Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

1. Hydrodynamische Lieferung der sRANKL MC DNA <ol><li> Hydrodynamische Lieferung über Mausschwanzvene <ol><li> Wiegen Sie die Maus vor der Schwanzveneninjektion. Verdünnen sRANKL oder grün fluoreszierende Protein (GFP) MC in Ringer-Lösung (pre-warmen bei 37 ° C) in einem Gesamtvolumen von ca. 10% der Mauskörpergewicht. </li><li> Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 10 Minuten vor der Injektion, um die Blutgefäße erweitern und machen seitlichen Venen (LVs) sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Sobald die LVs sind erweitert und sichtbar, übertragen Sie die Maus auf den Restrainer und den Stecker weit genug in den Lauf, um die Bewegung zurückzuhalten. Überwachen Sie die Maus für die normale Aktivität wie Atmung. Stellen Sie den Stecker des Restrainer, wenn nötig. </li><li> Desinfizieren Sie die Injektionsbereich 3/4 von der Spitze des Schwanzes mit einem Alkoholtupfer. Verwenden Sie eine 27 bis 30 G-Nadel für die Mausschwanzveneninjektion. Halten Sie den Schwanz mit einer Hand fest und legen Sie die Nadel inin die Schwanzvene. Üben Sie Druck auf die Spritze und füllen Sie die Injektion innerhalb von 5-7 Sekunden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Schwanzvene und Druck mit einem Wattebausch auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Überwachen Sie die Maus für 15-30 min, übertragen Sie dann die Maus wieder auf, sobald das Vivarium Atemfrequenz wird auf seiner normalen Geschwindigkeit reduziert. </li></ol></li><li> Bestätigung der Maus Systemische sRANKL Expression und Quantifizierung der Maus Serum TRACP5b Beitrag Gentransfer <ol><li> Wärmen Sie die Maus in einem Käfig für 5-10 min, um die Blutgefäße erweitern und machen LVs sichtbar. Überwachen Sie die Maus sorgfältig zu Dehydrierung und Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt mit einem Messer an der Maus den Schwanz an einem Ort, ein Viertel von der Spitze des Schwanzes. </li><li> Sammeln Sie etwa 100 ul Blut im Serum Trennung Röhren. </li><li> Serumtrennröhrchen bei Raumtemperatur inkubiert für 30 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 xg für 5 min und sammeln Serum. Store Serum -80 ° C zur weiteren Analyse. </li><li> Führen sRANKL ELISA und Mausserum TRACP5b Assay auf Serum-Proben unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits. </li></ol></li></ol> 2. Osteoklasten in vitro Generierung von Maus BMM <ol><li> Isolierung und Kultivierung von BMM <ol><li> Die Isolierung des Schien-und Oberschenkelknochen: Euthanize den Spender-Maus mit CO 2, und desinfizieren Sie die Beine mit 70% Ethanol. Präparieren Sie vom Schambein zu dem Fersenbein, um die Oberschenkel und Schienbein Knochen entfernen intakt. </li><li> Entfernen Sie die Haut-und Muskel sorgfältig, ohne die Knochen. Platzieren verarbeitet Femur und Tibia Knochen in eine Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Entfernung von Knochenmark: Schneiden Sie die Spitze auf der einen Seite der Oberschenkel und Schienbein Knochen und spülen, die Knochenmark in einen 50-ml-Tube mit einer 1 ml-Spritze mit einer 25 G-Nadel, mit α-MEM mit 1% Penicillin / Streptomycin belastet (Osteoklasten Kultur Medium / OCM). </li><li&gt; Prozessknochenmark: Mix und übertragen Knochenmark-Suspension auf einen neuen 50-ml-Tube, indem es durch einen 70 um Nylon Zellsieb. Zentrifugation der Zellen bei 300 × g und resuspendieren in α-MEM, das 1% Penicillin / Streptomycin und 10% FBS (Osteoklasten-Kulturmedium / OCM (+)). </li></ol></li><li> Kultur von Makrophagen <ol><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder automatische Zellzähler. </li><li> Platte 1 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte oder 3 × 10 5 Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm) oder Dentinscheiben in 96-Well-Platte gelegt und bei 37 ° C </li><li> Saugen Sie alle Medien, die nicht-adhärenten Zellen und Inkubation Zellen bei 37 ° C mit frischem OCM (+) mit 25 ng / ml Maus M-CSF für 48 Stunden. </li><li> Saugen Sie alle Medien Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit frischem OCM (+)-Medien mit 25 ng / ml Maus M-CSF und 30 ng / ml Maus sRANKL Osteoklastogenese zu initiieren. Tanken Medien alle 3 Tage nach Bedarf. </li><li> Zellen wachsenca. 6-8 Tage, um das riesige Mehrkernzellen, die Resorption Knochen zu bilden. Sobald kernige Zellen erscheinen, führen TRAP (Tartrat-resistente saure Phosphatase)-Färbung mit einem kommerziell erhältlichen Kit, und als voll ausgereift, führen Funktionstests. Visualisieren F-Aktin-Ringe auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung und Bild die Zellen angebracht, um Scheiben durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), wie zuvor beschrieben 19 Dentin. </li></ol></li></ol> 3. Osteoklasten in vitro-Erzeugung aus Menschen PBMCs <ol><li> Isolierung von humanen PBMCs <ol><li> 10 ml vorgewärmten Histopaque-1077 in ein 50-ml-Tube. </li><li> Leere Leukozytenfilter aus Blutbank mit sterilem PBS erhalten in einen 50-ml-Tube (1:1-Verhältnis von Blut mit PBS). Schicht die verdünnte Blut über die Histopaque Lösung sehr langsam, dafür sorgen, dass das Blut nicht mit dem Histopaque mischen. </li><li> Zentrifuge Proben bei 1000 g für 20 min bei 18 ° C. Folgening Zentrifugation sorgfältig isolieren weiß Buffy-Coat-Schicht, die die weißen Blutkörperchen und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube. </li><li> Zellen mit PBS verdünnen und Zentrifuge wieder bei 650 g für 5 min, um die Zellen zu sammeln. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in OCM (-) Medien und zählen Zellen mit Zellzähler. </li></ol></li><li> Plating und Kultivierung PBMCs <ol><li> Resuspendieren der Zellen in OCM (+)-Medium und der Platte 8 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte oder 1 x 10 6 Zellen / ml pro Vertiefung in 96-Well-Platte. Platten Zellen auf Glasdeckgläschen (5 mm), die für Immunfluoreszenz-Bildgebung als auch auf Knochenscheiben für Knochenresorption Assays, wie zuvor beschrieben 20 erforderlich. </li><li> Änderung Kulturmedien, Auffüllen der Zellen mit menschlichen M-CSF alle 2-3 Tage oder nach Bedarf. Dann Differenzierungsschritt am Tag 5 gehen durch Zugabe von 30 ng / ml humanes sRANKL zusammen mit 25 ng / ml menschlichen M-CSF in OCM (+)-Medium zu initiieren osteoclastogenesist. </li><li> Wachsen Zellen für ca. 14 bis 21 Tage, um das riesige Mehrkern Zellen zu bilden. Sobald kernige Zellen angezeigt werden, können diese Zellen dann für TRAP beschriftet werden, und als voll ausgereift, können funktionelle Assays durchgeführt werden. F-Actin-Ringe können auf Deckgläsern mit Phalloidin-Färbung sichtbar gemacht werden. Die Morphologie der Zellen in Zellen angebracht, um Scheiben von SEM Dentin untersucht werden. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Erkrankungen des Bewegungsapparats sind die führenden Ursachen von Morbidität und Behinderung und werden von über 150 Krankheiten und Syndrome besteht; Auswirkungen auf heute etwa 90 Millionen Amerikaner. Gelenkentzündungen und Knochenzerstörung wiegen Merkmale Erkrankungen des Bewegungsapparats, einschließlich Arthritis und Osteoporose. Osteoporose ist eine Erkrankung, die Knochen schwächt Integrität, die häufig Frakturen der Knochen führt. Arthritis ist eine chronische, schwächende Erkrankung, die durch Entzündung der Gelenke, die geschwollen, zart und steif beschränke normalen Bewegung geworden und kann zu Invalidität führen. Obwohl die Pathogenese der Erkrankungen des Bewegungsapparates stark voneinander unterscheidet, ist die übergreifende Knochenzerstörung gemeinsames Merkmal. Knochenzerstörung in Erkrankungen des Bewegungsapparats wird in erster Linie durch ein Ungleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenbildung 21,22 verursacht. Ein therapeutischer Ansatz ist der Versuch, die Fähigkeit dieser Zellen, Knochen zerstören blockieren <sbis&gt; 23. Die Techniken und Verfahren ermöglichen die hier beschriebenen Studie von Osteoklasten in vivo und in vitro. Die in vivo hier beschriebene Modell verwendet Minicircles, die kleine episomaler DNA-Vektoren (~ 4 kb) aus Bakterien Rückgrat befreit, die auch als Transgen Träger 24 dienen. Miniringe Transgene exprimieren 10-1000 mal höher als normal bakterielle Plasmide mit einer stabilen Expression von bis zu mehreren Monaten. Die kleinere Molekülgröße von Minicircles trägt zur effizienteren Transfektionsrate und wesentliche Expression im Vergleich zu normalen bakterielle Plasmide 24. Daher Minicircles werden jetzt überall in der präklinischen Gentransferstudien 25,26 aufgebracht. Hydrodynamische Lieferung ist ein gut entwickeltes Verfahren, das auf hydrodynamische Druck in den Kapillaren an Plasmid-DNA in den ganzen Körper einer Maus liefern. Hydrodynamische Genübertragung auf Hepatozyten über Schwanzveneninjektion bei Mäusen etablierte to ausdrücken Transgens durch Plasmid-DNA-6. In diesen Studien überexprimierenden Maus sRANKL in der in-vivo-Maus-Modell wird durch hydrodynamische sRANKL MC und Lieferung über die Schwanzvene Injektionen erreicht. Maus sRANKL ELISA kann verwendet werden, um Serumspiegel von RANKL bei Mäusen nachzuweisen. Deutliche Erhöhung der Maus-Serum TRACP5b, einem Marker der Knochenresorption 27 wird in sRANKL Gentransfer Mäusen beobachtet. Insbesondere ist diese Technik nicht zu einer Überexpression von sRANKL beschränkt; es kann auch weiter angewandt werden, um andere sekretierte Proteine ​​28 überexprimieren. Der primäre technische Schwierigkeit bei diesem Verfahren ist die hydrodynamische Lieferung über die Schwanzvene. Abgesehen von regelmäßigen Schwanzveneninjektion, hydrodynamische Lieferung erfordert Lieferung von Minicircles in großen Volumina physiologischer Lösung in die Mäuse innerhalb von 5-7 Sekunden. So sind stetige Handhabung und Injektionstechniken für den Erfolg mit diesem Verfahren. Generieren sRANKL transgenen Mäusen ist ein weiterer Ansatz zur in vivo osteoclastogenesis. Allerdings kann eine hohe sRANKL embryonale Letalität 4 führen und Erzeugung transgener Mäuse ist auch teuer und zeitaufwendig. In OVX Nagetiermodell sowohl inflammatorische Zytokine wie TNF, IL-1 und IL-6 und die nicht-entzündliche Cytokin sRANKL tragen zur in vivo von Osteoclasten und Knochenverlust. sRANKL Gentransfer-Modell führt zu einer Überexpression von nur nicht-inflammatorischen Zytokins sRANKL. Daher ist die hier beschriebene sRANKL Gentransfer Modell bietet Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug, um den Beitrag der RANKL-RANK-Achse im Knochenumbau in der Abwesenheit von Entzündung zu untersuchen. Eine In-vitro-Kultur von Osteoklasten-Methode, die Co-Kultivierung von Knochenmarkzellen und Osteoblasten beinhaltet, wurde in den späten 1980er Jahren vor der Entdeckung von RANKL in späten 1990er Jahren 29,30 gegründet. Rekombinante M-CSF und RANKL induzieren die Differenzierung von Osteoklasten in vitro effizient einnd das Verfahren wurde bereits in anderen Studien beschrieben worden 3,31. M-CSF ist bekannt, RANK-Expression in frühen Osteoklastenvorläufer 32 zu stimulieren und als Überlebensfaktor für die Osteoklasten-Vorläufern und reifen Osteoklasten 33 handeln. RANKL ist wichtig für die Differenzierung von Osteoklasten und Aktivierung 3. Hier wird das Verfahren der In-vitro osteoclastogenesis beschrieben. Erfolgreiche Kultivierung und Differenzierung von Vorläuferzellen zu Osteoklasten erfordern sterile Zellisolierung und richtige Beschichtungstechniken sowie sorgfältige Verständnis von zeitgesteuerten Zellernte. Berechnet Plattierung der Zellen von entscheidender Bedeutung, da die Differenzierung von Osteoklasten erfordert Fusion von Osteoklasten-Vorläuferzellen 34 und eine unzureichende Anzahl von Osteoklasten-Vorläuferzellen Fusion und Differenzierung von Vorläuferzellen zu Osteoklasten nicht erleichtern. Ähnlich kann eine überschüssige Anzahl von Osteoklasten-Vorläuferzellen führt zur Bildung und schließlich Zelltod klumpen. Beseitigung nichtAdhärenten Zellen 2 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen kann dazu beitragen, eine optimale Zellzahl. Schließlich ist die Zeit der Zellernte entscheidend wie Osteoklasten terminal differenzierten kurzlebige Zellen mit einer Lebensdauer von ungefähr 48 Stunden 35. Somit sollten die Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der ersten Beobachtung kernige Zellen geerntet werden. Diese Zellen können dann durch TRAP und F-Actin-Färbung durch Immunhistochemie und Knochenresorption Aktivität kann durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) ermittelt werden charakterisiert werden. Diese experimentellen Ansätze ermöglichen eine klare Definition von Osteoklasten in ihren Phänotyp und Funktion. Die in vivo und in vitro hier beschriebenen Techniken wird die Entwicklung der Osteoklasten-Inhibitoren derzeit in präklinischen Studien zu erleichtern, die zu wirksamen therapeutischen Strategien für die Millionen von Osteoporose und Arthritis-Patienten weltweit.

Muskel-Skelett-Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten und Gegenwart schwerwiegende Folgen für die nationalen und lokalen Gesundheitssysteme ein. Diese Erkrankungen sind durch den Verlust von Knochen-und Gelenkfunktion, die umfangreiche Behandlung und lange Erholungsphasen erfordern gekennzeichnet. Üblicherweise wird eine relative Erhöhung der Anzahl und / oder Aktivität von Osteoklasten, spezialisierte Zellen zu Knochenresorption, Osteoporose und Arthritis beobachtet 2. Unter physiologischen Bedingungen ist die Anzahl und Aktivität von Osteoklasten durch Rezeptor-Aktivator-von Kernfaktor κ-B-Liganden (RANKL), die von Osteoblasten produziert wird geregelt. Osteoprotegerin (OPG), wird ein Köder Rezeptor für RANKL auch durch Osteoblasten 3 erzeugten In-vivo-Tiermodelle, die systemische Überexpression von sRANKL oder Deletion von OPG einzubeziehen sind sehr wertvoll bei Osteoporose-Forschung. Allerdings erfordern diese Verfahren die Herstellung von transgenen Mäusen 4,5. Hier wird eine neuartige AlternativeVerfahren überexprimieren sRANKL für die Untersuchung von Muskel-Skelett-bedingten Erkrankungen beschrieben. Insbesondere Minicircle (MC) DNA-Technologie und hydrodynamischen Versandmethoden wurden verwendet, um Gen-Transfer von sRANKL in vivo zu erreichen und überexprimieren Maus sRANKL systemisch 6. Diese Methode ist auch eine Ergänzung zu anderen in-vivo-Modelle von Osteoporose, wie hormonelle Modulation der Osteoklasten folgenden ovariectomy 7 und diätetische Intervention durch kalziumarme Ernährung 8. Diese Modelle sind sehr nützlich, um verschiedene Aspekte des Bewegungsbedingten Störungen aber sie erfordern chirurgische Verfahren und kann bis zu mehreren Monaten, was mit erheblichen Kosten 9 studieren. Ovariektomierte (OVX) Nagetier-Modell ist ein Modell, bei dem Versuchstier Entfernung der Eierstöcke führt zu Östrogenmangel, wodurch menschliche postmenopausalen Osteoporose 10 imitiert. Menschen postmenopausalen Osteoporose, eine Erkrankung, bei Östrogen deficirenz führt zu einem erhöhten Risiko von Knochenbrüchen und Osteoporose rund acht Millionen Frauen allein in den Vereinigten Staaten. Obwohl die OVX Modell ist nützlich für postmenopausalen Osteoporose bietet begrenzte Vorteile bei der Untersuchung von Osteoporose im Allgemeinen. Östrogen unterdrückt Knochenverlust, durch Induktion von Osteoklasten und Osteoblasten Hemmung der Apoptose, also in seiner Abwesenheit eine erhöhte Aktivität der Osteoklasten beobachtet 10-12. Ein RANKL-OPG-Verhältnis Ungleichgewicht, das die Knochenresorption begünstigt wird auch beobachtet, 13. Jedoch Östrogenmangel in vivo auch begleitet von verringerten Niveaus des transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β), erhöhte Interleukin-7 (IL-7) und TNF, IL-1 und IL-6 14,15. Da diese Zytokine Knochenumbau modulatorische Funktionen der RANKL Weg unabhängig bekannt ist, ist es unmöglich, eine Osteoklastenaktivierung nur auf die RANKL-RANK-Achse zuzuordnen. Die in diesem Dokument beschriebene Modell ermöglicht es Forschern, in viv studierenRANKL-RANK-o-Achse in Osteoklastogenese und Knochenverlust ohne pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu OVX Nagetiermodellen. Zusätzlich kann in vitro Osteoklastogenese Techniken sind wesentliche Instrumente zur Aktivierung der Osteoklasten für mögliche therapeutische Behandlungen von Muskel-Skelett-Erkrankungen zu studieren. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass die Kultivierung Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) mit Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Maus sRANKL können, um die Differenzierung von Osteoklasten 3,16,17 führen. Hier werden die Protokolle kernige Osteoklasten-ähnliche Zellen aus Maus-Knochenmark sowie aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in vitro zu erzeugen 18 beschrieben. Die zellbasierte Assays erforderlich, um eine reife terminal differenzierten und voll funktions Osteoklasten definieren ebenfalls kurz beschrieben. Diese in-vitro-Techniken ergänzen den Roman in vivo Ansatz zusammen und dienen als powerful Untersuchungswerkzeuge, um die Differenzierung von Osteoklasten und Aktivierung zu studieren. Mit Hilfe dieser Systeme sind die Wissenschaftler in der Lage, die Osteoklasten in vivo und in vitro zu erzeugen und definieren Sie die Reize und Signale für ihre Verbreitung und Aktivierung erforderlich sowie testen die Wirksamkeit von pharmakologischen und biologischen Inhibitoren.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&amp;nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Hier wird ein neuartiges Gentransfertechnik zur Differenzierung von Osteoklasten in vivo Zellkulturprotokolle zur Differenzierung in Osteoklasten-Vorläuferzellen in vitro als ein Verfahren, um die Wirkungen von Cytokinen auf die Entstehung von Osteoclasten zu studieren beschrieben. In Fig. 1 sind die repräsentativen Ergebnisse erfolgreicher Gentransfer von GFP und Maus sRANKL MC in Mäusen gezeigt. In Abbildung 2 sind die repräsentativen Bilder von Knochenmark der Maus oder menschlichen PBMC Zelldifferenzierung Zeitverlauf Kulturen von Vorläuferzellen zu Osteoklasten durch Hellfeldmikroskopie gezeigt. Abbildung 3 sind die repräsentativen Bilder aus drei unabhängigen Methoden zur Charakterisierung von Maus-Knochenmark stamm Osteoklasten gezeigt . Die Anwesenheit von Maus sRANKL aktiviert die Expression des TRAP (3A und B) und die Bildung von F-Aktin Ringe (3C und D). Scannen electron (SEM) zeigt, dass Maus sRANKL induziert die Bildung von Riesenzellen, die Knochen resorbieren (Fig. 3E und F). Fig. 4, die gleichen Methoden zur Charakterisierung von menschlichen PBMC abgeleitet Osteoklasten gezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. SRANKL in vivo Gentransfer führt zu erhöhten Osteoklastogenese. Frontalansicht von A, B) Mausleber Explantate und C, D) Ganzkörperbilder von 12 Wochen alte C57BL / 6 männlichen Mäusen mit 5 ug GFP oder sRANKL injiziert MC DNA. Der Pfeil zeigt die GFP-Expression in vivo Gentransfer in GFP-Maus. RANKL Gentransfer-Mäuse dienen als ohne Hintergrundfluoreszenz. Bilder von Maestro 2 Imager, ein Tag nach der Gen-Transfer-(rot und grün d erfasstenote Hintergrund und GFP, respectively) E) Plasmid-Karte von sRANKL MC-DNA-Konstrukt und F) sRANKL im Serum bei 1, 5 analysiert und 11 Tage. verfassen GFP oder sRANKL Gentransfer. G) Maus-Serum TRACP5b Ebene analysiert 11 Tage nach GFP oder sRANKL Gentransfer. Skalenbalken zeigen 5 mm in A, B, und 10 mm in C, D. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. In vitro Osteoklastogenese in Maus und menschlichen Zellkultursystemen. Hellfeld-Mikroskopie von Mauszellen aus dem Knochenmark isoliert und kultiviert in Gegenwart von 25 ng / ml Maus M-CSF und 30 ng / ml Maus sRANKL, die eine Differenzierung Zeitverlauf an den Tagen A), 2 B) 5 und C) 8. Hellfeld-Mikroskopie von menschlichen Zellen isoliertaus dem peripheren Blut und in Gegenwart von 25 ng / ml menschlichen M-CSF und 30 ng / ml menschlichen sRANKL zeigt eine Differenzierung Zeitverlauf an den Tagen D), 4 E) 14 und F) 21 kultiviert. Maßstabsbalken zeigen 20 um. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Erzeugung und Charakterisierung von Maus Osteoklasten. TRAP-Färbung (pink) von Mauszellen aus dem Knochenmark isoliert und für 6 Tage in der Gegenwart von A) kultiviert, 25 ng / ml Maus M-CSF oder B) 25 ng / ml Maus M -CSF und 30 ng / ml Maus sRANKL. Phalloidin (grün) und DAPI (blau)-Färbung von Mauszellen aus dem Knochenmark isoliert und für 8 Tage in Gegenwart von C) 25 ng / ml Maus-M-CSF oder D) 25 ng / ml M-CSF der Maus und 30 ng / ml Maus sRANKL, die die Bildung von FaCTIN Ring in kernige Zellen. REM-Aufnahmen von Mauszellen aus dem Knochenmark und für 8 Tage in Gegenwart von kultivierten E) 25 ng / ml Maus-M-CSF oder F), 25 ng / ml M-CSF der Maus und 30 ng / ml Maus sRANKL, die die Bildung von isolierten Resorption von Knochenbereichen, wie durch die Pfeile angedeutet. Maßstabsbalken zeigen 40 um AD und 30 um E, F. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Erzeugung und Charakterisierung von humanen Osteoklasten. TRAP-Färbung (pink) von menschlichen Zellen aus PBMCs isoliert und kultiviert für 15 Tage in Gegenwart von A) 25 ng / ml menschlichen M-CSF oder B) 25 ng / ml humanes M- CSF und 30 ng / ml menschlichen sRANKL. Phalloidin (grün) und DAPI (blau)-Färbung von menschlichen Zellen aus PBMC isoliert und kultiviert für 19 Tage in Gegenwart von C) </strong&gt; 25 ng / ml menschlichen M-CSF oder D) 25 ng / ml menschlichen M-CSF und 30 ng / ml menschlichen sRANKL, welche die Bildung von F-Actin-Ringe in mehrkernige Zellen. REM-Aufnahmen von menschlichen Zellen aus PBMC isoliert und kultiviert für 18 Tage in Gegenwart von E) 25 ng / ml menschlichen M-CSF oder F), 25 ng / ml menschlichen M-CSF und 30 ng / ml menschlichen sRANKL, die die Bildung der Resorption Bereiche auf Knochen, wie durch die Pfeile angedeutet. Skalenbalken zeigen 10 um A, B, C in 20 &amp;mgr; m, 15 &amp;mgr; m in D E, F.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders at JoVE.com

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Gentransfer-Technik und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K Aufrufe.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

Serie: A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Medizin

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biotechnik

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Immunologie und Infektion

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

Eine Lab-On-A-Chip-Plattform zur Stimulierung der Osteozyten-Mechanotransduktion und zur Analyse der funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

<meta charset="utf8"></head><body>Osteo-Organoid-abgeleitete Zellen für eine effektive HSZT bei bestrahlten Mäusen

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

A Novel

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Medikamentöse Behandlung und

Models von Knochenmetastasen

Sequentiell

Kombiniert

Anwendungen

Femur Fensterkammer Modell für

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Eine Lab-On-A-Chip-Plattform zur Stimulierung der Osteozyten-Mechanotransduktion und zur Analyse der funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen