Name: the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits
Uploaded: 2014-08-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits at JoVE.com

1 משטחים פולימריים שינוי עם recCD47 הערה:. הפרוטוקול מסוכם סכמטי באיור 1 איור 1 א ממחיש דור של משטחים פולימריים תיאול-reactive איור 1 מדגים דור של recCD47 תיאול-reactive.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של PDT-BzPh (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ואשלגן ביקרבונט (KHCO 3) (0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במים סטריליים. מערבבים לילה ב 4 ° C (להגן מפני אור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים צינורות פולימריים לחתיכות ארוכות 40 סנטימטר (ארוך מספיק כדי להתאים סביב גלגלים מסתובבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים צינורות בפתרון 0.1% מימיים של hexacylpyridinium ל90 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במכשירי צ&#39;נדלר Loop. יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים לאחר דקות 90 לספוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת הפתרון של PDT-BzPh מיום 1 על ידי הוספת 15% monobasic אשלגן זרחה מימיים (KH 2 </sub&gt; PO 4). הוסף 50 μl KH 2 PO 4 לכל מ&quot;ל של PDT-BzPh, ויצר פתרון micellar מעונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הצינורות בפתרון PDT-BzPh acidified ל40 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות עם חומצה אצטית מהולה (1: 1,000) פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצינורות לקרינת UV למשך כולל של 60 דקות. סובב צינורות ¼ להפוך כל 15 דקות כדי להקרין את פני השטח כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הצינורות בתמיסה של אשלגן ביקרבונט / מ&quot;ל 20 מ&quot;ג (KHCO 3) ל20 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים ולאחסן ב 4 ° C במים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג Sulfo-SMCC ב200 dimethylformamide μl (DMF) (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון Sulfo-SMCC הכין בשלב 1 כדי 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של תמיסת פולי ליזין recCD47, ומערבבים ל60 דקות ב roטמפרטורת אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך 60 מערבבים דק &#39;, דגת סטרילית בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) ומניחים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר Sulfo-SMCC הגיב recCD47 באמצעות טור 7K משקל מולקולרי חתוך ספין desalting לפי הוראות יצרן. אסוף זרימה דרך סופי (recCD47 תיאול-reactive באיכות גבוהה) ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של הצינור עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות מיום 2 עם סטרילי, degassed 3x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב משטח שונה של הצינורות עם פתרון של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP) בDPBS degassed פחות מ 2 דקות. יש לשטוף את הצינורות עם 4x DPBS degassed סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את recCD47 הגיב-Sulfo-SMCC לצינורות ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר או במנגנון. </li></ol></li></ol> .2 Immunoassay כימות recCD47 על משטחים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות שונה כדי לכמת מיום 3 שנינותDPBS 3x h. צינורות חנות אינו משמשים לכימות בDPBS על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בביופסית 4 מ&quot;מ כדי להפוך את דגימות צינור כפולות ומניח את האגרופים ביופסיה בבארות של צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שליטה שלילית בהיקף של מדגם צינור ללא שינוי לא טופל בנוגדן זיהוי. הכן שליטת נוגדן המורכבת ממדגם צינור ללא שינוי טופל בנוגדן זיהוי. הכן את דגימות בדיקת צינורות שונה שטופלו בנוגדן זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות בלוק עם אלבומין 0.4% בסרום שור (BSA) בDPBS ל60 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימה, BSA לשאוב ולשטוף עם שנאגרו מלוח טריס בתוספת 1% 3x (TBST) 20-Tween, 10 דקות כל אחד על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול עבודה של נוגדן בBSA 0.4% בהתאם לדילול המומלץ של היצרן לimmunoassays. לדלל CD47 האנושי נוגדן B6H12-FITC 1: 100 בBSA 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl דילול נוגדן לבארות מתאימות. אינקובטוריםבקרות שליליות te עם BSA 0.4% בלבד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות על שייקר (להגן מפני אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TBST 3x, 10 דקות כל אחד על שייקר. לשאוב שטיפת TBST האחרונה ולהוסיף 200 DPBS μl לבארות מדגם צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרימה דרך סופית, שהוא CD47 רקומביננטי תיאול-reactive באיכות גבוהה ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו עוצמת אות FITC באמצעות קורא microplate עם עירור FITC (485 ננומטר) ופליטה (538 ננומטר) הגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מחויב recCD47 למשטח פולימרים המבוססים על ערכים סטנדרטיים, והיוו אוטומטי הקרינה ואינה ספציפי מחייב ממדגם שליטת נוגדן. </li></ol> פרוטוקול מכשירים .3 צ&#39;נדלר Loop לחפש מוסדי מועצה לביקורת אישור (IRB) של פרוטוקול איסוף דם וניירת הסכמה מדעת לפני תחילת איסוף דגימות דם של בני אדם. השג מידעrmed הסכמת מתורם דם אדם. הערה: תרשים המתאר את המנגנון מוצג באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אמבט מים עם מים מזוקקים עד כ 1/2 של הגלגלים בקוטר שקועים. להוסיף מספיק אקונומיקה לאמבטיה המים כדי להפוך את פתרון אקונומיקה 10%. אמבטיה להגדיר מים ל37 מעלות צלזיוס ולאפשר טמפרטורה לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מתאמי מתכת (שמוצגים באיור 1 ב &#39;), צינורות ללא שינוי וצינורות שונה, ולהרכיב סביב גלגלי מנגנון, כפי שמוצג באיור 1 ג. ודא צינורות שמתאים מלבב סביב הגלגל עם מתאם המתכת במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 30 מ&quot;ל דגימת דם באמצעות פרוטוקול שאושר IRB, בבקבוקון מלא מראש עם 2 מ&quot;ל של ציטראט או נוגדי קרישה אחרים, ומערבבים על ידי היפוך כדי למנוע קרישת פעם אחת את הדגימה שנאספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 10 מ&quot;ל של דם לכל צינור באמצעות שסתום המתכת ומזרק, והשאיר קצת אוויר בצינור. אבטח את כובע השסתום וrסוב ל3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את הדם לתוך מבחנה פסולת שטופלה בתמיסת אקונומיקה 10% (או כפי שנדרש על ידי מדיניות מוסדית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ולשטוף פנים צינורות עם DPBS כדי להסיר כל העקבות של דם. אסוף זרימה דרך בכוס הפסולת. השלך דם בהתאם למדיניות מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את המכשירים וכל דם מחלקת משטחים באמצעות פתרון אקונומיקה 10% או פי מדיניות מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תהליך למיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופי או סריקת ניאון כפי שתתוארנה להלן. </li></ol> .4 פלורסנט מיקרוסקופית וספירה תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות ב4% פתרון PFA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, להסיר את PFA 4% ולשטוף סרטים מאוד בעדינות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את צינורות לחלקים על מנת לחשוף את פני השטח לומן לצביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתםסעיף של הצינור עם כמה טיפות של הרכבה תקשורת עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ל30 דקות בטמפרטורת חדר (להגן מפני אור). לאחר צביעה, יש לשטוף את צינורות בעדינות עם DPBS להפחית אות DAPI רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן DAPI ומצלמה דיגיטלית לספור את מספר התאים ב9 שדות בצורה עיוורת שנבחרו להציג תחת הגדלה 200X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשומה התא סופר לכל שדה ראיה ולבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות של תוצאות. </li></ol> .5 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% פתרון glutaraldehyde (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בפתרון glutaraldehyde 2% בין לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, בעדינות לשטוף 3x צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% מtetroxide אוסמיום (זהירות: סכנת משאיפת חמורה! השתמש במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בפתרון 1% מtetroxide אוסמיום 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את 3x צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של ריכוזי אתנול (25%, 50%, 75%, 95%, ו100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את צינורות על ידי דגירה בסדרה של ריכוזי אתנול. דגירה ב25%, 50%, 75%, ו95% אתנול ל20 דקות כל אחד. דגירה ב100% אתנול למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה קריטית לייבש את צינורות עם CO 2 דקות 45 כדי להסיר את כל הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי צינור הר על בדל דגימה עם דבק כסף או גרפיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי צינור מעיל עם 12.5 ננומטר של זהב-פלדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruck, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+applications+of+polymeric+materials.">Medical applications of polymeric materials.</a> Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).</li><li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+reaction+to+biomaterials.">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li><li>Levy, J. H., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+to+cardiopulmonary+bypass.">Inflammatory response to cardiopulmonary bypass.</a> Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).</li><li>Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+reactivity+to+hydroxylated+and+non-hydroxylated+polymer+surfaces.">In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces.</a> Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).</li><li>Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+of+self-assembled+monolayers+displaying+various+functional+groups.">In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups.</a> Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).</li><li>Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biomaterials+for+tissue+engineering+applications:+surface+modification+of+polymers.">Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers.</a> Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).</li><li>Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+cell+type-specific+interactions+between+CD47+and+human+SIRPalpha.">Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha.</a> Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).</li><li>Tsai, R. K., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+'self'+engulfment+through+deactivation+of+myosin-II+at+the+phagocytic+synapse+between+human+cells.">Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells.</a> J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).</li><li>Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).</li><li>Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).</li><li>Ravetch, J. V., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+inhibitory+receptors.">Immune inhibitory receptors.</a> Science. 290, 84-89 (2000).</li><li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+thrombotic+coagulation+of+blood:+a+method+for+producing+a+thrombus.">In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus.</a> Lab Invest. 7, 110-114 (1958).</li><li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubble-induced+aggregation+of+platelets:+effects+of+gas+species,+proteins,+and+decompression.">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platlet+accumulations+around+&#8220;air+bubbles&#8221;+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around &#8220;air bubbles&#8221; in blood after venous air embolism.</a> Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., Fainerman, V. B., W&#252;stneck, R., Kr&#228;gel, J., Trukhin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).</li><li>Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li></ol>

המחקר המדווח בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי ליו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, תחת מספר הפרסים R21 EB015612 (SJS), והלאומי ללב, ריאות ודם מכון, תחת מספר הפרסים T32 HL007915 (JBS וRJL), של הלאומי מכון לבריאות.

הכימיה photoactivation (המסוכמת באיור 1) מאפשרת לשינוי של כל משטח כמעט פולימר שיש פחמימנים מספיק כדי להקל על התקשרות PDT-BzPh וקרינת UV לאחר צילום להפעיל PDT-BzPh. Functionalizing משטח פולימרים עם קבוצות תיאול תגובתי מאפשר לקובץ המצורף שלאחר מכן של מגוון רחב של מולקולות הניתנות לבדיקה של עניין. במחקרים מסוימים שלנו בחרנו רקומביננטי CD47 11-13. הכימיה נטיה המסוימת שהשתמשנו בי מעורבת התגובה של הקבוצות האמינים של החלבון עם מקשר צלב bifunctional SMCC 11-13. זה סיפק recCD47 תיאול-reactive לתגובה שלאחר מכן עם משטח פולימרי thiolated. המוצר הסופי היה הצמדה מונו גופרתי קוולנטית מחייבת recCD47 לפולימר. כדי להבטיח שהקבוצות האמינים מחומצות אמינו בCD47 לא בשימוש לתגובה, ובכך מקלים את היעילותשל CD47 המשותק, אנחנו שונה יותר recCD47 ידי הוספת תג פולי ליזין בחלבון C-הסופי. זה יהיה אפשרי שאסטרטגיה מולקולרית דומה ניתן ליישם עם חלבונים אחרים. כך הכימיה נטיה שהוצגה כאן ובמקומות אחרים 11-13 מספק הזדמנות חשובה כדי להעריך את היכולת של מולקולות פוטנציאליות טיפוליות להעניק biocompatibility על משטחים סינטטיים. חסרון לפרוטוקול זה הוא שחשיפה לסוגים מסוימים של פולימרים, כגון פוליאוריטן, לתקופות ממושכות של קרינת UV יכולה לגרום לשינוי צבע. זה יכול להימנע על ידי הצבת הפולימר במנות פוליסטירן (נפוצה בתרבית רקמה), כדי למנוע שינוי צבע של הפולימר ללא מפריע photoactivation של PDT-BzPh. אורך הגל של אור UV שימוש בפרוטוקול זה הוא 302 ננומטר; חריגה מאורך גל זה יכול לגרום לתמונה-הפעלה לא יעילה של PDT-BzPh. אם אתם משתמשים באורך גל של שונהאור UV, אופטימיזציה של זמן חשיפה לקרינת UV יש צורך להבטיח צילום הפעלה משמעותית. בעקבות פרוטוקול זה מאפשר לקובץ המצורף של recCD47 למשטחים פולימריים, לצורך התחמקות חיסונית ומצב &quot;עצמי&quot; מעביר למשטח פולימרים כדי למנוע תגובת הגוף הזרה. כימות recCD47 צירפו אל פני השטח הושלמה באמצעות נוגדן שכותרתו FITC לתחום איג של CD47 באמצעות immunoassay ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3). מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת לחלבונים אחרים שצורפו למשטחים פולימריים בהנחה זמינות נוגדן. כישלון בהשגת תוספת משמעותית של recCD47 (או חלבון אחר) יכול להיות בגלל מגוון גורמים, כולל, אי photoactivate PDT-BzPh, פחמימנים חופשיים מספיק על פני השטח הפולימר, הידרופוביות של פני השטח פולימר, או הפולימר יכול להיות עבה מדי או אטום כדי לאפשר לאור לעבור לquantific ההולםני. כל אחד מהמשתנים הללו ניתן לבדוק באופן ניסויי ומותאם במיוחד לפולימר מסוים. מכשירי צ&#39;נדלר Loop הוא כלי ייחודי לניתוח vivo לשעבר של חשיפת דם אדם שלמה למשטחים פולימריים. מערכת זו דומה מאוד לטפטוף של דם דרך צינורות דם קליניים בשימוש בפרוצדורות רפואיות שונות, המאפשרת הניתוח של נקודות קצה פיסיולוגיות רבות הקשורים למשטחי פנייה דם. כנקודתי קצה פיסיולוגיות לתוספת של recCD47 למשטחים פולימריים, ספירת תאים באמצעות מכתים DAPI (איור 4) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 5) היו בשימוש. יכולים לשמש גם נקודות קצה אחרות, בהתאם לזמינות ציוד, למשל, ספירת תאים לפני ואחרי זלוף הדם דרך צינורות דם פולימרים יכולים לשמש גם. משטחים ללא קשר, הותאם-recCD47 הציגו באופן משמעותי תאים פחות דבקים בהשוואה למשטחי שליטה ללא שינוי. דה ואלהת&quot;א מצביעה על כך שrecCD47 מעביר biocompatibility למשטחים פולימריים ועלול לשמש כדי למנוע FBR בהליכים קליניים באמצעות צינורות דם פולימריים. למרות זאת הוא בשימוש נרחב במודל חוץ גופית ללימודי זלוף הדם, היא מוגבלת במובנים מסוימים. שני החסרונות העיקריים של שיטה זו נובעים מהדרישה לכלול אוויר בצינור עם דגימת הדם. האינטראקציה הדם תכופה עם אוויר יכולה לגרום ליקוציט והצטברות טסיות דם והחלבון denaturation 16-18, שעלול להפריע לנקודתי קצה מסוימים. שנית, האוויר נשאר בנקודה הגבוהה ביותר במעגל, המגביל את שיעור זרימת דם 19. למרות המגבלות ברורות של שיטה זו, זה גורם פחות נזק דם מאשר שיטות מתחרות 19 ומשמש כדרך של הקרנת biocompatibility של מולקולות ביולוגיות פוטנציאליות על צינורות דם פולימריים. ברגע שמזוהים מולקולות ביולוגיות מועמד דרךבשיטה זו, ניתן להשיג ניתוח נוסף באמצעות מודלים של בעלי החיים in vivo. סופו של דבר, ההתאמה הביולוגית של פולימרים שונה צריכה להיות מאושרת על שימוש מתאים במערכת מודל vivo.

נהלים רבים קליניים, כגון מעקף לב ודיאליזה, מחייבים את השימוש של צינורות דם פולימרים ולעתים קרובות קשורים לסיבוכים לאחר פרוצדורליים 1. כאשר perfused עם דם, פולימרים אלו לא חוקיים תגובת הגוף הזר (FBR), וכתוצאה מכך הספיחה של חלבוני דם וטסיות דם, הידבקות מונוציטים / מקרופאג, והשחרור של ציטוקינים פרו דלקתיים, כולם תורמים לסיבוכים וכדי שלאחר פרוצדורליים / או 2,3 כשל בהתקן. לפיכך, אסטרטגיות כדי לטפל בבעיה זו תישאר באזור חשוב ומתמשך של מחקר חומרים ביולוגיים. חוקרים ניסו לטפל בבעיה זו על ידי שינוי משטחי דם פנייה עם מולקולות ביו או bioinert 4-6. מחקר במעבדה שלנו התמקד בצירוף CD47 רקומביננטי (recCD47) לחומרים ביולוגיים פולימרים כאסטרטגיה לצמצום FBR ולהגדיל את היעילות של חומרים אלה. CD47 הוא transmembr הביע בכל מקוםחלבון ane עם תפקיד ידוע בהתחמקות חיסונית, מעמד של &quot;עצמי&quot; המקנה לי לבטא בתאים 7-10 ומופעים מבטיח בהענקת התאמה ביולוגית כאשר צורף למשטחים פולימריים 11-13. אות הרגולציה אלפא חלבון (SIRPα), קולטן מאותו המקור לCD47, וחבר במוטיב המבוסס על טירוזין immunoreceptor המעכב (עתים) המכיל משפחה של חלבונים הטרנסממברני, באה לידי ביטוי בתאים ממוצא מיאלואידית 14. אנחנו הוכחנו בעבר כי CD47, באמצעות איתות תא בתיווך SIRPα, למטה מסדיר את התגובות חיסוניות לפוליאוריטן (PU) ופולי ויניל כלוריד (PVC) במבחנה, vivo לשעבר, ובמודלי vivo 11-13. מרכזי לחקירות שלנו היא כימיה יחסית רומן photoactivation, שתתואר בהמשך, שבו קבוצות תיאול כימי תגובתי הן קוולנטית המצורפות לצינורות פולימריים ידי מגיב צינורות עם פולימר רב תכליתי (PDT-BZPh), מורכב מ2-pyridyldithio (PDT), benzophenone photoreactive (BzPh) וpolyallylamine-הותאם carboxy 11-13. צמצום קבוצות PDT המצורף קוולנטית עם טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) 11 מניב משטח thiolated שיכול להיות לאחר מכן הגיב בmoieties הטיפולי. המפורטים כאן ובעבר 12,13, recCD47, הותאם עוד יותר עם ​​התוספת של זנב poly-ליזין C-מסוף 12,13, הוא הגיב עם Sulfosuccinimidyl-4 [N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) עבור שעה 1 כדי ליצור קבוצות תיאול-reactive, המאפשר קשר monosulfide היווצרות בין צינורות ו11 recCD47. היכולת אנטי דלקתית של משטחי CD47 פונקציונליות נבדקה, לשעבר יו o, באמצעות מכשירי צ&#39;נדלר Loop עם דם אנושי כולו, שתואר בשנת 1958 במקור כמודל במבחנה של קרישה טרומבוטיים 15. המנגנון מסתמך עלמערכת צינור סגורה באופן חלקי עם אוויר ומנוע סיבובי כדי להפיץ את הדם דרך צינורות 15. מודל ניסיוני זה מספק את ההזדמנות כדי לבחון את ההשפעה של חשיפת דם על משטחים שונה וללא שינוי, כמו גם את ההשפעה של שינויי שטח אלה על הפיסיולוגיה של תאי הדם. יכול יצורף recCD47 למגוון משטחים פולימריים באמצעות כימיה photoactivation זה, והיכולת אנטי דלקתית שלה ניתן להעריך על ידי ניצול מודל ex vivo רלוונטי קליני מחקה זלוף דם על משטחים פולימריים 11,12. צינורות דם קליניים כיתה שונה עם recCD47 להראות פחות באופן משמעותי הטסיות ומצורפת תא דלקתי בהשוואה לפולימרים ללא שינוי כאשר הם נחשפים לדם אדם במנגנון. תיאור צעד אחר צעד של תהליך שינוי זה הנו כמפורט להלן.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>58906</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyde</td><td>VWR</td><td>AAA17876-AP&amp;nbsp;</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td><td>Synthesized in lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrate</td><td>Sigma</td><td>S5770-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Digital Camera</td><td>Leica</td><td>DC500</td><td>Out of production</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547-100ML</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Human CD47 (B6H12) &amp;ndash; FITC Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-12730</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide</td><td>Acros Organics</td><td>197450050</td><td>Caution! Use in fume hood</td></tr><tr><td>Potassium Bicarbonate (KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td><td>Terumo Cardiovascular Systems</td><td>60050</td><td>Most clinical-grade tubing will work</td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>JEOL</td><td>JSM-T330A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>Spectramax Gemini EM&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Sigma</td><td>M6035-10MG</td><td>Moisture Sensitive!</td></tr><tr><td>tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>H-1200</td><td>Light sensitive!</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalt Columns &amp;ndash; 7 K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>89891</td><td></td></tr></tbody></table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

תגובת הגוף הזר מתרחשת כאשר משטח סינטטי הוא הציג לגוף. הוא מאופיין על ידי ספיחה של חלבוני דם ואת הקובץ המצורף וההפעלה הבאים של טסיות דם, מונוציטים / הידבקות מקרופאג, ואירועי תא איתות דלקתיים, שמוביל לסיבוכים לאחר פרוצדורליים. מכשירי צ&#39;נדלר Loop הוא מערכת ניסיונית המאפשרת לחוקרים ללמוד את יחסי גומלין המולקולריים ותאיים המתרחשים כאשר כמויות גדולות של דם הן perfused מעל תעלות פולימריים. לשם כך, מנגנון זה שמש כמודל ex vivo המאפשר ההערכה של התכונות אנטי דלקתיות של שינויי משטח פולימרים שונים. המעבדה שלנו הראתה כי תעלות דם, הותאמו קוולנטית באמצעות כימיה photoactivation עם CD47 רקומביננטי, יכולות להעניק biocompatibility למשטחים פולימריים. צירוף CD47 למשטחים פולימריים יכול להיות אמצעי יעיל לקידום היעילות של צינורות דם פולימריים. שלהעין היא מתודולוגיה המפרטת את הכימיה photoactivation נהגה לצרף CD47 רקומביננטי לתעלות רלוונטיות קליני פולימריים דם והשימוש בלולאת צ&#39;נדלר כvivo לשעבר מודל ניסיוני לבחינת אינטראקציות דם עם תעלות CD47 שונה ושליטה.

יצירת משטחים פולימריים תיאול-reactive באמצעות PDT-BzPh וTCEP יחד עם תיאול-reactive פולי ליזין recCD47 באמצעות SMCC מאפשרת החיבור של recCD47 למשטחים פולימריים. תהליך השינוי הוא סיכם באופן סכמטי באיור 1. הנוחות של תהליך השינוי הזה היא שהוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים ושונים ומשטחים פולימריים שונים, הנחה החלבון יכולה להיות שונה עם קבוצות כימי תגובתי מספיק כגון lysines ומכיל האמינים שיש לו את הפולימר פחמימנים זמינים במידה מספקת. זה כבר הוכיח בעבר שrecCD47 יכול יצורף למשטחים פולימריים באמצעות פרוטוקול זה 11-13. כפי שניתן לראות באיור 3 א, מכתים FITC משמעותי גלוי לrecCD47, באמצעות נוגדן FITC- מצומדות לתחום תאי איג של CD47, אשר מותאם במיוחד לסרט, כפי שמוצגת על ידי ההדמיה דסק&quot;ש(איור 3 ב). תוצאות אלו מראות כי recCD47 יכול להיות מחוברת קוולנטית לסרטי פוליאוריטן. מדידת יחידות ניאון והשוואה עם עקומת תקן שנקבע הריכוז של פני השטח הכרוך recCD47. אנחנו הראינו כי recCD47 יכול יצורף למשטחים פולימריים ברמות עולה על 500 ng / סנטימטר 2,11-13. תוצאות אלו מאשרות כי פרוטוקול שינוי זה מבוסס תיאול פולימר יכול לשמש כדי לצרף חלבונים רקומביננטי הותאם פולי ליזין למשטחים פולימריים. CD47 הוכח להיות סמן של &quot;עצמי&quot;, המונעת מצורף תא דלקתי והפעלת מערכת חיסונית 7-13. כדי לחקות בתנאי vivo ככל האפשר בסביבה vivo לשעבר, יכול להיות perfused דם אדם שלם דרך צינורות פולימריים ללא שינוי והותאמו במכשירי צ&#39;נדלר Loop (שמוצג באיור 2). תא קובץ מצורף לצינורות ניתן להעריך באמצעות מכתים DAPI ( <sטרונג&gt; איור 4) וSEM (איור 5). ספירת תאים שהושגה באמצעות מכתים DAPI להוכיח שצורפה recCD47 באופן משמעותי (p = 0.004) מעכב מצורף תא בהשוואה למשטחים ללא שינוי (איורים 4 א &amp; 4B). ספירת תאי DAPI אושרה על ידי SEM, מדגימה רמות דומות של מצורף תא למשטחים שונה ללא שינוי וrecCD47 (איור 5). נתונים אלה מצביעים על תוספת של recCD47, באמצעות הפרוטוקול המתואר במסמך זה, באופן משמעותי מעכב מצורף תא דלקתי במודל ex vivo של זלוף דם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig1highres.jpg" /> סכמטי 1 דמותו של שינוי פני שטח. ) משטחים פולימריים Thiolated נוצרו על ידי דוגרים משטח פולימרים עם crosslinker photoactivatable PDT-BzPh וההפחתה שלאחר מכן עם TCEP. B) &lt;/ Strong&gt; SMCC שימש כדי לייצר recCD47 תיאול-reactive, שהיה אז הגיב במשטח הסינתטי thiolated להניב משטחים פונקציונליות recCD47. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig2highres.jpg" /> איור 2 תרשים של מכשירי צ&#39;נדלר Loop. ) המנגנון מורכב של אמבט מים מחומם ל37 מעלות צלזיוס, גלגלים מסתובבים קבועים על מוט מתכת המחובר למנוע רוטרי. זה הקים מאפשר למנוע הסיבובי כדי לסובב את הגלגלים, ובכך submersing חלקים של הצינור לתוך האמבטיה 37 ° C המים והטפטוף של דם דרך צינורות. B) מתאמי מתכת משמשים לחיבור הקצוות של צינורות ויוצרים לולאה סביב אחד מהגלגלים מסתובבים. דם נוסף לצינורות דרך יציאת שסתום המתכת והכתיר עם כובע השסתום. C) לאחר הרכבה, שסתום צינורות ומתכת צריך להתאים מלבב around הגלגל מסתובב, כפי שמוצג כאן עם צינור ריק. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig3highres.jpg" /> איור 3 קוונטיזציה של recCD47 על סרטי פוליאוריטן. נוגדנים המכוונים נגד תחום איג החיצוני של CD47 שמשו לכמת את כמות recCD47 חייב סרטי פוליאוריטן. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נלקחו תחת הגדלה 200X עם מערכות סינון מתאימות מראים זיהוי FITC של recCD47 המצורף לפוליאוריטן (). תמונות (ב &#39;) דסק&quot;ש מראות כי אות FITC היא ספציפית לסרט פוליאוריטן. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig4highres.jpg" /> איור הידבקות .4 סלולארי לפוליאוריטן ללא שינוי והותאם-recCD47. דם אדם שלם נאסף וperfused מעל ללא שינוי או שונה-recCD47סרטי PU עבור 3 שעות. בעקבות זלוף 3 שעות, סרטים היו שטופים עם DPBS, והתאים דבקו תוקנו עם PFA 4% לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס וDAPI מוכתם עבור 30 דקות בטמפרטורת חדר. תאים צבעוניים DAPI נספרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת הגדלה 200X ומערכות סינון מתאימות. (א) 9 שדות שנבחרו באקראי מבט נספרו עבור כל שינוי. (ב) נתונים הוא נציג של 9 שדות מבט ובאו לידי ביטוי כממוצע שגיאה סטנדרטית ± (p = 0.004). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig5highres.jpg" /> איור 5 ניתוח SEM של recCD47 שונה ומשטחי השליטה הבאים ניתוח ex vivo. דם אדם שלם נאסף וperfused מעל צינורות PVC ללא שינוי או שונה-recCD47 ל3 שעות. נציג תמונות להראות מצורף תא משמעותי לunmodifiעורך משטחים בעוד משטחים שונה-recCD47 להראות רק תא מצורף מדי פעם.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits at JoVE.com

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

השימוש ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מכשירי צ&#39;נדלר Loop להערכת Biocompatibility של צינורות דם פולימרית השתנה

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.6K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

Video: The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk of thromboemboli formation1,2,3. We have developed a method to line the inside surface of Ti tubes with autologous blood-derived human or porcine endothelial progenitor cells (EPCs)4. By implanting Ti tubes containing a confluent layer of porcine EPCs in the inferior vena cava (IVC) of pigs, we tested the improved biocompatibility of the cell-seeded surface in the prothrombotic environment of a large animal model and compared it to unmodified bare metal surfaces5,6,7 (Figure 1). This method can be used to endothelialize devices within minutes of implantation and test their antithrombotic function in vivo. 
Peripheral blood was obtained from 50 kg Yorkshire swine and its mononuclear cell fraction cultured to isolate EPCs4,8. Ti tubes (9.4 mm ID) were pre-cut into three 4.5 cm longitudinal sections and reassembled with heat-shrink tubing. A seeding device was built, which allows for slow rotation of the Ti tubes. 
We performed a laparotomy on the pigs and externalized the intestine and urinary bladder. Sharp and blunt dissection was used to skeletonize the IVC from its bifurcation distal to the right renal artery proximal. The Ti tubes were then filled with fluorescently-labeled autologous EPC suspension and rotated at 10 RPH x 30 min to achieve uniform cell-coating9. After administration of 100 USP/ kg heparin, both ends of the IVC and a lumbar vein were clamped. A 4 cm veinotomy was performed and the device inserted and filled with phosphate-buffered saline. As the veinotomy was closed with a 4-0 Prolene running suture, one clamp was removed to de-air the IVC. At the end of the procedure, the fascia was approximated with 0-PDS (polydioxanone suture), the subcutaneous space closed with 2-0 Vicryl and the skin stapled closed. 
After 3 - 21 days, pigs were euthanized, the device explanted en-block and fixed. The Ti tubes were disassembled and the inner surfaces imaged with a fluorescent microscope.
We found that the bare metal Ti tubes fully occluded whereas the EPC-seeded tubes remained patent. Further, we were able to demonstrate a confluent layer of EPCs on the inside blood-contacting surface.
Concluding, our technology can be used to endothelialize Ti tubes within minutes of implantation with autologous EPCs to prevent thrombosis of the device. Our surgical method allows for testing the improved biocompatibility of such modified devices with minimal blood loss and EPC-seeded surface disruption.

A method for seeding titanium blood-contacting biomaterials with autologous cells and testing biocompatibility is described. This method uses endothelial progenitor cells and titanium tubes, seeded within minutes of surgical implantation into porcine venae cavae. This technique is adaptable to many other implantable biomedical devices.

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Developmental Biology

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Engineering

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

אנגיוגרפיה תלת ממדית להערכת תאימות ורידים בכבשים

Quantifying Inferior Vena Cava Compliance and Distensibility in an In Vivo Ovine Model Using 3D Angiography

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native vessel into which they are implanted. Compliance matching with the native vessel is emerging as a key property for graft success. The current gold standard for assessing vessel compliance involves the vessel's excision and ex vivo biaxial mechanical testing. We developed an in vivo method to assess venous compliance and distensibility that better reflects natural physiology and takes into consideration the impact of a pressure change caused by flowing blood and by any morphologic changes present. 
This method is designed as a survival procedure, facilitating longitudinal studies while potentially reducing the need for animal use. Our method involves injecting a 20 mL/kg saline bolus into the venous vasculature, followed by the acquisition of pre and post bolus 3D angiograms to observe alterations induced by the bolus, concurrently with intravascular pressure measurements in target regions. We are then able to measure the circumference and the cross-sectional area of the vessel pre and post bolus. 
With these data and the intravascular pressure, we are able to calculate the compliance and distensibility with specific equations. This method was used to compare the inferior vena cava's compliance and distensibility in native unoperated sheep to the conduit of sheep implanted with a long-term expanded polytetrafluorethylene (PTFE) graft. The native vessel was found to be more compliant and distensible than the PTFE graft at all measured locations. We conclude that this method safely provides in vivo measurements of vein compliance and distensibility.

מחבר זרקור: הדמיה משופרת להתפתחות ניאו-וסקולרית במחקר מחלות לב מולדות

This protocol allows for the in vivo quantification of venous compliance and distensibility using catheterization and 3D angiography as a survival procedure allowing for a variety of potential applications.

כימות תאימות ויכולת הרחבה של Vena Cava נחותה במודל שחלות in vivo באמצעות אנגיוגרפיה תלת-ממדית

Synthetic vascular grafts overcome some challenges of allografts, autografts, and xenografts but are often more rigid and less compliant than the native ...

השימוש ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Microfluidic זרימה צ'יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

כימות תאימות ויכולת הרחבה של Vena Cava נחותה במודל שחלות in vivo באמצעות אנגיוגרפיה תלת-ממדית

כימות תאימות ויכולת הרחבה של Vena Cava נחותה במודל שחלות in vivo באמצעות אנגיוגרפיה תלת-ממדית