The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the&#160;US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister&#8217;s Hope Foundation.

.1 תרבית תאים של EMT אינדוקציה הערה: EMT יכול להיגרם על ידי טיפול בTGFβ או ביטוי חוץ רחמי של טוויסט גורמי שעתוק, חילזון, או Zeb1 / 2 בתאי האפיתל. שתואר בפרוטוקול זה הוא מערכת EMT מושרה באמצעות ביטוי של חלבון היתוך טוויסט-ER בתאים הונצחו אנושיים החלב אפיתל (HMLE / טוויסט-ER, מתנתו של ד&quot;ר J יאנג, UCSD) 9,11,29. עם 4 hydroxytamoxifen טיפול (TAM), טוויסט-ER חלבון היתוך translocates לגרעין לנהוג שעתוק ותוצאות במעבר EMT מלא ב12-14 ימים 9,11,29. מערכות נוספות EMT מושרה, כגון HMLE / החילזון-ER, HMLE / TGFβ, וMCF10A / TGFβ, ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו 11,30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HMLE / טוויסט-ER במדיום גידול של תאי אפיתל החלב סרום ללא (MEGM) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. מעבר התאים כל 2-3 ימים שבם מגיעים למפגש 80%. דגירה תאים עם טריפסין 0.15% ב37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להשבית טריפסין עם עגל בסרום 5% / DMEM. ספין למטה תאי resuspend אותם בMEGM. פלייט תאים בצלחת תרבית רקמה חדשה ביחס של 1 עד 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר TAM באתנול כדי להפוך את פתרון 200 מיקרומטר. הגן על TAM מהאור והחנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, טרי להוסיף TAM לתקשורת MEGM בדילול 1: 10,000 כדי להפוך את הריכוז סופי של 20 ננומטר TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של EMT, תאי צלחת 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר בשני עותקים. תרבות תאים עם 20 תקשורת ננומטר MEGM TAM המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת 10 סנטימטר בשני עותקים ולטפל בתאים עם אתנול 0.01% כביקורת שטופל הלא TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר הדגירה, לצלם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x להקליט שינויים מורפולוגיים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מצלחת אחת של שליטה או שטופל TAMתאים. שטוף תאים עם PBS הקר, ותאי קציר על ידי מבטל מחצית מהצלחת במאגר תמוגה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני בחיץ Ripa לניתוח חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר מהשליטה או המנות שטופלו על ידי TAM 1.6 x 10 6 תאי ציפוי מחדש בצלחת 10 סנטימטר בשני עותקים. רציפות טיפול בתאים עם 20 ננומטר TAM או רכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5 עד 7 פעם אחת בכל יום אחר עד היום 14, בו בזמן, תאי טוויסט-ER טופל TAM להראות מורפולוגיה mesenchymal דמוי כישור, ואילו תאי שליטת רכב שטופל לשמור על מורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת-. </li></ol> .2 אפיון EMT הערה: השלמת EMT הוא הצביע על ידי: (1) תא שינויים מורפולוגיים ממורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת למראה דמוי כישור כמו fibroblastic-; הפסד של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (2); ו (3) הביטוי עבר של סמני EMT, שהוגדר על ידי האובדןשל סמנים ורווח של סמני mesenchymal אפיתל. שינויים מורפולוגיים תא נתפסו על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x במהלך האינדוקציה EMT הזמן, שתוארו בסעיף 1 זיהוי חיסוני הקרינה של E-cadherin בתא צמתים מתואר בסעיף זה. הביטוי של סמני EMT הוא זוהה על ידי immunoblotting. סמני אפיתל נפוצים הם E-cadherin, γ-catenin, וoccludin, וסמני mesenchymal כוללים פיברונקטין, N-cadherin וvimentin. נהלים כלליים של immunoblotting מתוארים בסעיף 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 12 טיפול TAM, זרע 1 x 10 5 תאים על coverslip מעגלי מ&quot;מ זכוכית 12 להציב גם צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר זריעת תאים, בינוניים לשאוב ולשטוף עם PBS המחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% מחוממים מראש במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם 0.2% טריטון X-100 בPBS ל15דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בBSA / PBS 5% עבור שעה 1 ב RT לחסום הלא ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם E-cadherin הנוגדן הראשוני ב01:50 דילול של 1% BSA / PBS בO תא humidified / N ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 01:50 ו1: 200, והדילול האופטימלי עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את הנוגדן הראשוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדנים משני שכותרתו ניאון בדילול 1: 500 עבור שעה 1 ב RT. משלב זה על, להגן על התאים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג נוגדנים משני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם 0.1-1 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​DAPI או Hoechst עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעמים עם PBS שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips עם ירידה של מדיום הרכבה, וcoverslips חותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב תאים ולקחתתמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 63X. </li></ol> צביעה עם נוגדנים נוספים ניתן לבצע על מנת לאשר את הפנוטיפ EMT. לדוגמא, N-cadherin ויקטינו שריר α-חלק יכולים להיות מוכתם ל29,31,32 פנוטיפ mesenchymal. ארגון מחדש של מבנה cytoskeletal יכול להיות במעקב על ידי צביעת תאים עם phalloidin לF-אקטין 11. בנוסף, ניתן לבצע מבחני לתנועתיות תא והתנגדות תא מוות לבחון את המאפיינים של 11 EMT. .3 איתור של isoforms Splice שימוש מבחני qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פריימר הערה: זוגות פריימר צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת להגביר isoforms אחוי ברור. אקסון דילוג, אירוע שחבור החלופי הנפוצה ביותר שנצפה, מוצג כאן כדוגמא כדי להמחיש את האסטרטגיה של עיצוב פריימר. איור 1 א מציג מראש mRNA ארבעה אקסון, עם אקסון השלישי כאקסון משתנה. הכללת אקסון 3 תוצאות בהייצור של איזופורם אחוי יותר, ואילו דילוג של אקסון 3 יוצר איזופורם אחוי קצר יותר. Primers צריך להיות מתוכנן להבחין איזופורם כלול אקסון-3-ואיזופורם אקסון-3-לדלג עליו, וכדי לזהות את התמליל הכולל של mRNA זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של הכללת אקסון, לעצב בקפידה פריימר קדימה בתוך אקסון משתנה 3, ופריימר הפוכה בתוך אקסון המכונן הסמוך 4, המאפשר להגברה הספציפית של איזופורם-כלול אקסון משתנה. הקפד לא לתכנן שני קדימה לאחור פריימרים בתוך אותו אקסון משתנה על מנת להימנע ממוצרי PCR מוגברים מהדנ&quot;א הגנומי או הרנ&quot;א ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג אקסון, עיצוב אחד של פריימרים פורש הצומת של אקסון המכונן 2 ואקסון 4 שאחרת היה נהרס כאשר אקסון משתנה 3 כלול. עיצוב פריימר האחר בתוך אקסון המכונן .4 ככזה, מוצרי PCR נוצרים רק כאשר אקסון משתנה 3 הוא excludעורך ומכונן אקסון 2 ואקסון 4 לאחר מכן חברו יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את התמלילים הכולל של הגן, עיצוב פריימרים בתוך שני אקסונים מכוננים 1 ו -2 וכך, מוצרי PCR הם מוגברים מכל isoforms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו את טמפרטורת ההתכה (TM) עבור כל פריימרים הוא כ 55 ° C, לאורכו של כל צבע יסוד הוא כ 18-22 נוקלאוטידים, ואת הגודל של מוצרי PCR הוא בין 80 ו150 זוגות בסיסים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוי RNA: חלץ RNA באמצעות כוללת ערכת בידוד RNA (ראה טבלה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב350 מאגר תמוגה RNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350 μl של 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לעמודת טיהור RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 10,000 דקות 1 וזרימה דרך קלפים שנזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μl שלי לשטוף חיץ RNA ופעמים עם חיץ לשטוף RNA II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ לשטוף RNA שיוריתהשני מהטור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הטור לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש, להוסיף מים nuclease ללא 50 μl במרכז מטריצת העמודה וelute RNA על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של cDNA הראשון הגדיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז ואיכות של RNA על ידי מדידת ספיגת UV. הערה: RNA באיכות טובה צריכה יחס הספיגה / 280 ננומטר 260 ננומטר של כ 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובות טרנסקריפטאז (RT) המכילות 250 RNA ng סך הכל, 0.05 מיקרוגרם פריימרים hexamer האקראי, 50 pmol MgCl 2, 10 dNTP pmol, 2 μl 5 × חיץ GoScript, ואנזים RT μl 1 בנפח סופי של μl 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות RT ב42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ואחריו דגירה ב70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את אנזים RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה 20 תגובות μl שמורכבות מתערובת הורים הירוקים SYBR 10 μl,.1-1.0 תבנית μl cDNA, וpmol 5 קדימה הפוך פריימרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל בזמן אמת PCR עם 40 מחזורים מהשלבים הבאים: 95 מעלות צלזיוס denaturation עבור 10 שניות, 58 ° C חישול עבור 10 שניות, ו60 ° C הארכה ל30 שניות. לבצע PCR תגובות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו עקומות דיסוציאציה ולוודא ששיא יחיד הוא ציין עבור כל קבוצת פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ערכי מחזור כימות (CQ) על ידי חישוב הערכים נגזרים השני של עקומות הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות היחסית (RQ) של mRNAs היעד בדגימות מושרה בהשוואה למדגם uninduced באמצעות &quot;דלתא הדלתא Cq (ΔΔCq) &#39;שיטה כפי שמוצג על ידי הנוסחא הבאה. השתמש בגני משק בית, כגון GAPDH או TBP, כנקודת התייחסות. </li></ol></li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" /> כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את הערכים יחסי של isoforms אחוי, tהוא משתמש בגני התייחסות מרובים, צריך להיחשב. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות שיטת כימות ערך המוחלט שונה שתוארה על ידי אל Pfaffl et 33,34. .4 בחינת isoforms אחוי ברמת החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב100 חיץ Ripa קר כקרח μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר lysates על קרח למשך כ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 14,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז חלבון על ידי מבחני ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות חלבון בחיץ טעינת SDS ולטעון 20-40 מיקרוגרם של חלבונים לתוך ג&#39;לי SDS-PAGE 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;לי SDS-PAGE ב20 mA ל1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב85 V. התאם את זמן העברה על פי המשקל המולקולרי של חלבוני יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק ב5% חלב דל שומן ל30 דקות ל1 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה wi קרוםth נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 1: 200 ו1: 5,000, לקבוע את הדילול האופטימלי עבור כל נוגדן באופן ניסיוני. ניתן למצוא הדילול של נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה ב&quot; טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים &quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות isoforms אחוי, להשתמש בנוגדנים ספציפיים שיכירו איזופורם מסוים. לחלופין, להשתמש בנוגדן שמכיר אפיטופ באזור אקסון המכונן הקידוד ולזהות isoforms אחוי בו זמנית המבוסס על גדלי החלבון השונים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בה בעת, לפקח EMT ידי immunoblotting לסמני EMT. השימוש E-cadherin, γ-catenin, וoccludin כסמני אפיתל, ופיברונקטין, N-cadherin וvimentin כסמני mesenchymal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T (50 מ&quot;מ טריס, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) במרווח של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נמלה משנית HRP-מצומדותibody בדילול 1: 10,000 לשעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T במרווח 5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין חלבון עם מערכת איתור chemiluminescence ולחשוף את הקרום לסרט autoradiography. </li></ol>

<ol>
	<li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions.">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+master+regulator+of+morphogenesis,+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis.">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li><li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion.">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li><li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions:+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors.">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li><li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells.">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li><li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype.">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218 (2011).</li><li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition.">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li><li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression.">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+RNA+splicing+and+cancer.">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li><li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene.">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li><li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway.">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li><li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+Qa/Tla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse.">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li><li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome.">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li><li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing.">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li><li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+missense+and+5'-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17.">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li><li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene,+without+influencing+KTS+splice+isoforms,+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome.">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li><li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy.">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li><li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy.">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li><li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia.">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation.">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li><li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes.">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li><li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts.">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li><li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia.">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li><li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells.">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li><li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition.">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li><li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation.">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li><li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions.">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).</li><li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data.">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19 (2007).</li><li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons.">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li><li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation.">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li><li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein.">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li><li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development.">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li><li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis.">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li><li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis.">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li><li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications.">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li><li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements.">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li><li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion.">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים הקשורים לבלתי יכול להשפיע יתר על המידה שחבור חלופי. עם זאת, האינדוקציה המוצלחת של EMT חייבת להיות מאושרת בזהירות באמצעות ניתן להסיק סמני EMT שונים לפני כל מסקנות על שינויים בשחבור חלופי. יתר על כן, בנוסף למערכת EMT טוויסט-ER-מושרה המתוארת כאן, מערכות EMT אחרות כגון אלה הנגרמים על ידי החילזון-ER או TGFβ מומלצות לאימות של ממצאים ניסיוניים 11,30. המיתוג של isoforms אחוי במהלך EMT ניתן לאתרם בשתי רמות RNA והחלבון. iso Spliceנוגדני צורה ספציפית עדיפים לניתוח חלבונים. כאשר נוגדני איזופורם הספציפי אינם זמינים, רמות החלבון של isoforms אחוי יכולות להיקבע על בסיס המשקל המולקולרי שלהם על SDS-PAGE ידי immunoblotting. רמת RNA של כל איזופורם ניתן לכמת על ידי פריימרים איזופורם ספציפי. שימוש במבחני qRT-PCR, שינוי הקיפול של כל איזופורם יכול להיות ברגישות ובדייקנות שנקבע. בפרט, כאשר חומרים ניסיוניים מוגבלים, כגון ניתוח הביטוי של איזופורם אחוי מסוים בדגימות קליניות, ניתוח qRT-PCR מספק מדד כמותי שיפצה על חוסר נוגדני איזופורם הספציפי לאימונוהיסטוכימיה. השיטה שהוזכר כאן היא מתאימה לזיהוי של שינויים ידועים איזופורם אחוי במהלך EMT. בנוסף, בשיטה זו ניתן להרחיב למחקר של שחבור חלופי הגנום וזיהוי של מיתוג איזופורם אחוי רומן במהלך EMT. כדי להשיג זאת,שימוש בטכניקה בקנה מידה גדולה, כגון עמוק רצף RNA או פלטפורמות microarray רגיש שחבור, יכול להתבצע באמצעות RNAs מבודד ממודל EMT מושרה שתואר לעיל. אף על פי כן, אימות qRT-PCR של שינויי איזופורם נדרש לאחר כל ניתוח בקנה מידה גדולה. לסיכום, שחבור חלופי מוסדר באופן דינמי במהלך EMT, תהליך זה הוא קריטי להתפתחות עוברית וגרורות סרטניים. בהתחשב בתדירות הגבוהה של שחבור חלופי בגנום האנושי, סביר להניח כי הרגולציה של שחבור חלופי ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים ופתולוגיים אחרים, כוללים התמיינות תאים, התפתחות רקמות, ותאים מתוכנתים מוות 35-41. הפרוטוקול המתואר במסמך זה לצורך זיהוי של isoforms אחוי יהיה ישים למערכות אחרות אלה, כמו גם. שיטות ניסיוניות נוספות, כגון מבחני minigene כתב שחבור, יכול בדואר לשמש כדי לחקור עוד יותר את מנגנוני הוויסות של אלמנטים הפועל cis וגורמים הפועלים טרנס השולטים שחבור חלופי 30,42,43. יתר על כן, התפקיד הפונקציונלי של איזופורם אחוי בפרט במהלך EMT יכול להיחקר על ידי השתקה או ectopically להביע איזופורם והמעקב הספציפי האינדוקציה EMT במערכת EMT-מושרה תיארה 11.

מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11. שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT. כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 &amp;#956;M. Keep the solution at -20 &amp;#176;C protected from light.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>CD44 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>E-cadherin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Catenin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Occludin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000 dilution</td></tr><tr><td>N-cadherin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>GAPDH antibody</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blotting detection reagent</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Chemiluminescence system</td></tr></tbody></table>

detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

הנהלים שתוארו לעיל מספקים שיטה חזקה כדי לזהות שחבור חלופי במהלך EMT. תוצאות נציג של מיתוג איזופורם אחוי CD44 במהלך EMT-Induced טוויסט הן כדלקמן לדוגמא ירושלים. EMT-Induced טוויסט בתאי HMLE / טוויסט-ER התאפיין במעבר ממרצפות כמו פנוטיפ אפיתל לפנוטיפ fibroblastic מוארך (איור 2 א), העדר סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin וoccludin ו גברת ביטוי של פיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin (איור 2). יתר על כן, EMT הוערך על ידי האובדן של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (איור 2 ג). הביטוי עבר של isoforms אחוי CD44 במהלך EMT נבדק על ידי qRT-PCR וimmunoblotting. גן CD44 האנושי מורכב מתשעה אקסונים משתנים. שחבור חלופי של CD44 מאפשר לתאים לפרוגרסאות הדוצ&#39;ה CD44 (CD44v) הכוללות אקסון אחד לפחות משתנה, וCD44 סטנדרטי (CD44s) שהוא נטול כל אקסונים משתנים. איור 3 א מציג את האסטרטגיה של עיצוב פריימר לצורך זיהוי של isoforms אחוי CD44 השונים. לצורך זיהוי של CD44s מוצר אקסון-לדלג עליו, פריימר קדימה ממוקם באקסון המכונן 5, בעוד פריימר ההפוכה משתרעת על פני הצומת בין אקסונים המכוננים 5 ו -6 לזיהוי של isoforms אחוי CD44v המכיל משתנה v5 וv6 אקסונים, קדימה ופריימרים הפוכים נועדו בתוך v5 וv6, בהתאמה. צבעי יסוד לזיהוי של isoforms המכיל אקסון האחר CD44 משתנה יכול להיות מתוכנן תוך שימוש באותה האסטרטגיה. בנוסף, סך הכל תמליל CD44 הוא זוהה באמצעות קדימה לאחור פריימרים ממוקמים באקסון המכונן אקסון 2 ו -3, בהתאמה (איור 3 א). כפי שניתן לראות באיור 3 ב, qRT-PCR ניתוחי ניצול סטי פריימר אלה הצביע על ירידה משמעותית בCD44v mRNA ועלייה בCD44s mRNA לאחר 14 ימי טיפול TAM בתאי HMLE טוויסט-להביע ER. בניגוד לכך, לפרוטוקול הכולל של CD44 נותר ללא שינוי במהלך EMT (איור 3 ג). עולה בקנה אחד עם התוצאות של qRT-PCR, רמת החלבון של CD44v ירדה פלאים, בעוד שהביטוי של חלבון CD44s היה שהוגבר (איור 3D) באופן משמעותי. לכן, איזופורם העיקרי של CD44 הועבר מCD44v לCD44s במהלך תהליך EMT. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig1highres.jpg" width="600" /> עיצוב פריימר 1 איור. דיאגרמות סכמטי הממחישות את מיקומו של פריימרים לאיתור isoforms שחבור במודל הדילוג-אקסון. קופסות האפורות מייצגות אקסונים מכוננים, קופסות כתומות מייצגות אקסונים משתנים, והקווים הדקים חיבור תיבות לציין אינטרונים. מקומות פריימר הם indicatאד על ידי חיצים: חיצים שחורים מצביעים על סטי פריימר לגילוי mRNA סך הכל, חצים כתומים מצביעים על סטי פריימר להגברת isoforms-כלול אקסון, וחיצים כחולים מצביעים על סטי פריימר לאיתור isoforms דילוג-אקסון. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2 אינדוקציה של EMT. (א) בניגוד שלב תמונות (10X) הממחיש שינויים מורפולוגיים בתאי HMLE / טוויסט-ER לפני (ללא טיפול) ולאחר 14 ימי טיפול TAM. (ב) ניתוח immunoblot של סמני EMT בתאי HMLE / טוויסט-ER לפני (שלא טופל) ואחרי 14 ימי טיפול TAM. על טיפול TAM, סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin, וoccludin היו downregulated, ופיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin היו שהוגבר. (C) תמונות הקרינה חיסון (63X) המצביע על האובדן של E-cadherinלוקליזציה בצמתים תאי תאים לאחר 14 ימי טיפול TAM. כתמים ירוקים מציין E-cadherin, ומכתים DAPI (כחול) מצביע על גרעינים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig3highres.jpg" width="500" /> החלף איור 3 של isoforms אחוי CD44 במהלך EMT. עיצוב פריימר לצורך זיהוי של isoforms אחוי CD44 (). קופסות האפורות מייצגות אקסונים מכוננים, קופסות כתומות מייצגות אקסונים משתנים, והקווים הדקים חיבור תיבות לציין אינטרונים. מקומות פריימר מסומנים על ידי חצים: חיצים שחורים מצביעים על סטי פריימר לגילוי mRNA הכולל CD44, חצים כתומים מצביעים על סטי פריימר להגברת CD44v5-6, וחיצים כחולים מצביעים על סטי פריימר לגילוי CD44s. (B, C) ​​ניתוח qRT-PCR של הרמות של isoforms CD44 במהלך EMT באמצעות פריימרים המזהים באופן ספציפי CD44v מכיל v5 משתנה אקסונים וv6 (v5 / 6) וCD44s (B), וmRNA הכולל CD44 (C) . רמות ביטוי היחסית של mRNA ביום 14 תאים היו מנורמלים ליום מקביל 0 תאים בTAM טופלו וקבוצות שאינם מטופלים. ברים שגיאה מצביעים SEM; n = 3 ניתוח (D) immunoblot של isoforms CD44 במהלך EMT-Induced TAM בתאי HMLE / טוויסט-ER. רמות של E-cadherin וN-cadherin היו במעקב כדי לזהות מצב EMT.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition at JoVE.com

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Video: Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Cancer Research

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Developmental Biology

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides constitutive splicing, alternative mRNA splicing allows the expression of multifunctional proteins from one gene. As interactome studies are generally the first analysis for new or unknown proteins, the association of the bait protein with splicing factors is an indication that it can participate in mRNA splicing process, but to determine in what context or what genes are regulated is an empirical process. A good starting point to evaluate this function is using the classical minigene tool. Here we present the adenoviral E1A minigene usage for evaluating the alternative splicing changes after different cellular stress stimuli. We evaluated the splicing of E1A minigene in HEK293 stably overexpressing Nek4 protein after different stressing treatments. The protocol includes E1A minigene transfection, cell treatment, RNA extraction and cDNA synthesis, followed by PCR and gel analysis and quantification of the E1A spliced variants. The use of this simple and well-established method combined with specific treatments is a reliable starting point to shed light on cellular processes or what genes can be regulated by mRNA splicing.

This protocol presents a rapid and useful tool for evaluating the role of a protein with uncharacterized function in alternative splicing regulation after chemotherapeutic treatment.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Biochemistry

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

RNA Splicing

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called the primary transcript. The primary transcripts that become mRNAs are called precursor messenger RNAs (pre-mRNAs). Eukaryotic pre-mRNA contains alternating sequences of exons and introns. Exons are nucleotide sequences that code for proteins, whereas introns are the non-coding regions. In RNA splicing, introns are removed and exons are bonded together.
Splicing is Mediated by the Spliceosome
Splicing occurs in the nucleosome and is mediated by a complex of proteins and small RNAs called small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). snRNPs, together with other proteins, form the spliceosome, which recognizes specific nucleotide sequences at the ends of the exon and intron. First, it binds to a GU-containing sequence at the 5&#39; end of the intron and to a branch point sequence containing an A towards the 3&#39; end of the intron. In a number of carefully-orchestrated steps, other snRNPs then bring the branch point close to the 5&#39; splice site. Subsequently, a chemical reaction cleaves the 5&#39; end of the intron from its upstream exon and attaches it to the branch point, forming a loop called a lariat. To release the lariat, the AG-containing sequence of the intron near the 5&#39; end of the downstream exon reacts with the 3&#39; end of the upstream exon. This reaction patches the two exons together, concluding the splicing process.
Splicing Allows the Expression of Several Proteins from a Single Gene
Typically, exons are joined together in the order in which they appear in a gene. However, during alternative splicing, different combinations of exons in pre-mRNA are combined to form mature mRNA. This produces several different proteins from a single pre-mRNA transcript.
Different patterns of alternative splicing include exon skipping, alternative 5&#39; or 3&#39; splice sites, and intron retention. These patterns are guided by the length of exons or introns and the strength of the splicing signal at the splice sites. Because of this, exons that are shorter than other exons may be overlooked by the spliceosome and omitted from the mature mRNA. In contrast, introns that are significantly shorter than other introns may evade removal by the spliceosome and are retained in the mature mRNA. As a result, alternative splicing generates variants of mature mRNA that were copied from the same stretch of DNA. The RNA sequence variants produce different proteins with additional or fewer amino acids, shifts in the reading frame, or a premature stop codon. These protein isoforms have different biological properties, including function, cellular localization, and interaction with other proteins, thereby playing a vital role in tissue- and environment-specific gene expression.
Abnormal Splicing Can Cause Diseases
Errors in splicing can produce aberrant protein isoforms, which may contribute to diseases, including cancer. For instance, alternative splicing of the BCL2L1 gene generates a long and short protein isoform&#8212;BCL-XL and BCL-XS, respectively&#8212; through the use of alternative 5&#39; splice sites. The longer BCL-XL isoform promotes cell survival and is highly expressed in several types of cancers (e.g., blood, breast, and liver cancers). Expression of the short BCL-XS isoform that promotes cell death is suppressed in cancer.

RNA Splicing, Lariat and the Spliceososme

שחבור רנ״א

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called ...