Name: floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בחלק ממיני צמחים, כגון פשתן (usitatissimum Linum), שינוי מפעל מוצלח היה מוגבל. בעבר, שינוי בפשתן דרש זיהום Agrobacterium ידי פצע ושיתוף טיפוח, יישום חלקיקי biolistic או באמצעות sonication אולטרסאונד, ואחריו התחדשות; תהליך שהוא גם ארוך ונוטה להיות מלווה באירועי מוטאציות רבים. יתר על כן, תהליך הבחירה של טכניקות אלה מחייב השימוש בסמנים לבחירת אנטיביוטיקה כגון kanamycin. עם זאת, זה כבר ציין בספרות כי שיטה זו של בחירה מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות, כפשתן נוטה לברוח ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה 6,9,14. חסרון נוסף של הטכניקות הקודמות בשינוי פשתן היה שיעורי שינוי הנמוכים 2,6. בפרוטוקול המתואר כאן, שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחונית-טבילה הוצגלהביא לשיעור שינוי גבוה לפשתן (50 - 60%). Transformants התקבל מפרחים טבלו ונאספו מענפים ראשיים וצד. בחירה של transformants החיובי פשוט על ידי גידול צמחי T1 על אדמה והקרנת העלים שלהם זמן קצר לאחר שהם נבטו, השימוש באנטיביוטיקת הבחירה עובר-ידי, צעד ששמש בעבר כנורמה בפרחוני לטבול למיני צמחים אחרים. על ידי ביצוע בדיקות PCR ישירות של עלים, ותוך שימוש בפריימרים T-DNA המתאימים, transformants החיובי ניתן לבחור במהירות. טכניקה זו היא פשוטה, זולה וקלה לביצוע, אך תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מאלה שדווחו בעבר לארבידופסיס ומיני צמחים אחרים בשיטה זו 1,10,12. כמו כן, שיעור השינוי המדווח הגבוה ביותר לפשתן. עם זאת, ישנם צעדים קריטיים בהליכים, לרבות הבחירה של שלב הפרח הטוב ביותר ואת ריכוז החומרים פעילי השטח הטוב ביותר, כך שAgrobacterium יכולה לחדור לתוך תאי הצמח בלי להרוג את איברי הפרח. אם שלב מוקדם ניצן משמש (איור 2 א) עם Silwet-77 ריכוז גבוה של יותר מ 0.05%, הפרח לא יתפתח ולא להגדיר זרעים. אם שלב מאוחר ניצן משמש (איור 2 ג), אם כי ייתכן שהשינוי יעבוד, זה יתרחש בקצב נמוך בהרבה. תוצאות דומות התקבלו עם שינוי לטבול פרחוני ארבידופסיס 1,4. לפרוטוקול זה, את כל השלבים פרחוניים נבדקו עם Silwet-77 ריכוזים שונים והבמה הטובה ביותר הייתה נחושה להיות שלב ניצן האמצע (איור 2 ג) עם Silwet-77 על 0.05% לטבילה הראשונה, ואחריו טבילה שנייה ב שלב הניצן המאוחר (איור 2 ג) עם ריכוז Silwet-77 מעט מופחת של 0.03%. השינוי גם עבד היטב באמצעות שלב הניצן המוקדם (איור 2 א) עם silwet-77 ריכוז נמוך של 0.003%, ואחריוטבילה שנייה עם שלב ניצן אמצע (איור 2) בSilwet-77 ריכוז גבוה יותר של 0.05%. בפרוטוקול זה, כמה פרמטרים אחרים ניסו לייעל את שיעור השינוי, אבל מצאו שאין לו השפעה על התוצאה הסופית. דוגמאות כוללות הארכת הזמן לאחר הטבילה שהצמחים שכבו על הצד שלהם ומכוסים בפלסטיק מיום אחד ליומיים; באמצעות OD של יותר מ 1 לתרבות Agrobacterium, במקום 0.5-1; להגדיל את זמן טבילה - 5, 15 דקות במקום 1-2 דקות. שוב אנחנו לא שמתנו לב כל השפעה על שיעור השינוי באמצעות אסטרטגיות אלה. הגורמים היעילים ביותר, עם זאת, נמצאו כי שימוש בצמחים בריאים בשלבי הפרח הנכונים, ובאמצעות ריכוז Silwet-77 הטוב ביותר. שם לב ששני מרווחי טבילה, עובד איכשהו זמן טוב יותר מאשר אחד, אף על פי שטבילת פעם אחת גם עובדת. שינוי לפרוטוקול זה יכול להיות מושגת על ידי reducin<html> g ריכוז Silwet-77 לקטנים כמו 0.003% בטבילה השנייה או שלישית. מאז Silwet-77 הוא רעילים, תוצאות ריכוז גבוהות מדי בפרחים מתפתחות בצורה גרועה, וכתוצאה מכך אין תשואת זרע. תדירות הטבילה יכולה להיות מופחתת לאחד, עם האירועים שני או שלישיים בוטלו אם הצמחים לא מחפשים בריאים והניצנים אינם מתפתחים היטב. מגבלה העיקרית של שיטה זו היא המספר הנמוך של פרחים המיוצרים על ידי הפשתן, המספר המצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, ומחזור החיים הארוך של פשתן. זה לוקח 6-8 שבועות מזריעת זרע יש ניצנים הראשוניים מוכנים לטבילה הראשונה ו8 נוספים - לאחר טבילה-10 שבועות כדי להגיע לדור T1. בסך הכל, טווח של 5 - יש צורך 6 חודשים כדי לקבל את דור T1. שלא כמו מיני צמחים אחרים, שפרח בכל עת של השנה, איזה פרח זני פשתן טוב יותר בזמנים מסוימים בשנה. תכנון כל כך מתחשב לטכניקה זו הוא חשוב. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; לסיכום, התוצאות שלנו לטבול פרחוני עם שני סוגי פשתן שונים: פשתן הסיבים, סטורמונט Cirrus (פלסטיק מגיב ו), ופשתן השמן, בתון (היציב ושאינו מגיב), מראים כי Agrobacterium - שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול הוא שיטה ישימה ויעילה לשינוי פשתן והוא יכול לשמש כדי להחליף את הטכניקות ששמשו בעבר לשינוי פשתן. השינויים בשיטה הפרחוני לטבול בפרוטוקול זה יהיו ישימים לשימוש עם כל מיני צמחים אחרים ואינו מוגבל לפשתן.

פשתן (usitatissimum Linum) הוא יבול חשוב גדל באופן נרחב לסיבים ושמניה. הפיכתו של הגנום הפשתן אפשרית עם טכניקות כגון פציעה, זיהום Agrobacterium, ושיתוף טיפוח בתרבית רקמה, יישום חלקיקי biolistic או sonication אולטרסאונד ואחריו התחדשות. עם זאת, יש טכניקות אלה חסרונות רבים, כולל נטייה לאירועי מוטאציות רבות וזמן ממושך כדי להשיג את הקווים מהונדסים. חלק משיטות אלה יכולים להיות גם יקר ודורש מניפולציה מיומנת ויעילה של המכשירים, וכתוצאה מכך שתילי התאוששות נמוכים. והכי חשוב, טכניקה אלה לעתים קרובות מובילה לשיעורי שינוי נמוכים 2,6. שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא גישה פשוטה ויעילה ליצירת צמחים מהונדסים. כבר זה באופן שיגרתי ומשמש בהצלחה למיני צמחים רבים כגון ארבידופסיס thalian1,4, truncatula Medicago 11, עגבניות 12, חיטה ותירס 13 10. עם זאת, זה לא היה נחשב כטכניקה מעשית עבור שינוי פשתן בשל מספר גורמים, כגון מספרים הנמוכים של פרחים המיוצרים על ידי פשתן, מספר מצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, גודל הזרע הגדול, והמעייל העבה, אשר יכול גם להיות בעייתי עבור תהליך שינוי גנטי כזה. בנוסף, מגזר הבחירה של הטכניקה הפרחונית לטבול דורש נובט זרעים הפכו בתקשורת צמח המכילה אנטיביוטיקה, עם progenies הפך מכובד המבוסס על היכולת שלהם לנבוט ולהישאר ירוקים, בעוד שאינו הופך progenies גם לא לנבוט או לנבוט אבל אקונומיקה במהירות ולמות. בספרות הנוכחית, זה כבר ציין כי פשתן wild-type נוטה לברוח ריכוז גבוה של בחירות אנטיביוטיקה, לייצר תוצאות חיוביות שגויות, ומה שהופך את הבחירה של progenies T1 מבוססעל עמידות לאנטיביוטיקה קשה 6,14 יותר. כמו כן, כאשר ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה נוסף לבחירה בינונית, שיעור השינוי שנצפה ירידה דרמטית 9. בפרוטוקול זה, השתמשנו Agrobacterium והשיטה הפרחונית לטבול להפוך קו של פשתן סיבים, נוצה סטורמונט (תגובה ופלסטיק), אשר הוכח להגיב ללחצים בסביבה על ידי שינוי הגנום שלו 3.5. כדי להתגבר על הבעיה בריחת האנטיביוטיקה, בחרנו לעשות בדיקות PCR ישירות של DNA מעלי T1, במקום בחירה על ידי הוספת האנטיביוטיקה לתקשורת הצמח. אנחנו ניצלנו את האנטומיה הפשוטה של ​​פשתן כדי לעקוב אחר פרחים ספציפיים בעת הטיפול. מערכת מעקב זה אפשרה בחירה של זרעים מפרחים מסוימים ונביטה על אדמה מבלי להוסיף אנטיביוטיקה. transformants החיובי פשוט זוהו על ידי בדיקות DNA המתקבל מעלים באמצעות o השיטה מהירה והיעילהPCR הישיר f. התוצאות שלנו מראות כי השיטה הפרחונית לטבול עבדה טוב מאוד בקו הזה של פשתן והביאה באופן מפתיע בשיעור גבוה מאוד שינוי (50 - 60%), גבוה מאלו שנצפו בעבר עבור thaliana ארבידופסיס, אשר דווח להיות 0.1-1 1%, וגבוהים גם ממיני צמחים אחרים 10,12. גם בדקנו מגוון נוסף של פשתה (פשתן שמן), בתון (יציב ושאינם מגיב), ונתונים הראשוניים שלנו מצביעים על כך שפרחים לטבול פועל גם עבור מגוון זה של פשתן. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות שAgrobacterium ופרחונית לטבול יכולים לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, ומהירה יותר מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. יותר חשוב זה תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מהשיטות האחרות של שינוי פשתן 2,6. האנטומיה של thaliana ארבידופסיס, שיש לו סניפים ופרחים רבים, maKES זה קשה להבחין טבל ולא טבל פרחים על אותו הצמח. לכן, מספר גדול של זרעים, כ -20,000 זרעים לכל צמח, צריכים להיות מוקרנים לזהות transformants החיובי 8. פשתן, לעומת זאת, יש פחות סניפים (סניף אחד עיקרי ומעט תופעות סניפים) ופחות פרחים, הפקה כ -100 זרעים לצמחים, המאפשרים לעקוב אחר פרחים בודדים וכדי לבחור זרעים מסוימים במהלך הקרנת תהליך. אנו מציעים כי פרחוניים לטבול הוא שיטה ישימה כדי להפוך כל מינים קרובים של פשתן, סוג של כ -200 מינים. שיטה זו נותנת שיעור שינוי גבוה בהרבה מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. כמו כן, אנו מציעים שהקרנת PCR הישירה של T1 עלה DNA היא דרך יעילה כדי להתגבר על הבעיה של בריחת עמידות לאנטיביוטיקה, כי לעתים קרובות מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות. הקרנת PCR ישירה יכולה להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים ואינה מוגבלת to פשתן. טכניקת מעקב זרע הפשוטה המועסקות בפרוטוקול זה יכול להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים עם הסתעפות האנטומיה דומה לפשתן.

<table><tbody><tr><td>Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&quot; pots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potting soil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greenhouse with appropriate light setting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electropheresis equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital imaging setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>Toxic, wear gloves</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>Binary vector PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator and cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic wrap and aluminum foil wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>speedSTAR DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN plasmid mini kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF enzyme</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligation kit</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא טכניקה המשמשת באופן נרחב בתחום של שינוי צמח וכבר דווח כמוצלח עבור מיני צמחים רבים. עם זאת, פשתן שינוי (Linum usitatissimum) על ידי פרחוני לטבול כבר דווח. לא המטרה של פרוטוקול זה היא להקים Agrobacterium ושהשיטה הפרחונית לטבול יכולה לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, יעילה, ויותר מכך, נותנת שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות של שינוי פשתן. לסיכום, תפרחות של פשתן היו טבולות בתמיסה של Agrobacterium ביצוע פלסמיד ינארי וקטור (בר T-DNA בתוספת רצף הכנסת Linum, LIS-1) 1 - 2 דקות. הצמחים הונחו שטוחים בצד שלהם למשך 24 שעות. לאחר מכן, צמחים נשמרו בתנאי גידול נורמלים עד הטיפול הבא. לעיבודים של טבילה חזר על עצמו 2-3 פעמים, עם כ 10 - מרווחי יום 14 בין הטבילה. זרעי T1 נאספו ומונבטים על אדמה. לאחר כשבועיים, progenies טופל נבדקו על ידי PCR הישיר; 2-3 עלים שמשו לכל צמח בתוספת פריימרים T-DNA המתאימים. transformants החיובי נבחרו וגדל לפדיון. שיעור השינוי היה באופן בלתי צפוי גבוה, עם 50 - 60% מהזרעים מצמחים שטופלו להיות transformants החיובי. זהו שיעור שינוי גבוה יותר מאלו שדווחו לthaliana ארבידופסיס ומיני צמחים אחרים, באמצעות שינוי פרחוני לטבול. זה גם הגבוה ביותר, אשר כבר דיווח עד כה, לשינוי פשתן בשיטות אחרות לשינוי.

איור 1 - 4 להמחיש כמה הצעדים בתוך הפרוטוקול. באיורים 1 ו -2, העלים סביב ניצני התפרחת נחתכים לחשוף אותם לתאי Agrobacterium והשלבים השונים הניצן ששמשו לפיתוח הפרוטוקול. איור 3 מציג את התהליך של פרחים לטבול פשתן. איור 4, תערוכות דוגמא לאופן שיכול להיות מתויגים הענפים העיקריים ולוואי וכיצד פרט פרחים יכול להיות במעקב ומזוהה. איור 5 מראה כיצד ניתן מונבטים progenies T1 בתקשורת צמח MS ולאחר מכן הושתל בקרקע לבגרות. איור 6 מדגים כיצד רושף פשתן סוג יכול לברוח ריכוזים גבוהים של kanamycin, המאשר ממצאים קודמים בספרות 6,9,14. איור 7 מראה דוגמא של ההגברה PCR ישירה מtransformants T1 החיובי. פרחי T1 נאספו ממ &#39;<html> יורה עין והצד השני של מפעל T0 יחיד. כפי שניתן לראות מPCR הישיר, 8/12 צמחי T1 נבדקו חיוביים על ידי PCR והעצימו אזורים השונים ברחבי T-DNA. פריימרים שלנו גם נועדו בין LIS-1 הכנס ומספר אתרי שיבוט (איור 7 ו- C). אנחנו השתמשנו פריימרים נוספים מהווקטור בינארי הצמח כדי להגביר מגזרים שונים של T-DNA, כגון הגבול השמאלי ושליחות קטלנית NOS (מידע לא מוצג) או גבול הימני ואתר מרובה שיבוט (איור 7D). פריימרים ספציפיים להוספת LIS-1 גם בשימוש בפרוטוקול זה (מידע לא מוצג). רשימה של פריימרים מסופקת בטבלה 1. עם זאת, הרצפים של פריימרים אלה תלויים ברצף של הווקטור בינארי צמח T-DNA ולהוסיף המשמש את הפרחים לטבול. אנחנו גם ציינו כי לא היה הבדל משמעותי בשיעור השינוי בין הפרחים שנאספו מהענפים הראשיים וצד. p-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" /> איור 1. חיתוך העלים סביב ניצני התפרחת העיקריים לחשוף אותם לתאי Agrobacterim. () הניצנים מכוסים על ידי עלים. עלים (ב) קוצצו סביב הניצנים לחשוף אותם. (ג) מוגדל תמונה ממפעל ב (א) לאחר החיתוך לחשוף ניצנים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> איור 2. שלבי הניצן השונים ששמשו בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השלב הטוב ביותר לשימוש עבור לטבול הפרחוני. () ניצן השלב מוקדם הוא approxima<html> tely 2 מ&quot;מ. ניצן שלב ביניים (B) הוא כ 5 מ&quot;מ. (C) ניצן השלב המאוחר הוא כ כ 1 סנטימטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> איור 3. התהליך של פרחים-טבילת פשתן. () התפרחות העיקריות הם טבלו בתקשורת החדירה המכילה את תאי Agrobacterium. (B) מוגדל מ(). (ג) הצמחים טבולים מונחים שטוחים עד ליום המחרת, והסניפים טבלו מכוסים בפלסטיק כדי לשמור על לחות גבוהה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> jove_content &quot;fo: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> סניפי איור 4. התהליך של אוספי מעקב פרחים וזרעים, מצמחי T0 טופל () דוגמא של הצמח כולו עם הסניף הראשי (הסניף הגבוה ביותר במרכז) והן בצד (B - D).. . דוגמא של פרחים מהענפים השונים (E) דוגמא של הזרעים שנאספו מפרחים בודדים (שכותרתו - k). מהסניף הראשי <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> איור 5. שתילי T1 גדלים ללא בחירת אנטיביוטיקה. (א) זרעי T1 הםמונבטים על תקשורת צמח MS. (B) transformants חיובי, כפי שנקבע על ידי PCR הישיר, מושתלים לאדמה וגדל לפדיון. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> איור 6. בריחה אנטיביוטיות, בעיה לבחירת T1, הוא להתגבר על ידי הקרנת PCR ישירה. זרעי פשתן () Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS ללא אנטיביוטיקה. זרעי פשתן (B) Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS + ריכוזי הגדלת של kanamycin (200 מיקרוגרם / מיליליטר, 600 מיליליטר / ק&quot;ג, 1 מ&quot;ג / מיליליטר). הזרעים (C) Wild סוג פשתן מונבטים בתקשורת צמח MS עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר kanamycin. (ד) PCR מפשתן wild-type וT1 שתיל באמצעות פריימרים kanamycin, כל amplified גן kanamycin (אגדות: EZ1: סמן DNA, FlaxS, flaxS wild-type, C: לשלוט שאינו טבול סניף, מא: צאצאי T1 מפרח &quot;&quot; שנאסף מהסניף הראשי, Sc, SD, Se, מדע בדיוני: progenies T1 של פרחים שונים &quot;ג, ד, ה, ו&quot; שנאספו מהענף הצדדי, W:. לא-DNA) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> איור 7. דוגמא של amplifications PCR המוצלח של progenies T1 בשיטת PCR הישירה. (א) תרשים של הווקטור בינארי הצמח + להוסיף LIS-1 המשובט. חיצים כחולים מציינים את המיקום של פריימרים PCR משמשים בהקרנה הישירה PCR (שונה מTakara). (ב) PCR עם פריימרים M13F + 3 &#39;(C) PCR עם פריימרים M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR עם פריימרים גבול תקין (RB) ואתר שיבוט מרובה (MCS) ** כל נתיב מייצג T1 מפרחים בודדים שנאספו מC: סניף שליטה (לא טבל), M: ag פרח הסניף הראשי, S: bc פרח ענף הצדדי &#39;. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מקור רצף פריימר קדימה </td><td> רצף 5&#39;-3 &quot; </td><td> מקור רצף פריימר הפוך </td><td> רצף 5&#39;-3 &quot; </td><td> טמפ חישול (° C) </td><td> הארכת זמן (שניות) </td><td> גודל צפוי (נ&quot;ב) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 להוסיף) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18 א (LIS-1 להוסיף) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חלק מפריימרים המשמשים לבדיקת PCR הישירה.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.2K Views.  Case Western Reserve University.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Genetics

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic resources available to study how plants adapt to environmental stresses, its value as a functional genomics model and tool has been limited by the lack of a feasible transformation system. In this protocol, we report how to generate stable transgenic S. parvula lines using an Agrobacterium-mediated floral-dip method. We modified the transformation protocol used for A. thaliana to account for unique traits of S. parvula, such as an indeterminate flowering habit and a high epicuticular wax content on leaves. Briefly, S. parvula seeds were stratified at 4 &#176;C for five days before planting. Plants were grown at a photoperiod of a 14 h light and 10 h dark and a 130 &#181;mol m-2s-1 light intensity, at 22 &#176;C to 24 &#176;C. Eight to nine week-old plants with multiple inflorescences were selected for transformation. These inflorescences were dipped in an infiltration solution of Agrobacterium tumefaciens GV3101 carrying the pMP90RK plasmid. We performed two rounds of flower dipping with an interval of three to four weeks to increase the transformation efficiency. The T1 seeds were collected and dried for four weeks in a container with desiccants before germination to screen for candidate transformed lines. Resistance to BASTA was used to screen T1 plants. We sprayed the BASTA solution three times with an interval of three days starting at two week-old plants to reduce false positives. A BASTA drop test was performed on surviving individual plants to identify true positive transformants. The transformation efficiency was 0.033%, yielding 3&#8211;4 transgenic plants per 10,000 T1 seeds propagated.

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Agrobacterium-mediated transformation using a floral-dip method can be successfully employed to create stable transgenic lines of the extremophyte model Schrenkiella parvula. We present a protocol modified from that for Arabidopsis thaliana, considering different growth habits and physiological characteristics of the extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Chemistry

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

השראת שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום והתחדשות בצמחים

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Author Spotlight: אופטימיזציה של פרוטוקולי טרנספורמציה שעירים מבוססי שורשים לשיפור היעילות ב-Brassicaceae

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus