2 מיקרומטר. סרט 2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52991/Figure_3.mov" target="_blank">סרט של התצוגה המורחבת של דגימת הרקמה בסרט 1.</a> הכאת cilia הראה תנועות סיבוביות או או לגבות ו-ושוב. בר סולם: 1 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig4.jpg" /> איור 2: צילה כינונה מחדש של המסלול של cilia CPEC מהזמן לשגות התמונות בסרט 2 (א) עם תנועה לאחור ו-ושוב (למעלה) ותנועה סיבובית (תחתונה).. דסק&quot;ש<html> תמונות מנתוני הסרט מוצגות ב 50 אלפיות שני מרווחים (1-8, סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר). העמדה של קצה ריסי היעד הוא הצביע על ידי ראש חץ. (ב) המסלולים (הקו שבור) ועמדות של טיפים הריסים (עיגולים צבעוניים) שמוצגים בתמונות הם כיסו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig5.jpg" /> איור 3:. שני מצבים של תנועת קצה ריסי CPEC מחדש מנתוני סרט תנועות נציג קצה הריסים, תנועה לאחור ו-ושוב () ותנועה סיבובית (ב &#39;), על מחזורים מרובים מוצגים כמסלולים (למעלה, ברים בקנה מידה: 0.5 מיקרומטר). קורסי זמן של X- וy-קואורדינטות של מיקום הקצה הם זממו, בהתאמה (באמצע). כדי להדגים שלב משמרת בין שתי הקואורדינטות, X- וy-קואורדינטות היו מנורמל [-1,1] ומעולף (למטה, קווים אדומים וכחולים, בהתאמה). igure 6 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg &quot;/&gt; איור 4: איורי סכמטי המתארים את הניתוח של מסלולי קצה ריסי הגדרות (א) לθ זווית המכות לגב ו-ושוב (פנל משמאל) ומסלולים סיבוביים (פנל מימין).. פרמטרים בנוסחא המתארים את האליפסה המצויד, a, b, x 0, ו- y 0, מוצגים בפנל הימני. (ב) תרשים זרימה של הניתוח ההולם של המסלולים להגדיר θ זווית המכות וAR. תוצאות בפועל של ההולם של מסלולי הנציג מוצגות בלוחות מהימין. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52991/52991fig7.jpg" /> איור 5: תמונת SEM של cilia. micrographs SEM נציג CPECs בE13, E15, P2, וP14. במהלך הזמן, CPECs גדל בגודל, ופיתח microviLLI וcilia על משטח הפסגה. ציצה של cilia בE13 היא עדיין לרכוש תנועתיות. בP2, כאשר היחס של ריסים עם תנועתיות הגיע לנקודה הגבוהה ביותר, רב cilia הכפוף הם נצפו. בP14, cilia לאבד תנועתיות. בר סולם: 5 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo at JoVE.com

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

12.1K Views.  Waseda University. In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Video: Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Developmental Biology

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Biology

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in neuroscience. As it is becoming increasingly clear that this tiny structure plays a crucial role in health and disease of the central nervous system (CNS), it is of utmost importance to properly dissect the CP out of the brain ventricles in a way that allows downstream processing, ranging from functional to structural analysis. Here, isolation of the lateral and fourth brain ventricle mouse CP without the need for specialized tools or equipment is described. This isolation technique preserves the viability, function, and structure of cells within the CP. On account of its high vascularization, the CP can be visualized floating inside the ventricular cavities of the brain using a binocular microscope. However, transcardial perfusion required for downstream analysis can complicate the identification of the CP tissue. Depending on the further processing steps (e.g., RNA and protein analysis), this can be solved by visualizing the CP via transcardial perfusion with bromophenol blue. After isolation, the CP can be processed using several techniques, including RNA, protein, or single cell analysis, to gain further understanding on the function of this special brain structure. Here, scanning electron microscopy (SEM) on whole mount CP is used to get an overall view of the structure.

The choroid plexus (CP), an understudied tissue in neuroscience, plays a key role in health and disease of the central nervous system. This protocol describes a microdissection technique for isolating the CP and the use of scanning electron microscopy to obtain an overall view of its cellular structure.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

The choroid plexus (CP), a highly vascularized structure protruding into the ventricles of the brain, is one of the most understudied tissues in ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Choroid Sprouting Assay to Study Ocular Microvascular Proliferation Ex Vivo

Source: Tomita, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61677">An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the development of an ex vivo model of choroidal sprouting to study ocular microvascular angiogenesis. The assay involves culturing mouse eye explants containing the choroid tissue attached to the sclera and retinal pigment epithelium under specific conditions that promote choroidal microvascular sprouting.

בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

Source: Tomita, Y., et al. An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis. J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

Isolating Immune Cells from Mouse Choroid Plexuses

Source: Dominguez-Belloso, et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63487">Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure of isolating immune cells from mouse choroid plexuses. This procedure is used in neuroimmunology research to understand how immune cells in the choroid plexuses impact brain health and various neurological diseases.

בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכבר

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board. 
1. ...

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video