Name: trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. דור קו Fly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שני מבנים שונים. במבנה הראשון, RpL10A cDNA (מקטע חלבון ריבוזומלי L10a) הוא משובט במורד הזרם של ה- GFP לפלסמיד pUASP-PL-GFP-Nter (שונה מגרסה 32). השימוש בתאי מין אמרגן מאפשר שימוש רב ערכי יותר של הקו המהונדס. הערה: קבל המבנה השני על ידי שיבוט רצף הרגולציה נהיגה ביטוי רקמות הספציפיות של גן נמושה במעלה הזרם של GAL4 (TF) באמצעות פלסמיד pPTGAL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק פלסמידים בנפרד לw 1,118 זבובים והכניסו בונה לתוך הגנום הזבוב על ידי החדרת P-יסוד (על פי נוהל סטנדרטי) 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transformants בחר כדי לשחזר קווים לטוס עם בונה על שני כרומוזומים שונים. קו המלכודת הסופי נוצר על ידי שילוב של שתי שורות אלה (צלבים גנטיים) על מנת לקבל קו יציב כפול מהונדס אחד. F0: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx להתראות, ביל; ארגון הנוער הקתולי / scu; נמושה Gal4 / TM6B. F1: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; נמושה Gal4 / TM6B. מסיבי להגביר את הקו הזה ולאסוף את העוברים הרצויים-מבוימים. </li></ol> אוסף 2. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8 כלובי אוכלוסייה גלילית גדולים המכילים כ -40 גרם של זבובים צעירים לכלוב (סביב 180,000 זבובים / כלוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם מה שנקרא מראש Lays-המאפשר זבובים כדי לנקות עוברים מתפתחים מoviducts. לשם כך, להניח את הזבובים לשעה 1 בשני מנות 11 סנטימטר פטרי בקוטר המכילות תערובת של מיץ הענבים ואגרו הקרושה ולכסות ⅓ של פני השטח עם שמרים להדביק טרי מתוצרת. לאחר 3 חילופי ענבי צלחות מיץ לאסוף את העוברים האמיתיים על צלחות טריות דומות. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לזמן-חלון התפתחותית למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מכלובים ולהשאיר אותם באותה הטמפרטורה לזמן הדרוש כדי להשיג שלב ההתפתחותי נכון (לדוגמא, 3 שעות של הטלת ביצים + 10 שעות של addit<html> הדגירה ional נותנת עוברים משלב 10-13 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL)). Resuspend תוכן הצלחת (עוברים, שמרי רסק, זבובים מתים) עם 50 מיליליטר של מים בעזרת מברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור סדרה של מסננות (700 מיקרומטר, 355 מיקרומטר, 112 מיקרומטר) כדי להפריד בין עוברים מזבובים מתים וחלקי גוף שנותרו ולאסוף עובר שמר על המסננת קטנה יותר בקוטר, ולאחר מכן לשטוף במים ללא יונים בקצרה. אין להשתמש יותר מ 18 צלחות לאוסף כפי שהוא יכול לסתום את מסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר dechorionate באקונומיקת 4.5% במים ללא יונים למשך 2 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים במשך 30-60 שניות. דגירה עובר בPBS Tween 0.01% 20, 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide, למשך 5-10 דקות ב RT תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים יבשים על גיליונות סופגים תאית ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. לשקול את הצינורות ופלאש להקפיא את העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי. בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים במשך כמה חודשים ב -80 ° C. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת חרוזים מגנטיים מצמידים את ה- GFP הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend החלבון G חרוזים מגנטיים בבקבוק המקורי על ידי תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 90 μl של חרוזים לצינור RNase ללא ולאסוף אותם על מגנט (30-60 שניות). 90 μl של חרוזים יש צורך לבצע immunoprecipitation (IP) עם 1 מיליליטר של lysate המכיל 60-80 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חלבונים. מכבד את היחסים כדי למנוע הרוויה חרוז. השתמש בכמה צינורות פי כמות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 1 × PBS 0.01% Tween (μl 500) 20 ולאסוף חרוזים על המגנט ללהשליך supernatant. הוסף 30 מיקרוגרם של נוגדן ה- GFP ב350 μl של PBS Tween 0.01% 20 לחרוזים ודגירה עם הסוף איטי לעומת סוף הערבוב במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט (30-60 שניות), להשליך supernatant ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome (Hepes 10 150 מ&quot;מ, MgCl 2 5 מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;מ DTT, טריטון 1%, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר מ&quot;מ, KCl , Protease מעכב 1 ×, מעכב RNase 100 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולהוסיף 500 μl של חיץ חסימה (BSA 0.1 מיקרוגרם / μl, שמרי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl, גליקוגן 0.1 מיקרוגרם / μl במאגר חילוץ polysome). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות ב RT וחזור על שלב זה פעם אחת עם חיץ חסימה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome, אז להיזכר חרוזים ולהמשיך מייד לשלב immunopurification (סעיף 6). </li></ol> 4. הכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, להגדיר את התכנית במטחנת חרוזים מהירות מהירה רב כיוונית: 2 × 10 שניות ב 5000 סל&quot;ד, הפסקה 15 שניות. העברת עוברים מיובשים (1.5 גר &#39;) ל- 15 מיליליטר צינורות prechilled על קרח המכיל מאגר מיצוי polysome, וhomogenize מייד. Homogenize 1.5 גרם של עוברים ב 4 מיליליטר של חיץ חילוץ polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי התפשטות הומוגני בשתי prechilled 2 צינורות מ&quot;ל ולטחון את אמברימערכת הפעלה על-ידי הפעלת תכנית homogenizer. העבר את lysate לתוך צינורות microcentrifuge prechilled טריים על קרח ולהכין supernatant פוסט-גרעינית ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור microcentrifuge prechilled טרי על קרח, להוסיף 1/100 נפח דגימה של 10% Nonidet P-40 לsupernatant (הריכוז סופי = 0.1%), ולערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופק צנטריפוגות המדגם בminifuge לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור, להוסיף 1/9 נפח דגימה של (ריכוז סופי 300 מ&quot;מ 1,2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) = 30 מ&quot;מ ), לערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך, ודגירה את התערובת על קרח למשך 5 דקות (תערובת על ידי היפוך מספר פעמים במהלך דגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לאחר המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20,000 ז. למדוד ריכוז חלבון בשיטה ברדפורד: הריכוז בlysate צריך להיות בין 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר. Tמתקין supernatant לצינור microcentrifuge טרי חדש prechilled ולהמשיך מייד לשלב טרום הקליטה (סעיף 5). </li></ol> 5. טרום קליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend חרוזים המגנטיים על ידי תסיסה עדינה ולהעביר 30 μl של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge ב RT (30 μl של חרוזים / 1 מיליליטר lysate העוברי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט, פיפטה את supernatant, וresuspend חרוזים במאגר polysome חילוץ (500 μl). לאסוף חרוזים על המגנט, להוסיף lysate העוברי, ודגירה עבור שעה 1 ב 4 ° C על הכתף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חרוזים ולשמור supernatant על קרח לצעד immunopurification. לפני immunopurification, לשמור של supernatant 100 μl (קלט) כדי להשוות מדגם RNA העולמי עם מדגם RNA שנאסף לאחר immunopurification, על ידי RT-qPCR למשל. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר (המקביל ל 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון) שלטרום נקלט lysate לצינור RNase ללא מכיל 90 μl של חרוזים חסומים מצמידים את נוגדן ה- GFP. דגירה הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם ערבוב הסוף-על-סוף עדין במסובב צינור. לחלופין, לבצע O הדגירה / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לאסוף חרוזים על המגנט. השתמש בminifuge לספין למטה חרוזים, אז resuspend אותם 500 μl של חיץ לשטוף (Hepes 10mm, 350mm KCl, MgCl 2 5 מ&quot;מ, Nonidet P-40 1%, DTT 0.5 מ&quot;מ, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר, RNase מעכב 100 U ) ולאסוף אותם על המגנט. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את חרוזים לצינור RNase ללא prechilled חדש ולשטוף פעמיים. לאסוף חרוזים על מגנט ולהמשיך למיצוי RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר Trizol ישירות לחרוזים ולעקוב אחר הוראות היצרן. </li></ol> 7. RNA ניקוי והערכת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת RNeasy מיקרו לפי הוראות היצרן. בסיום, elutRNA דואר עם (x) μl מים RNase חינם. חם למשך 2 דקות ב 60 ° C, וחנות snap-קפוא דגימות ב -80 ° C. לבדוק את איכות RNA באמצעות bioanalyzer (אחרי הוראות היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את הספציפיות של RNA TRAPed, לבצע שעתוק לאחור על 3 ננוגרם של RNA המטוהר (קלט ו- IP) על פי הוראות היצרן (עילי III). השתמש בcDNA שהתקבל עבור qPCR באמצעות ערכות פריימר גן ספציפי. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של תרגום ריבוזום זיקה טיהור (המכונה &quot;מלכודת-RC &#39;) מוקדש למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות בעוברי תסיסנית. מידע מסופק על השלבים העיקריים לבידוד מוצלח של RNA הספציפי עם תשואה המתאימה לmicroarray או ניתוח RNA-seq, כלומר כמות, 1) של חומר ביולוגי הנדרש והליך מותאם לתמוגה עובר וחילוץ polysome; 2) חרוזים / נוגדן לlysate יחסים לimmunoprecipitation האופטימלי; 3) על שלבים המאפשרים הפחתה של רקע כולל הרכב חיץ לשטוף כדי להריץ ניסויי מלכודת RC עם סגוליות גבוהות ורגישות. פרוטוקול זה מניב נתונים לשחזור שהופכים אותו בקלות מיושם על כל סוגי תאים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנתח ביטוי גני ההפרש ברמה של mRNA באופן פעיל-תרגום ובכך לסלול את הדרך להבנת ביטוי חלבון במפרט<html> סוג תא ific בחלון זמן מסוים. שים לב, עם זאת, שפע חלבון יהיה תלוי בקצב של תהליכי התרגום והשפלה. מגבלה עיקרית של שיטת המלכודת היא חוסר יכולתה למדוד את תכולת חלבון באופן כמותי מדויק או לזהות שינוי שלאחר translational. שיפור הכימות על ידי מדידת צפיפות הריבוזום לאורך גוף mRNA ו, בכך, באופן תאים מסוג ספציפי יכול לעשות TRAP בשילוב עם הריבוזום footprinting כלי רב עוצמה. במאמר האחרון 34, השילוב הזה בוצע בכליות 293 תאים עובריים אנושיים. המחברים רצו footprinting nuclease אחרי טיהור זיקה של טופס biotinylated מושרה של RpL10A באמצעות חרוזים streptavidin. זוהי הוכחה של עיקרון כי ניתן לבצע footprinting הריבוזום בהאורגניזם כולו תוך מיקוד סוג תא מסוים, ההגבלה להיות כמות החומר ביולוגי הנדרש לצורך. &quot;&gt; ביצוע ניסויי TRAP במקביל לניתוחי transcriptomic הגלובליים יאפשר לעקוב אחר פרופורציות בין חדש-עיבד וactively- תרגום RNA. זה יהיה מאוד אינפורמטיבי של המנגנונים שלאחר התעתיק הפוטנציאליים מתקיימים בהקשרים התפתחותיים ספציפיים או אוכלוסיות תאים ספציפיות מיקרו-רנ&quot;א -by למשל. לסיכום, TRAP הוא שיטה יעילה ביותר, ספציפית ורגישה לזיהוי RNAs חייב ריבוזומים פעילים-תרגום באופן ספציפי בתא. בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יצורים וסוגי רקמות. פרוטוקול מלכודת RC החדש שתואר כאן היה מותאם לאוכלוסיות נדירות של תאים (פחות מ -1% ממספר כולל של תאים) ולכמות חומר סופי מספיקה לניתוחים שלאחר מכן ברמה כל-הגנום. מגבלה אפשרית של שיטה זו היא הדרישה של נהג חזק כדי לייצר ריבוזומים מתויגים בכמות מספקת לcompete עם לא מתויגים אלה אנדוגני בסוג התא הממוקד. במחקר שנערך לאחרונה 25, מחברים מוערך 10-30% היחס מתויג לעומת הריבוזומים לא מתויגים. כדי להתגבר על בעיה זו הגדלת מספר עותק-EGFP כטב&quot;מ-RpL10A צריך לשפר באופן משמעותי את האיזון הזה. לחלופין, הוספה לרקע הגנטי תאר transgene כטב&quot;מ-GAL4 תגביר את הייצור של חלבון GAL4 ובעקיפין להגדיל ביטוי של RpL10A-EGFP. זה צריך להעדיף התפוסה טובה יותר של ריבוזומים מתויגים על mRNA. שים לב שגישה יעילה כבר זה יכול להתבצע אפילו יותר חזק על ידי התאמת שיטות משלימות להביא היבט הכמותי יותר או לגלות ולפענח מנגנונים מולקולריים שהם חיוניים לשליטת ביטוי גנים.

ההבנה כיצד תאי רכישת נכסים ספציפיים במהלך הפיתוח היא חיונית על מנת להעריך את המורכבות של איברים והתפתחות הפוטנציאל שלהם כלפי מצבים פתולוגיים. יש דחיפת מחקר גדולה לפענח את רשתות הרגולציה הגן שנמצאות בבסיס מפרט תא והתמיינות של פרופילי ביטוי גנים הגלובליים גילו דבר, מעמד מחייב פול השני, תפוסת תמלול בגורם על רצפים רגולטוריים או לאחר translational שינויים של ההיסטונים. כדי להעריך ביטוי גנים בmicroarrays רמה הגלובלי וגישות RNA-seq משמשות. Microarrays יאפשר לזהות שפע mRNA, ואילו RNA-seq הוא טוב יותר מותאם להלשנה על הסוגים השונים של RNAs כוללים קידוד וnoncoding RNAs כמו מיקרו-רנ&quot;א, lncRNAs או snRNAs. עם זאת, טכניקות אלה לא יכולים להבדיל באופן פעיל-עיבד, מצב יציב mRNA, פעיל-תרגום mRNA, וmRNA כניסה לתהליך הפירוק. מדידה יציבה-st<html> אכלתי רמות ה- mRNA ידוע להיות הערכה לקויה של הרכב proteome 1-3. בניגוד, זיהוי באופן פעיל-תרגום mRNA נותן תמונה מדויקת יותר של ייצור חלבון. עם זאת, מחקרי transcriptomic היו בעיקר הובילו ברמה כל-אורגניזם על ידי השוואת רווח או הפסד של פונקציה של גורם ספציפי למצב בר-סוג 4-7 או על רקמה גזור, מה שהופך את פרופילי ביטוי גנים קשים לפרש. התקדמות בכלי תא מיקוד, טיהור זיקה ושיפורי רגישות מאפשרת כעת לבצע הגנום מנתח באוכלוסיות קטנות של תאים או תאים בודדים אפילו באורגניזם חי. בדרוזופילה, אוספים גדולים של קווים מהונדסים יאפשר מיקוד של זמן ומרחב ספציפי של רקמות שונות ותת-אוכלוסיות תאים באמצעות מערכת GAL4 / כטב&quot;מ 8-10 מניב כימות מדויק יותר של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לתפקוד תא. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; בין גישות חדשות שפותח על ידי חלוקה polysome פרופיל תואר כדרך כדי ללכוד באופן פעיל-תרגום 11 RNA. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה שיפוע סוכרוז מאפשרת הבחירה של חלק polysome ונחישות של mRNA מתורגמת הגנום כאשר ניתחו עם microarrays או רצף עמוק. Polysome בידוד יכול להיות בשילוב עם מערכת עיכול nuclease לזהות עקבות ריבוזומלי המתאימות לברי RNA מוגנים על ידי הריבוזומים במהלך תהליך התרגום 12. footprinting ריבוזומלי מגדיל את הדיוק של כימות תרגום RNA ורזולוציה ברמת רצף RNA ומיצוב הריבוזום, מאפשר למדוד שיעור של תרגום. עם זאת, עד היום לא הוחלו על בידוד תא ספציפי של translatomes, בעיקר כתוצאה מהירידה החזקה בתשואת RNA המתקבלת בסופו של תהליך footprinting הריבוזום. בהתחשב בכך שבחירת הגודל של RNA עשויה ליצור שקר-p פוטנציאלositives מRNPs שונה שיכולים להיות גם הגנת RNA באופן דומה, יש צורך בהתפתחויות נוספות כדי לשפר את footprinting ריבוזומלי ולהתאים אותה לגישות תא ספציפי. אחת שיטות כגון, נקרא תרגם ריבוזום הזיקה הטיהור (TRAP) תוארה בשנת 2008 על ידי היימן ואח &#39;. ומיושם לבודד את translatome מקבוצת משנה של תאי עצב בעכברים. על ידי epitope תיוג חלבון ריבוזומלי באופן תאים מסוג ספציפי, polysomes יכול להיות מטוהר באופן סלקטיבי ללא צעד מייגע של ניתוק תא ומיון. במקרה זה, בשנתי ה -60 חלבון ריבוזומלי L10a על פני השטח של הריבוזום הייתה מתויגת עם 13 eGFP. מאז 2008, מספר מחקרים השתמשו בשיטה זו במינים שונים, מעכברי 14-19 לX. laevis 20,21, 22,23 דג הזברה וארבידופסיס thaliana 24. שיטת המלכודת גם הותאמה למודל תסיסנית ומשמשת לפוריםתאים מהסוג ספציפי פ.י. mRNAs מהתאים עצביים 25 והאסטרוציטים 26. מערכת GAL4 / כטב&quot;מ בינארי צדדי שימשה להביע RpL10A GFP מתויג באופן רקמות ספציפיות. ראשי הזבובים בוגרים נותחו לבצע בחירת polysome מהתאים עצביים (ממוקדים על ידי נהג Elav-Gal4 פאן-עצבי) וRNAs המבודד היו רצף. המספר הגדול של גנים מוסדרים עד תואם לאלה ידועים להתבטא במערכת העצבים, המצביע על כך שיש הגישה ספציפיות טוב וגרם לנו להתאים אותו לאוכלוסיות תאים נדירות (פחות מ -1% של תאים) נוכחי בפיתוח עובר תסיסנית . בתוך מודל דרוזופילה, השלב העוברי הוא מודל של בחירה לחקר תהליכים התפתחותיים, כשחקנים המולקולריים ותנועות המוךפו&quot;גנטי נשמרים אבולוציונית. גישות transcriptomic רקמות ספציפיות בלבד שנערכו עד כה במודל זה בוצעו באמצעות סלולארי או גרעיני כךrting והיה מסוגל ללמוד transcriptome מצב יציב 27-31 בלבד, יצירת צורך בשיטות מוקדשת לרקמה / פרופיל translatome תא ספציפי בעובר הזבוב. כאן אנו מדווחים פרוטוקול המלכודת הראשון מוקדש לעוברי תסיסנית. בשיטה זו, העוסק ב-התרגום mRNA באוכלוסיית תא מוגבל מאוד של כ -100 תאי שריר לכל עובר היה מבודד בהצלחה עם איכות וסגוליות גבוהים. GAL4 / כטב&quot;מ המערכת בינארי משמשת לנהוג הביטוי של RpL10A מתויג GFP בתת-אוכלוסייה של שרירים ללא כל רעילות, אין פנוטיפים לכאורה או עיכוב התפתחותי, כפי שמוצגים בעבר 25. עובר תסיסנית יש 30 שרירים לhemisegment שיהיה להצמיח השרירים של הזחל. על ידי שימוש באזור רגולטורים גילו בסביבה של גן זהות נמושה, 6 מתוך 30 השרירים רב-הגרעיניות ממוקדים. ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על mRNA באמצעות התארכות התרגוםמעכב cycloheximide. תמציות cytosolic משמשות לאחר מכן לטיהור זיקה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדן ה- GFP. איכות של RNA מטוהר קבלה תוקף באמצעות bioanalyzer. שעתוק לאחור PCR (RT-qPCR) שימש כדי לקבוע את הספציפיות ורגישות של בידוד mRNA והוכיח כי הפרוטוקול מותאם שלנו הוא יעיל ביותר.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

המערכת הגופנית עוברי תסיסנית השריר מורכבת של 30 שרירים לhemisegment, ויש לו כל שריר קבוצה מסוימת של מאפיינים: קוד של גני הזהות, עמדה, מספר אירועי היתוך, אתרים מצורפים ועצבוב. זיהוי mRNA המתורגם בתת-קבוצת שרירים ספציפית ייתן מידע על החלבונים הדרושים ליצירת מאפייני שרירים הספציפיים אלה. שימוש בשיטה מבוססת המלכודת, RNA מתת-אוכלוסייה של שרירים המבטאים את גן נמושה זהות הייתה מטוהר (1A-B איור). דאגה עיקרית של גישה זו היא באיכות והספציפיות של RNA הבודד. הפרוטוקול מותאם דיווח כאן אפשר התאוששות שיטתית של RNA באיכות גבוהה העריך עם ניתוח bioanalyzer. מופעי הפרופיל הושגו שום השפלה של RNA (איור 1 ג). במחקרים אחרים התפתחו סביב שיטת המלכודת, הועלו שאלות על הספציפיות של נתונים. כאן אנוmprove השיטה לדכא רקע קשור לאינם ספציפי מחייב של RNA לחרוזים או הצינורות ועל ידי אופטימיזציה של החיץ לשטוף. על מנת להעריך את רמת הרקע ויעילות של בידוד תאים לבטא-נמושה, שהובלנו ניסויי RT-qPCR על 3 חזרות של אותו השלב עוברי. מקפלים-מוספים של 4 גנים שונים (mef2, נמושה, פרוספרו, soxNeuro) חושבו בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32 (1D איור). תוצאות אלו הראו העשרת 2.3-פי של mef2 גן פאן-שרירי והעשרת 5.6-פי של גן נמושה. לעומת זאת, שני גנים המתבטאים במערכת העצבית היו מדולדלים בהשוואה לקלט. ערכי שינוי קיפול מאוד דומים נצפו על 3 משכפל ביולוגי, הוכחה כי הפרוטוקול הוא איתן. עם נהג נמושה-Gal4 ומתחיל עם 1.5 גר &#39;, סביב 1.5x10 ^ 6 עוברים התקבלו המכילים 100 תאי GFP / עובר (כוללת של 150 × 10 ^ 6 חיובייםתאים). לאחר הפעלת ניסוי המלכודת, התשואה היא סביב 25-45 ננוגרם של RNA המסוים תלוי בשלב של עניין. חומר זה הוא מספיק כדי להפעיל ניתוח microarray או RNA-seq באמצעות פרוטוקול הגברה לבנות ספריית RNA-seq. יעילות תהיה תלויה במידה רבה בכוחו של הנהג נהג להביע RpL10A-EGFP. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> איור 1. איכות והערכה ספציפי של RNA-מבודד מלכודת מנמושה-GAL4&gt; עוברי UASRpL10A-EGFP. (AB) תמונות Confocal של עובר בשלב 16 מראה ביטוי RpL10A-EGFP במיוחד בששת תאי שריר נמושה לhemisegment (). שיתוף לוקליזציה של RpL10A-EGFP עם Beta3tubulin סמן שרירים הכללי הוא ציין בתמונת מיזוג (B). בקרת איכות של TRAPed RNA ע&quot;ר (C)n על bioanalyzer מראה יושרה מושלמת של 18S rRNA ו -28. ניתוח (ד) RT-qPCR מראה סגוליות גבוהה של ניסויי mRNA-מבודד TRAP על 3 משכפל ביולוגי של שלב-16 עובר. מקפלים שינוי מחושב בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32. תמלילי Mef2 נוכחים בכל שושלות השריר הם מועשרים-2.3-פי השוואה לקלט ואילו תמלילי נמושה מוגבלים יותר הם 5.6-מועשר פי. תאים עצביים להביע פרוספרו וגני soxN מתרוקנים 2.2 פי 5.5 ופי בהתאמה. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Genetics

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochemistry

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

הכנה בינונית של

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

הר כולו RNA פלורסנט

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ