Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

1. משלוח הידרודינמית של sRANKL MC-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלוח הידרודינמית דרך וריד זנב עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר לפני ההזרקה לוריד זנב. לדלל sRANKL או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) MC בפתרון של רינגר (טרום חם על 37 מעלות צלזיוס) בהיקף כולל של ~ 10% ממשקל גופו של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את העכבר בכלוב עבור 10 דקות לפני ההזרקה כדי מרחיב את כלי דם ולהפוך את הוורידים לרוחב (LVS) נראים לעין. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהם LVS מורחבים ונראה לעין, להעביר את העכבר לעוצר ולהכניס את התקע רחוק מספיק לתוך החבית לרסן את התנועה. לפקח על העכבר לפעילות רגילה כגון נשימה. התאם את התקע של עוצר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור ההזרקה 3/4 מקצה הזנב עם אלכוהול לנגב. שימוש במחט G 27-30 להזרקה לוריד זנב עכבר. החזק את הזנב בחוזקה ביד אחת ולהכניס את המחט בלוריד הזנב. להפעיל לחץ על המזרק ולהשלים את הזריקה בתוך 5-7 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט מוריד הזנב ולהפעיל לחץ עם כדור צמר גפן באתר ההזרקה כדי לעצור את הדימום. לפקח על העכבר ל15-30 דקות, ולאחר מכן להעביר את העכבר בחזרה לביבר פעם אחת את קצב הנשימה מצטמצם לשיעור הרגיל שלו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור על ביטוי sRANKL המערכתי מאוס והכימות של העברת עכבר סרום TRACP5b ההודעה ג&#39;ין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את העכבר בכלוב ל5-10 דק כדי מרחיב את כלי דם ולגרום LVS גלוי. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן עם להב לזנבו של העכבר באתר אחד אחורה מקצה הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כ 100 μl דם בצינורות הפרדה בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות הפרדת סרום בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות ולאסוף בסרום. Storסרום דואר ב-80 ° C לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע sRANKL ELISA וassay TRACP5b סרום עכבר על דגימות סרום באמצעות ערכה זמינה מסחרית. </li></ol></li></ol> 2. דור Osteoclast במבחנה מBMMs מאוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד וCulturing של BMMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של השוקה ועצמות ירך: להרדים את עכבר התורם עם CO 2, ולחטא את הרגליים עם 70% אתנול. לנתח מעצם הערווה עד עצם calcaneus, כדי להסיר את עצמות ירך ושוקה בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור ושרירים בזהירות מבלי לפגוע בעצמות. הנח עצם ירך ועצם שוקה מעובד בצלחת פטרי המכילה בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההסרה של מח עצם: חותכים את הקצה בצד אחד של עצמות הירך ושוקה ולשטוף את מח העצם לתוך צינור 50 מיליליטר באמצעות מזרק 1ml עם מחט 25 G, עמוס α-ממ המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Osteoclast התרבות בינונית / OCM). </li><li&gt; מח עצם תהליך: לערבב ולהעביר השעיה מח עצם לצינור מיליליטר 50 חדש על ידי העברתו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה התאים ב XG 300 מחדש להשעות בα-ממ המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו10% FBS (הבינוני Osteoclast תרבות / OCM (+)). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 x 10 6 תאים לכל גם לצלחת 6 היטב או 3 x 10 5 תאים לcoverslips זכוכית (5 מ&quot;מ) או פרוסות הדנטין להציב צלחת 96 היטב ולדגור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את כל אמצעי התקשורת המכילה תאים שאינם חסיד ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה עכבר 25 ng / ml M-CSF ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב את כל התקשורת ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה M-CSF עכבר 25 ng / ml, ו30 sRANKL עכבר ng / ml ליזום osteoclastogenesis. לחדש את התקשורת בכל 3 ימים, כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאיםכ 6-8 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק מסוגלים resorbing עצם. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, לבצע מלכודת (phosphatase חומצה עמיד tartrate) מכתים באמצעות ערכה זמינה מסחרית, וכאשר התבגרו באופן מלא, לבצע מבחני תפקודיים. דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin ותמונה מצורפים לתאים הדנטין פרוסות ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) כפי שתואר לעיל 19. </li></ol></li></ol> 3. דור Osteoclast במבחנה מPBMCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של PBMCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של Histopaque-1077 מראש חימם לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן ויקוציטים ריק המתקבל מבנק דם עם PBS סטרילי לתוך צינור 50 מיליליטר (1:1 יחס של דם עם PBS). שכבת הדם המדולל על פתרון Histopaque לאט מאוד, ולוודא כי הדם לא לערבב עם Histopaque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות XG 1000 עבור 20 דקות ב18 ° C. לעקובing צנטריפוגה, לבודד בזהירות את שכבת מעיל באפי הלבנה המכילה את תאי דם הלבנים ולהעביר לצינור מיליליטר 50 חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב650 XG במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ותאי resuspend ב OCM (-) תקשורת ולספור תאים באמצעות דלפק תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי וCulturing PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת resuspend תאי OCM (+) וצלחת 8 x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת או 1 6 גם x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת 96 היטב. פלייט תאים על coverslips זכוכית (5 מ&quot;מ), כנדרש להדמית immunofluorescence כמו גם על פרוסות עצם מתאימות עבור מבחני ספיגת עצם כפי שתוארו לעיל 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה שינוי תרבות, חידוש התאים עם M-CSF האנושי כל 2-3 ימים או כפי שנדרש. לאחר מכן להמשיך לשלב בידול ביום 5 על ידי הוספת 30 / מיליליטר ng של sRANKL האנושי יחד עם 25 M-CSF ng / ml אדם בOCM (+) תקשורת ליזום osteoclastogenesהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים לכ 14-21 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, אז יכולים להיות שכותרתו תאים אלה למלכודת, וכשהתבגרו באופן מלא, ניתן לבצע מבחני תפקודיים. ניתן דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin. המורפולוגיה של התאים ניתן לבדוק בתאים מצורפים הדנטין פרוסות ידי SEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תנאי השלד והשרירים מובילים גורמים לתחלואה ונכות ומורכבים של מעל 150 מחלות ותסמונות; המשפיע על כ -90 מיליון אמריקאים היום. דלקת מפרקים והרס עצם הם תכונות העיקריות של תנאים שרירי שלד, הכוללים דלקת מפרקים ואוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס היא מחלה שמחלישה את שלמות עצם, לעתים קרובות מוביל לשברים בעצמות. דלקת פרקים הוא מחלה כרונית, מתישה מחלה המאופיינת בדלקת המפרקים שהפכו נפוח, רך ותנועה נורמלית הגבלה-נוקשה ויכולים לגרום לנכות. למרות פתוגנזה של מחלות שרירים ושלד שונה מאוד אחד מהשני, הרס עצם הוא התכונה משותפת העל. הרס עצם בתנאי השלד והשרירים נגרמת בעיקר על ידי חוסר איזון בין ספיגת עצם ויצירת עצם 21,22. גישה טיפולית אחת היא לנסות ולחסום את היכולת של תאים אלה להרוס את העצם <sעד&gt; 23. הטכניקות ונהלים המפורטים כאן יאפשרו המחקר של osteoclasts גם in vivo ו במבחנה. מודל vivo במתואר כאן משתמש minicircles, שהם וקטורים קטנים episomal ה-DNA (~ 4KB) משוחררים מעמוד השדרה בקטריאלי, המשרתים גם כנשאי transgene 24. Minicircles להביע transgenes 10-1,000 קיפול גבוה אז פלסמידים חיידקים נורמלים עם ביטוי יציב לתקופה של עד מספר חודשים. הגודל המולקולרי הקטן יותר של minicircles תורם לשיעור יעיל יותר transfection וביטוי משמעותי בהשוואה לפלסמידים חיידקים נורמלים 24. לכן, minicircles כעת מיושם באופן נרחב במחקרי העברת גנים טרום קליני 25,26. משלוח הידרודינמית הוא שיטה מפותחת המבוססת על לחץ הידרודינמית בנימים כדי לספק DNA פלסמיד לכל הגוף של עכבר. מסירת גן הידרודינמית לhepatocytes באמצעות הזרקה לוריד זנב בעכברים היא לא מבוסס היטבo להביע transgene ידי פלסמיד דנ&quot;א 6. במחקרים אלה, ביתר עכבר sRANKL בin vivo במודל העכבר מושגת על ידי sRANKL MC ומשלוח הידרודינמית באמצעות זריקות וריד זנב. עכבר sRANKL ELISA יכול לשמש כדי לזהות רמות בסרום של RANKL בעכברים. העלאה משמעותית של TRACP5b עכבר סרום, סמן ספיגת עצם 27, הוא ציין בעכברי העברת גני sRANKL. יש לציין, טכניקה זו אינה מוגבלת לביטוי יתר של sRANKL; זה יכול להיות מיושם גם בהמשך לביטוי יתר חלבונים מופרשים אחרים 28. הקושי הטכני העיקרי בהליך זה הוא המשלוח הידרודינמית דרך וריד הזנב. מלבד הזרקה לוריד זנב רגיל, משלוח הידרודינמית דורש מסירה של minicircles בכמויות גדולות של תמיסה פיזיולוגית לעכברים בתוך 5-7 שניות. לפיכך, טכניקות טיפול והזרקה יציבה הן תנאי הכרחיות להצלחה בהליך זה. יצירת עכברים הטרנסגניים sRANKL היא גישה אחרת לosteoc in vivolastogenesis. עם זאת, רמה גבוהה של sRANKL יכולה להוביל להקטלניות עוברי 4 ויצירת עכברים הטרנסגניים היא גם יקרה וגם גוזל זמן. במודל מכרסם OVX, שני ציטוקינים דלקתיים כגון TNF, IL-1 ו-IL-6 וsRANKL ציטוקינים דלקתי שאינו תורמים לin vivo osteoclastogenesis ואיבוד מסת עצם. מודל העברת גני sRANKL מוביל לביטוי יתר של רק sRANKL ציטוקינים שאינם דלקתי. לכן, מודל העברת גני sRANKL שתואר כאן מציע חוקרים כלי רב עוצמה כדי לבחון את תרומתו של ציר RANKL-RANK בשיפוץ עצם בהעדר הדלקת. שיטת תרבות osteoclast במבחנה, הכוללת תאי מח עצם שיתוף culturing וosteoblasts, הוקמה בסוף 1980s לפני הגילוי של RANKL בסוף 1990 של 29,30. רקומביננטי M-CSF וRANKL להשפיע על התמיינות osteoclast ביעילות במבחנהnd השיטה שתוארה בעבר במחקרים אחרים 3,31. M-CSF ידוע כדי לעורר ביטוי RANK במבשרי osteoclast המוקדמים 32 ולפעול כגורם הישרדות של מבשרי osteoclast וosteoclasts הבוגר 33. RANKL חיוני לבידול osteoclast והפעלת 3. הנה, את השיטה של osteoclastogenesis במבחנה מתוארת. culturing המוצלח והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts דורשים בידוד סטרילי תא וטכניקות ציפוי נכון, כמו גם הבנה מדוקדקת של קציר תא מתוזמן. ציפוי מחושב של התאים הוא חיוני משום שבידול osteoclast דורש היתוך של תאים מבשר osteoclast 34 ומספר מספק של תאים מבשר osteoclast לא יאפשר היתוך והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts. באופן דומה, מספר עודף של תאים מבשר osteoclast, מוביל להיווצרות גוש ומוות של תאי סופו של דבר. להסרת של איחסיד תאים 2 שעות לאחר ציפוי התאים יכולות לעזור לשמור על מספר סלולרי אופטימלי. לבסוף, זמן קציר תא הוא חיוני כosteoclasts הם סופני תאים קצרים ימים הבדיל עם תוחלת חיים של כ 48 שעות 35. לכן, צריכים להיות שנקטפו תאים בתוך 48 שעות לאחר התצפית הראשונה של תאי multinucleated. אז יכולים להיות מאופיינים בתאים אלה על ידי מלכודת וצביעת F-אקטין על ידי אימונוהיסטוכימיה ועצם פעילות ספיגה יכולה להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM). גישות ניסיוניות אלה מאפשרות הגדרה ברורה של osteoclasts במונחים של הפנוטיפ והתפקוד שלהם. In vivo ו במבחנת הטכניקות המתוארות כאן יקל על הפיתוח של מעכבי osteoclast כיום במחקרים טרום קליניים, שהוביל לאסטרטגיות טיפוליות יעילות עבור מיליוני אוסטיאופורוזיס וחולי דלקת מפרקים ברחבי העולם.

מחלות השלד והשרירים משפיעות על מיליוני אנשים בארצות הברית וההשלכות חמורות בהווה למערכות בריאות מקומיות וארציות 1. הפרעות אלו מתאפיינות באובדן העצם ותפקוד מפרקים הדורשים טיפול מקיף ותקופות של התאוששות ארוכות. בדרך כלל, גידול יחסי במספר ו / או הפעילות של osteoclasts, תאים מתמחים לנספגים שוב עצם, באוסטיאופורוזיס ובדלקת מפרקים שהוא ציין 2. בתנאים פיסיולוגיים במספר ובפעילות של osteoclasts מוסדר על ידי מפעיל הקולטן של הגורם הגרעיני κ-B ליגנד (RANKL), אשר מופק על ידי אוסטאובלסטים. Osteoprotegerin (OPG), קולטן דמה לRANKL מיוצר גם על ידי osteoblasts 3 בvivo מודלים של בעלי חיים הכרוכים בביטוי יתר מערכתי של sRANKL, או מחיקה של OPG יקרים מאוד במחקר באוסטאופורוזיס.; עם זאת, שיטות אלו דורשות הדור של עכברים הטרנסגניים 4,5. כאן, אלטרנטיבה רומןשיטה של ​​overexpressing sRANKL לחקר הפרעות הקשורות לשרירים ושלד מתואר. באופן ספציפי, minicircle (MC) טכנולוגיית ה-DNA ושיטות משלוח הידרודינמית שימשו כדי להשיג העברת גנים של sRANKL in vivo ו overexpress עכבר sRANKL מערכתי 6. שיטה זו היא גם משלימה in vivo מודלים אחרים לאוסטאופורוזיס, כגון אפנון הורמונלי של osteoclasts הבא ovariectomy 7 והתערבות תזונתית על ידי דיאטה דל בסידן 8. מודלים אלה הם מאוד שימושיים כדי ללמוד היבטים שונים של הפרעות הקשורות לשלד ושרירים עם זאת הם דורשים ניתוחים ועשויים להימשך עד מספר חודשים, במחיר משמעותי 9. מודל מכרסם ovariectomized (OVX) הוא מודל חיה ניסיוני שבו הסרת השחלות גורמת למחסור באסטרוגן ובכך מחקה אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אדם 10. אוסטיאופורוזיס בגיל הבלות אדם, מצב שבו defici אסטרוגןency מוביל לסיכון מוגבר לשברים בעצמות ובריחת סידן משפיעה על כשמונה מיליון נשים בארצות הברית לבדה. למרות שמודל OVX שימושי לאוסטיאופורוזיס בגיל הבלות הוא מציע יתרונות מוגבלים בלימוד אוסטאופורוזיס באופן כללי. אסטרוגן מדכא את איבוד מסת עצם, על ידי גרימת osteoclast ועיכוב אפופטוזיס osteoblast, ולכן בהעדרה פעילות osteoclast המוגבר הוא ציין 10-12. חוסר איזון יחס RANKL-OPG שמעדיף ספיגת עצם הוא ציין גם 13. עם זאת, מחסור באסטרוגן in vivo מלווה גם בירידה ברמות של הפיכת β גורם גדילה (β TGF), גדל אינטרלויקין 7 (IL-7) וTNF, IL-1 ו-IL-6 14,15. כציטוקינים אלה ידועים פונקציות ויסות שיפוץ עצם בלתי תלויות במסלול RANKL, אי אפשר לייחס כל הפעלת osteoclast אך ורק על ציר RANKL-RANK. המודל המתואר במאמר זה מאפשר לחוקרים ללמוד ביוo ציר RANKL-RANK בosteoclastogenesis ואובדן עצם ללא הפרו ציטוקינים דלקתיים בהשוואה למודלים של מכרסמים OVX. בנוסף, טכניקות osteoclastogenesis במבחנה הן כלים חיוניים ללמוד הפעלת osteoclast לטיפולי פוטנציאל טיפוליים של מחלות השלד והשרירים. גם מחקרים קודמים הראו כי culturing מקרופאגים מח עצם עכבר נגזרים (BMMs) עם גורם מקרופאג העכבר מגרה מושבה (M-CSF) והעכבר sRANKL יכול להוביל לבידול osteoclast 3,16,17. הנה, את הפרוטוקולים כדי לייצר תאים כמו osteoclast-multinucleated ממח העצם של עכבר, כמו גם מהתאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) במבחנה 18 מתוארים. מבחני מבוססי התאים נדרשים להגדיר osteoclast הבדיל סופני ומתפקד באופן מלא בשלה גם מתוארים בקצרה. במבחנה טכניקות אלה משלימים את הרומן בגישת vivo ויחד לשמש pכלי החקירה owerful ללמוד בידול osteoclast והפעלה. שימוש במערכות אלה, מדענים מסוגלים לייצר osteoclasts in vivo ו במבחנה ולהגדיר את הגירויים ואותות הנדרשים להפצה וההפעלה שלהם, כמו גם לבחון את היעילות של מעכבים תרופתיים וביולוגיים.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&amp;nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

כאן, בטכניקת העברת גנים חדשים לבידול של osteoclasts in vivo ופרוטוקולי תרבית תאים להפרדת תאים מבשר לosteoclasts במבחנה, כמו שיטה כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על osteoclastogenesis מתוארות. באיור 1, תוצאות הנציג של העברת גנים המוצלחת של ה-GFP ועכבר sRANKL MC בעכברים מוצגות. באיור 2, התמונות מייצגות של מח עצם עכבר או תרבויות אנושיות PBMC התמיינות תאים כמובן זמן של תאים מבשר לosteoclasts על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר מוצגות. איור 3, תמונות מייצגות משלוש שיטות עצמאיות לאפיון osteoclasts מקורם במח עצם עכבר מוצגות . נוכחותו של עכבר sRANKL מפעילה את הביטוי של מלכודת (3A דמויות ו-B) והיווצרות של טבעות ה-F-אקטין (3C דמויות ו-D). elec סריקהמיקרוסקופיה טרון (SEM) מגלה כי העכבר sRANKL גורם להיווצרות של תאים ענק מסוגלים resorbing עצם (3E דמויות ו-F). איור 4, באותן שיטות האפיון על PBMC אדם נגזרות osteoclasts מוצג. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. SRANKL in vivo גן ההעברה מובילה לosteoclastogenesis המוגבר. תצוגה קדמית של A, B) explants כבד העכבר וC, D) תמונות של כל גוף של C57BL / 6 עכברי זכרים 12 שבועות ישנים הוזרקו 5 מיקרוגרם של ה-GFP או sRANKL MC-DNA. החץ מצביע על הביטוי של GFP in vivo בעכבר העברת גני ה-GFP. עכברי העברת גני RANKL לשמש אין הקרינה רקע. תמונות שנתפסו על ידי המאסטרו 2 Imager, יום אחד לאחר גן ההעברה (ד האדום והירוקרקע enote וה-GFP, בהתאמה). מפת E) פלסמיד של מבנה sRANKL MC-DNA ורמת F) sRANKL בסרום נותח בבית 1, 5 ו -11 ימי הודעת GFP או רמת TRACP5b סרום העברת גני sRANKL. G) מאוס ניתחה 11 ימים לאחר העברת גן GFP או sRANKL. ברים סולם מצביעים על 5 מ&quot;מ, B ו 10 מ&quot;מ ב-C, ד &#39; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig2highres.jpg" width="500" /> osteoclastogenesis איור 2. במבחנה בשני מערכות תרבית תאים אנושיות בעכבר ו. מיקרוסקופ שדה בהיר של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית בנוכחות 25 ng / ml עכבר M-CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml מראה בידול כמובן זמן בימים), 2 ב &#39;) 5, ו-C) 8. מיקרוסקופ שדה הבהיר של תאים אנושיים מבודדיםמהדם ותרבית בנוכחות של 25 ng / ml M-CSF האדם ו30 sRANKL ng / ml האדם מראה כמובן זמן התמיינות בD ימים), 4 E) 14, ו-F) 21 היקפיים. ברים סולם מצביעים 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. דור ואפיון של osteoclasts עכבר. מכתים TRAP (ורוד) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 6 ימים בנוכחות) 25 עכבר ng / ml M-CSF או B) עכבר 25 ng / ml M -CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (הכחול) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות C) ng 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר עכבר או D) / מיליליטר עכבר sRANKL מראה את היווצרות פאטבעת ctin בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות ה &#39;) 25 ng / M-CSF עכבר מיליליטר או F) sRANKL 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 עכבר ng / ml מראה את היווצרות אזורי ספיגה בעצמות כפי שמצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 40 מיקרומטר בספירה, ו30 מיקרומטר בE, F. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. דור ואפיון של osteoclasts האנושי. מכתים TRAP (ורוד) של תאים אנושיים מבודדים מPBMCs ותרבותית ל15 ימים בנוכחות) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר או B) 25 ng / ml אדם M- CSF ו30 sRANKL אדם ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (כחולה) של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל19 ימים בנוכחות C) </strong&gt; 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר או D) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 ng / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של טבעות ה-F-אקטין בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל18 ימים בנוכחות ה &#39;) ng 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר אדם או F) / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של ספיגה אזורים על עצם כפי שצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 10 מיקרומטר בA, B, 20 מיקרומטר ב-C, 15 D מיקרומטר בE, F.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders at JoVE.com

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K Views.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

Video: A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Developmental Biology

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

מודלים של גרורות עצם

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

בשילוב<em&gt; בvivo</em&gt; אופטי וμCT הדמיה למעקב אחר זיהום, דלקת, ועצם אנטומיה בזיהום אורטופדיים שתל בעכברים

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Bioengineering

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Immunology and Infection

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח מולטימודאלי של היווצרות עצם באמצעות מודלים explant

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous modalities that are currently available for analysis. Here, we propose a workflow for a comprehensive evaluation of new bone formation using a relevant large animal osseous ex vivo explant. A bone defect (diameter = 3.75 mm; depth = 5.0 mm) is created in an explanted sheep femoral head and injected with a macroporous bone substitute loaded with a pro-osteogenic growth factor (bone morphogenetic protein 2 - BMP2). Subsequently, the explant is maintained in culture for a 28-day period, allowing cellular colonization and subsequent bone formation. To evaluate the quality and structure of newly mineralized tissue, the following successive methods are set up: (i) Characterization and high-resolution 3D images of the entire explant using micro-CT, followed by deep learning image analyses to enhance the discrimination of mineralized tissues; (ii) Nano-indentation to determine the mechanical properties of the newly formed tissue; (iii) Histological examinations, such as Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner's trichrome, and Movat's pentachrome to provide a qualitative assessment of mineralized tissue, particularly with regard to the visualization of the osteoid barrier and the presence of bone cells; (iv) Back-scattering scanning electron microscopy (SEM) mapping with internal reference to quantify the degree of mineralization and provide detailed insights into surface morphology, mineral composition, and bone-biomaterial interface; (v) Raman spectroscopy to characterize the molecular composition of the mineralized matrix and to provide insights into the persistence of BMP2 within the cement through the detection of peptide bonds. This multimodal analysis will provide an effective assessment of newly formed bone and comprehensive qualitative and quantitative insights into mineralized tissues. Through the standardization of these protocols, we aim to facilitate interstudy comparisons and improve the validity and reliability of research findings.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: טכניקות מתקדמות לאפיון מינרליזציה של רקמות במחקר התחדשות עצם

The proposed protocol entails a global approach to assess bone formation in the context of bone regeneration using multimodal analyses. It aims to provide qualitative and quantitative information on new bone formation, enhancing the rigor and validity of basic and pre-clinical investigations.

רומן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ותרופות טיפול

מודלים של גרורות עצם

עוקב

בשילוב

יישומים של

חלון ירך דגם קאמרי

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

אפיון מקיף של מינרליזציה של רקמות במודל Ex Vivo

אפיון מקיף של מינרליזציה של רקמות במודל Ex Vivo

אפיון מקיף של מינרליזציה של רקמות במודל Ex Vivo