Name: production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization
Uploaded: 2014-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: מענקי NIH K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מצעד הפרוטות בזיל אוקונור Starter Scholar פרס # 5-FY12-75; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעי ביולוגיה; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת הנוטר דאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם על המסירות יוצאת דופן שלהם בטיפול וברווחה של המושבה דג הזברה שלנו. אנו מודים GF גרלך ללקיחת התמונות הניתנות באיור 4. לבסוף, אנו מודים לכל החברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, הדיונים וinsigHTS על עבודה זו.

הערה: הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת נוטרדאם. הערה: אף על פי הפרוטוקול הבא מספק הדגמה של בידוד זרע שכרוך בהמתת חסד של זכרים, זרע ניתן לאסוף מנקבובי באיברי המין של הרדים חיים דג הזברה זכר באמצעות לחץ בטן עדין וmicrocapillary לאיסוף זרע 17,18. סחיטה של זכרים חיים דורשת כמה גברים כדי לשמש על מנת לאסוף כמות שווה הערך של זרע שניתן להשיג מאחד 17,18 זכר מורדמים. עם זאת, גברים שעברו סחיטה להישאר בריאים למדי ויכולים לשמש להזדווגויות טבעיות או נהלים שבלאחר מכן מבחנה 17. במידת האפשר, נהלים שנבחרו צריכים למזער הקרבת דגים מיותרת. 1. הכנת הפתרונות ולשכות מזווגים דג הזברה &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות המניות של האנק (# 1, 2, 4, 6) וPremix הפתרון של האנק (ראה טבלת חומרים) 19, ולאחר מכן חיטוי ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המספר הרצוי של נקבה בוגרת דג הזברה (ים) לאוסף מצמד הפלואידים. הערה: בהתבסס על ניסיון, באמצעות F1 mutagenized המורכב מדג זברת מתח טובינגן טהור, כ 50% מנקבות לבגרות מינית היו &#39;סחיטים&#39; בממוצע לאחר תחול אותם על ידי הצבת אותם בכלוב הזדווגות לילה עם גבר - כלומר מצמד הושג באמצעות ההליך הסחיט - ורוב הציפורניים אלה (הנעים בין 70-90%) המיוצר על haploids קיימא. עם שני חוקרי ביצוע ההכנה הפלואידים, דג הזברה F1 הנשי כ 80 מבוגר יכול להתמצות בבוקר אחד. כדי לחשב את חומרים כימיים נחוצים לניסוי, הגורם הפלואידים בשני השיעור לסחוט של דור F1 ומספר החוקרים הזמינים לבצע את experiment. זכור כי מספר הנקבות שיפיקו ציפורניים הפלואידים באיכות גבוהה מאוד משתנה, עם הבדלים שנצפו בין נקבות דג הזברה של זנים שונים, גילים, ודיאטה מזון 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כלובי הזדווגות על ידי הצבת כל נקבת דג הזברה מבוגר עם דג הזברה זכר בוגר בתא של מים במערכת, כך שהם מופרדים על ידי חוצץ בין לילה. הערה: נקבות צריכה להיות חשופות ללילה זכר לראש, או להכין אותם, להשרצה באמצעות סחיטה. </li></ol> 2. Dissection של אשכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך טרי # 6 מלאי הפתרון של האנק ידי הוספת 0.35 גרם של סודיום ביקרבונט ל10 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים היטב לפזר אבקת הסודה לשתייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב הבא בצינור על קרח על מנת להפוך את הפתרון עובד הסופי של האנק שנאגרו לזרע: 9.9 מיליליטר של הנקס Premix אני עם של פתרון מניות 100 μl # 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב, ולאחר מכן aliquot 500 μl של האנקפתרון של גמר עבודה לתוך צינור microcentrifuge ומניחים על קרח; 7. הערה: כל aliquot μl 500 ישמש כדי להכין את הזרע מהאשכים של 4-5 דג הזברה ממין זכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בין 4-5 דג הזברה זכר לכל קציר זרע. הערה: זה למסוק מספיק זרע שנאסף, מעובד ומאוחסן בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge אחד, אשר יכול להיות מנוצל כדי להפרות כ 15 ציפורניים הפלואידים. בחר מחזורים נוספים של זכרים על מנת להכין את צינורות נוספים תלוי בהיקף של הניסוי. אם דג הזברה הזכר שנבחר הוא קטנים או נתיחת האשכים אינן שלמה, בדרך כלל 5 זכרים יהיו צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים כל זכר באמצעות רשת להעביר בעדינות את הדגים לצלחת המכילה tricaine 0.2% למשך כ 5-6 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: היזהר, כדי להבטיח שהזכר כבר מורדמים כראוי לפני תחילת הניתוח. בדרך כלל, להמתין מספר דקות (2-3) אחרי הזימים של מפסיק לנוע דגים והדגיםכבר לא מגיב למגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחור את הגברי בעדינות עם כפית פלסטיק ולמחוק את הזכר היבש של נוזל בזהירות. בשלב בא, להסיר את ראשו של הגבר עם זוג מספריים חד ולאחר מכן לחתוך חתך לאורך קו האמצע הגחון. הערה: להסרת של כל הנוזל העודף מהדגים היא חיונית כדי למנוע מפעילה הפעלה של הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבטן ואיברי הבטן קשורה מחלל הבטן באמצעות מלקחיים ומקום טובים למכל Biohazard לסילוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בסדר להסיר את האשכים, אשר ממוקמים לאורך קיר גוף הגבי, לרוחב לשלפוחית ​​השחייה, ויש לו מראה לבן אטום, כאשר מתחת לסטראו. הערה: שמירה על האשכים שלמים יכולה לעזור כדי למנוע חשיפה של הזרע לנוזלי גוף על בסיס מים ובכך למנוע הפעלה מוקדמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האשכים לתוך תמיסת הזרע בקרח ולשמור את הצינור על קרח כאשכים אחרים הם גזורים. חזור על שלבים 2.6-2.9 עד שכל מ &#39;Ales כבר גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפגרים וכל רקמות בבעלי חיים שנותרו למכל Biohazard להשלכה מוסדית מתאימה. </li></ol> 3. UV זרע איון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize האשכים בעדינות על ידי טחינת צינור microcentrifuge עם העלי microtube סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצלחת פטרי קטן או זכוכית שעון על קרח. הערה: אל תעביר פסולת רקמות יחד עם פתרון supernatant. הפעולה זו תיצור צללים ולהתפשר איון UV של זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את צינור הזרע עם בין 300-400 μl של הפתרון של האנק נוסף גמר עבודה (מוכן בשלב 2.2 ומאוחסן על קרח), ולהוסיף לשטוף supernatant זה לצלחת פטרי הקטנה או לצפות בזכוכית בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצלחת לUV ממנורת ספסל (254 ננומטר) עבור סכום כולל של 2 דקות במרחק ממקור המנורה של כ 15 ב( 38.1 סנטימטר). הערה: השתמש בזהירות בעת עבודה עם מנורת UV וללבוש מגן פנים אוציוד אחר עין מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצלחת לדלי הקרח, ואז להעביר את הזרע המומת UV לצינור microcentrifuge טרי ולאחסן את המדגם על קרח. הערה: בשלב זה לא יהיה כ 800 μl של זרע UV מומת להפריה מצמד הפלואידים. הזרע צריך להיות כל הזמן על קרח לאורך כל משך הזמן המושקע בלוחץ נקבות. זרע בהאנק של קר יכול לשמש לתקופה של עד 6 שעות ללא הפחתה כלשהי בתוצאות הפריה. מעניין לציין, כי חוקרים אחרים דיווחו כי הזרע בהאנק של קר הוא בת קיימא מכמה שעות עד כמה ימים 18. </li></ol> 4. רכש ביצה ממבוגרי דג הזברה נקבה והפריה חוץ גופית של המצמד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמבטיה tricaine להרדמה על ידי שילוב של 20 מיליליטר של 0.2% מניית tricaine עם 80 מיליליטר של מים במערכת דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הנקבה לאיסוף ביצים, תוך שימוש ברשת כדי למקם אותה בעדינות בצלחת של TRicaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2-3 דקות עד שהנקבה היא מורדמת וכבר לא מגיב למגע. הערה: אם הפרכוסים או נקבה מעוררות תנועות אחרות, לתת זמן הנוסף להיכנע להרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפית פלסטיק בעדינות להרים את הנקבה, decanting הפתרון לפני הצבת הנשים על גבי מגבת נייר לפתיל משם את נוזלים עודפים. הערה: היזהר שלא לעזוב את פתרון נוסף על הנקבה, כנוזל יפעיל הפעלת ביצה לפני התוספת של זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנקבה בשקופית שלה בצלחת פטרי נקייה ולדמיין את בטנה מתחת לסטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלטף את הבטן של הנקבה בעדינות במשך כ 10-20 שניות באמצעות אצבע אחת או שתיים מהיד אחת כדי לסחוט את הביצים מהבטן שלה, בינתיים תמיכה בגב של הנקבה על ידי מיקום אצבע אחת או שתיים מצד השני, ממש מאחורי קיר הגוף הגבי שלה. הערה: לאחר שמלטף את הבטן של הנקבה, את הביצים צריכה לצאת בקלות רבה. אם ביצים לא תצא שנינותשעות להקל זה לא מומלץ ל&#39;לדחוף חזק יותר &#39;וביצים בכוח מהמין הנקבה. זה מצביע על כך הביצים אינן נוכחים ו / או לא מוכנות להפריה, והמשיך לדחוף קשור לסיכון ניכר של פגיעה בנשים (למשל, ניכוי שלפוחית ​​השחייה או גרימת חבלה פנימית קטלנית אחרת). אם נקבה היא לחצה אבל מספקת ביצים אף אחד או כמה, להחזיר את הנקבה למתקן של בעלי החיים. לאחר 1-2 שבועות של מנוחה, זוג הנקבה עם זכר להזדווגות טבעית כדי לנקות את פסולת ביצה שיורית. להפריד נקבות, כי בן הזוג באופן טבעי למכל לעוד 1-2 שבועות של מנוחה לפני שאתה מנסה לסחוט שני. לחלופין, יכולות להיות נחות נקבות במשך 4 שבועות, שבמהלכם ניתן להגדיר להזדווגויות טבעיות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדיקה קנס או מרית קטנה כדי לגרוף את ביצים מתחת לנקבה ו / או משטחה בבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות את הנקבה ותחזיר אותה למכל בידוד שכותרתו כראוי מכיל מים מערכת דגים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון זרע UV מומת למקבץ ביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 שניות שבמהלך זמן, להדביק תווית מתאימה לצלחת לעקוב אחריו עם המספר שהוקצה להורה הנקבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של E3 לביצים, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון E3 מספיק כדי למלא את הצלחת באמצע הדרך, ולמקם את העוברים ב28 מעלות צלזיוס במשך דגירה לאחר מכן. הערה: התוספת של פניצילין / סטרפטומיצין (1% (v / v) פתרון העט סטרפטוקוקוס המכיל פניצילין 5,000 יחידות ו -5 סטרפטומיצין מ&quot;ג לכל מיליליטר) 19 לE3 יכול לסייע בבריאות כללית של העוברים הפלואידים. </li></ol> 5. תצפית וטיפול בעוברי הפלואידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 4-8 שעות, להסיר עובר מופרה מהצלחת ולשטוף את העוברים שנותרו על ידי החלפת כלי תקשורת עובר E3 עם פתרון E3 טרי. הערה: עוברים מופרה יציגו מראה לבן, אטום או יכולים להציג שקוףppearance עם תא בודד מעוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עד נקודת העניין בזמן רצוי, ולאחר מכן לנצל בassay המסך הרצוי או יישום אחר במחקר (ים). </li></ol>

<ol>
	<li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-26 (1996).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-43 (1996).</li><li>Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+make+a+big+splash.">Zebrafish make a big splash.</a> Cell. 87, 969-977 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Bradford, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFIN:+enhancements+and+updates+to+the+zebrafish+model+organism+database.">ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li><li>Bowen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mapping+and+cloning+of+mutations+in+zebrafish+by+low-coverage+whole-genome+sequencing.">Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing.</a> Genetics. 190, 1017-1024 (2012).</li><li>Leshchiner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+mapping+and+identification+by+whole-genome+sequencing.">Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing.</a> Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).</li><li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+positional+cloning+of+zebrafish+mutations+by+linkage+and+homozygosity+mapping+using+whole-genome+sequencing.">Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing.</a> Development. 139, 4280-4290 (2012).</li><li>Voz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+homozygosity+mapping+and+identification+of+a+zebrafish+ENU-induced+mutation+by+whole-genome+sequencing.">Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploid+screens+and+gamma+ray+mutagenesis.">Haploid screens and gamma ray mutagenesis.</a> Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).</li><li>Steisinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2,+Embryo+Production+by+in+vitro+fertilization.&#8221;.">Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Walker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+gynogenetic+diploid+zebrafish+by+early+pressure.">Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure.</a> (28), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10:+Recipes.&#8221;.">Chapter 10: Recipes.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+medaka+fish+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.</a> Science. 326, 430-433 (2009).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+haploid+embryonic+stem+cell+cultures+in+medaka+fish.">Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish.</a> Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).</li><li>Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.&#8221; Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הקרנת הפלואידים היא טכניקה שימושית כדי לגלות גנים חיוניים הנדרשים לשלבים התפתחות מוקדמים. יתר על כן, culturing של תאים הפלואידים מדגי medaka נעשה שימוש כדי לבודד את שורות תאים כמו ES שיש מחקר יישומים רבים ופוטנציאל, הוכחת כי תאים הפלואידים עשויים לספק מקום בעתיד בעל ערך עבור סוגים אחרים של מחקרים גנטיים חוליות 20,21. פרוטוקול זה מספק הדגמה של השיטות מעורבות עם ביצוע הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים באמצעות הפריה חוץ גופית עם זרע UV מומת. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי קדימה הפלואידים עם דגי F1 mutagenized, אשר יכול להתבצע באמצעות סוג בר, מהונדס או זנים מוטנטים להקרנה משפר / מדכאת. למרות זמן ההקרנה משתמש באסטרטגית הפלואידים הוא במידה רבה מתקצר בהשוואה להקרנת דיפלואידי, זה בכל זאת לקחת כמה חודשים כדי להשלים. כפי שאנו descriהמיטה בעבר, יש יתרונות רבים שקיימות על ידי ביצוע מסך באמצעות סכימה הפלואידים, כל מה שיכול לסייע בקבלת תרומות חדשניות לידע הנוכחי על כל מספר של אירועים התפתחותיים. המתודולוגיה מסך הפלואידים היא יעילה יותר לזיהוי אללים מוטציה רצסיבית ממסכים מבוססי דיפלואידי בשל ההפחתה של זמן, המרחב, ואת מספר הדגים שיש צורך. עם זאת, ישנם מספר החסרונות למסך הפלואידים. מסך הפלואידים יכול רק לזהות מוטציות בגנים הפועלים בתחומי הימים הראשונים של פיתוח, כעובר יכול לשרוד רק לזמן מוגבל עם הגנום הפלואידים. הגנים שבאים לידי ביטוי מאוחר יותר בפיתוח הייתם צריכים להיות מזוהים על ידי שיטה אחרת, כגון מסך דיפלואידי. כמו כן, כמה איברים לא מתפתחים כראוי באורגניזם הפלואידים. יתכנו מומים אנטומיים, או שעתי עיכוב של פיתוח, שעלול לגרום למוטציה להיות על ידי טכניקת ההקרנה הפלואידים שלא נענתה. אניבנוסף n, כמה זנים של דגים לא מתפתחים, כמו גם במצב הפלואידים 15. ניתן לסווג Haploids על ידי סדרה לדירוג של תכונות עובריים טובות, בינוניות וגרועות, עם עוברים להיות הכי הנורמלי, B לייעד עובר עם מומים בציר אבל ראש צלול וזנב, ו-C / D לייעד עובר עם הכר תכונות (המונים של תאים על גבי כדורי חלמון) 15,17. הפרופורציות של עוברים בתוך קטגוריות אלה משתנות בהתאם לזן דג הזברה, עם מספרים מוגברים של haploids איכות טובה יותר שכיח יותר ברקע גנטי מסוים 15,17. בשל גורמים אלה, יש צורך למצוא את מתח נכון של דג הזברה לבצע mutagenesis וצלבים שלאחר מכן. בניסיון האחרון שלנו, את מתח טובינגן סוג בר הפיק haploids קיימא לסינון (כפי שמוצג באיורים 3 ו 4) אם כי חוקרים היסטורי דג הזברה יש ניצלו את AB או AB * הזנים לexperim הפלואידיםentation 15. בנוסף לאתגרים הנ&quot;ל, לא כל נקבות דג הזברה מבוגר דרוכים תפיק מצמד על ביצוע טכניקת הסחיטה. לדוגמא, בעבודה עם נקבות זן טובינגן mutagenized-ENU, כמחצית מכל הנשים המיוצרת על מצמד לוחץ, ואיזה חלק מהם (בדרך כלל 10-30%) היה באיכות ירודה או עובר לא יכול להיות מופרה. לכן, כדי לבצע מסך הפלואידים אחד חייב לתכנן להעלות דגים לפחות פעמיים לפי צורך להקרין את המספר הרצוי של הגנום (כל נקבה מייצגת גנום אחד הוקרן). ללא קשר לשיקול זה, את היתרונות של שיטת הפלואידים של הקרנה כדי לכסות מספר גדול של גנומים ללא מתקן בעלי חיים מאסיבי הם אכן די משמעותיים אם assay הוא נוח למדינה הפלואידים. עם זאת, זה צריך להיות גם ציין כי המחקר נוסף של המוטציה (ים) שזוהה במצמד הפלואידים הוא סומך באופן מלא על גיוס בהצלחהoutcross n מהנשי המייסד. כמו בכל מסך, &#39;פוגע&#39; בתחילה זוהה במהלך תהליך המיון חייב להיות מחדש שזוהה במצב דיפלואידי. למרות החסרונות של שימוש במסך הפלואידים, זה הוכיח להיות מוצלח מאוד בזיהוי מוטציות, שכבר ניתחו לעומק עם רווחי תובנה התחום המדעי 15. יכולים להיות מיושמים במסכים הפלואידים כדי לחקור תהליכים הבינו היטב אחרים של התפתחות חוליות. שימוש haploids למסכים משפר ומדכאים הוא אחת דרכים להשיג תובנה רבה יותר על הפעילויות ורשת רגולציה של גן של עניין. גם טכניקת הקרנת הפלואידים יכולה לשמש כדי לזהות משפרי ומדכאים של מוטציות שכבר מבודדים על ידי שיטות כגון mutagenesis כימי או insertional או להפוך גנטיקה גישות כמו עיבוד הקרקע או TALENs. בקיצור, המוטציה מבודדת בעבר ניתן mutagenized עם ENU והוקרנה למשפרים או suppressors של פנוטיפ מוטנטי המקורי. המוטציה חייבת להיות מסוגל להגיע לשלבים בוגרים, ולכן יש צורך להיות בעלי חיים הטרוזיגוטיים או דגים מוטנטים הומוזיגוטים חלשים לבצע מסך זה, עם זאת ההתקדמות בtransgenesis אפשרה לחוקרים לעקוף את הבעיה הזו. ללמוד איך לתפעל מסלולים בפיתוח יכול להוביל להרבה אפשרויות מרגשים כולל האפשרות של מסלולים מביכים לטיפול במצבי מחלה.

התהליכים הבסיסיים שלתזמר פיתוח חוליות הם נשמרים באופן כללי 1. דרך רבת עוצמה לזיהוי גנים עם תפקידים חיוניים בפיתוח היא לבודד מוטציות תורשתיות הגורמים לפגמים פנוטיפי בתהליך של עניין. דג הזברה, Danio rerio, הוא בעלי חוליות קטנים של מים מתוקים השייך למשפחת דגי Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל בשימוש נרחב לגנטיקה התפתחותית חוליות בעשורים האחרונים 2. ביצי דג הזברה הם מופרה חיצוניים, המאפשרים גישה להזיגוטה מהתחלתה של הפריה 3. יתר על כן, העובר המוקדם הוא שקוף אופטי, המאפשר הדמיה של פיתוח עם סטראו פשוט 3. ontogeny דג הזברה הוא מהיר, עם התהליכים של מחשוף, gastrulation, וorganogenesis של מבנים רבים, כגון לב וכליות, השלימו במידה רבה על היום הראשון של פיתוח 3. Tהוא הזמן משלבי זחל לבגרות מינית לוקח 2-3 חודשים, והמבוגרים הם בעלי חוליות קטנות כ 3-4 סנטימטר באורך, יכול להישמר כל כך הרבה דגים בשטח מינימאלי 2. בנוסף, יש לי מבוגרים דג הזברה פוריות גבוהה, עם כל דגים מסוגלים לייצר כמה מאה עוברים בשבוע 2. תכונות אלו הפכו את העקיבות של דג הזברה לקדימה לאחור מסכי גנטיים. דג הזברה יש רמה גבוהה של שימור באנטומיה שלהם, ביולוגיה של תא, ופיזיולוגיה עם יותר מינים של בעלי חוליות מתקדמים כמו יונקים 2,4. למעשה, ניתוח הרצף האחרון הוכיח כי הגנום דג הזברה מכיל homologs לכמעט 70% מהגנים אנושיים 5. שימור זו אפשר לחוקרים להשתמש בדג זברה כמודל למחלות בבני אדם רבים, ובם שתי עובריים ו2,4 תנאים מבוגרים. יחדיו, גורמים אלה הפכו את דג הזברה מערכת מצוינת למסכים שמטרתה זיהוי גנים החיוני לontogeny חוליות נורמלי. מספר המסכים בקנה מידה הגדול שבוצע בדג זברה וזיהה כמה אלף מוטציות בגנים התפתחותיים 6-8. זכר בוגר דג הזברה הוא נוח לmutagenesis, ויכולים להיות שנוצרו שינויים כרומוזומליים בתדירות גבוהה יחסית באמצעות ethylnitrosourea mutagen הכימי (ENU) 6,7 או mutagenesis insertional רטרווירלי 9. נכון להיום, למעלה מ 9,000 מוטציות תורשתיות נוצרו, והם כוללים גנים המשפיעים כמעט על כל ההיבטים של עובר. קהילת דג הזברה הקימה בנק מרכזי של מוטציות אלה במרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (או Zirc) 10, שנאסף כ -5,000 אללים מוטנטים ומהונדסים מכל רחבי העולם. רבים ממוטציות אלו כבר נותחו ומשובטים, לתת לחוקרים על פני תחומים ביולוגיים מידע בעל ערך שבו נעשה שימוש להקניט בנפרד נומרומסלולי הסלולר והפיסיולוגיים דרך תובנות שמקורן בניסויי דג הזברה. למרות שמסכים קדימה זיהו מספר מרשים של גנים חשובים, הרבה עדיין לא זוכים להערכה על רשתות רגולציה הגנטיות אשר מתווכות מספר עצום של תהליכים. מסכים רבים שנעשה עד כה לא הגיע לרוויה, ולכן קדימה, כמו גם מסכי גנטיים הפוך נשארו אבן פינה לזהות ולנתח את מנגנונים של עובר. אמנם יש תובנות עצומות שניתן לדלות מכל קו מוטציה דג הזברה אחת, גורם מרכזי המגביל בתחום כבר היסטורי מאמץ הזמן רב המעורב בשיבוט positional. מסיבה זו, את זהותו של מוטציות כימית שגרמו רבות נותרה בגדר תעלומה. עם זאת, עם כניסתו האחרונה של גישות רצף הגנום כולו המאפשרות שיבוט מהיר 11-14, זיהוי יעיל מאוד של מוטציות גנטיות הוא עכשיו פהasible. המסך קדימה הטיפוסי בדג הזברה הוא מסך דיפלואידי שיכול לזהות מוטציות רצסיבי בתוך שלושה דורות 6,7 (איור 1, עזב את הטור). טכניקה זו כרוכה מוטציות יצירה בתאי הנבט של זכר ההורים (P), ולאחר מכן הזדווגות הזכר הזה עם נקבה מסוג בר. כל אחד מצאצאי הדור הראשון (F1) מהזדווגות זו תהיה נמל מוטציות ייחודיות אחד או יותר בשל תרומות כרומוזומליות של הגנום האבהי שעבר מוטציה. צאצאי F1 גדלים וoutcrossed עם סוגים פראיים ליצור משפחות F2. במשפחת F2, אחים יהיו גם סוג בר או נשאים הטרוזיגוטיים, והם incrossed באופן אקראי כדי ליצור ציפורני F3 שהם ניתחו לפנוטיפ (ים) של עניין. ציפורני F3 של נשאים הטרוזיגוטיים תכיל 25% סוג בר, הטרוזיגוטיים 50%, ו25% דגים מוטנטים הומוזיגוטים. סכימת הקרנה רבת דורית זו היא יעילה, עם זאת חסרון עיקרי אחד לזהpproach כולל את הזמן הדרוש כדי להתכונן למסך: לפחות 1 שנה של גידול דגים לבד מעורבת, שכן כל דור ודור דורש כ 3 חודשים כדי להגיע לבגרות מינית. מגבלות אחרות של סוג זה של מסך דיפלואידי הן העבודה, מרחב, ועלות דיור דורות הבאים. מסך הפלואידים הוא חלופה אחת שיכול לשמש לזיהוי ולאחר מכן לבודד מוטציות רצסיביות באמצעות אסטרטגיות mutagenesis דומות 15 (איור 1, עמודה ימנית). הייצור של עוברי דג הזברה הפלואידים תואר לראשונה לפני למעלה משנתי 30 16, ואת יכולתו של דג הזברה בדרך כלל דיפלואידי לפתח במשך כמה ימים עם ploidy כרומוזומליות הפלואידים נוצלה עבור מחקרים גנטיים רבים שכן זה זמן. היתרון העיקרי של מסך הפלואידים הוא ששיטה זו אינה כרוכה בגיוס משפחות F2 כדי למסך עבור אללים מוטציה רצסיבית. במקום זאת, נקבות דור F1 מוערכות עבורheterozygosity של מוטציות רצסיבית בתהליך של עניין על ידי בחינת צאצאי F2 במצב הפלואידים (איור 1, עמודה ימנית). בסך הכל, הצעדים כדי להשיג עוברי הפלואידים הם יחסית פשוטים (איור 2). לאחר ההכנה של הפתרונות הנחוצים לטיפול בזרע, ביצים מתקבלות מנקבות דור F1 על ידי מניפולציה ידנית כדי extrude (או &quot;לסחוט&quot;) את הביצים מהבטן. ברגע שהביצים מתקבלות, הם מופרה במבחנה על ידי חשיפה לקרינת אולטרה סגולית זרע (UV) מומת. הזרע המומת UV אינו מסוגלים לתרום DNA קיימא לביצה בשל העובדה שUV באורך הגל הקצר Crosslinks DNA האבהי. עם זאת, הזרע עדיין מסוגל לעורר פעילות ביצה ואירועים הקשורים בהתפתחות zygotic. עם ההפעלה מטבולית, הביצה תשלים מיוזה השנייה, ולהמשיך לפתח עם העותק הופקד אימהי רק אחד מכל chromosoשלי. בגלל ploidy 1N זה, העובר הוא בכפוף לתוצאות התפתחותיות של אלל מוטנטי רצסיבי, אם הוא קיים בכרומוזום אימהי. לכן כל מצמד הפלואידים F2 יכיל wildtype 50% ועוברי מוטציה 50% אם האם נשאית הטרוזיגוטיים של אלל רצסיבי penetrant באופן מלא. התפלגות זו של גנוטיפים עובריים מאפשרת בקלות יחסית במונחים של הערכת המצמד לנוכחותו של פנוטיפ מוטנטי (ים) של עניין. אם הפנוטיפ שיאתר כזו, המייסד הנשי דור F1 הוא outcrossed המשך לדג זברת זכר סוג בר ליצור ולגייס יותר נשאים הטרוזיגוטיים. בגלל זה הוא לא הכרחי להעלות מספר דורות כדי לבצע את המסך, החוקר יכול לחסוך זמן ניכר, עבודה, ובמרחב באקווריום, אבל עדיין יש לו את הכוח לסקור מספר משמעותי של הגנום המבוסס על מספר נקבות F1 נבדק. לפיכך, מסכי הפלואידים הם ריאלי במיוחד עבור מעבדות קטנות או פרויקטים שיזמו בabsencדואר של מימון משמעותי. עם זאת, ישנן מספר מגבלות וחסרונות לשימוש בhaploids. ראשית, עוברי דג הזברה הפלואידים חיים רק כמה ימים, ובדרך כלל למות בין 3 ל 5 ימים לאחר הפריה (DPF) 15. ניתן להבחין בין עוברי דג הזברה הפלואידים מdiploids מבוסס על כמה מאפיינים, ובראשם להיות גוף נמוך ומוצק שיש מספר הנורמלי של מגזרי somite 15,17 בכל זאת. כמו פיתוח מתקדם, מיצגי המוח מוגברים מוות של תאים וזרימת הדם לקוי, מזוהים בדרך כלל עם איגום דם על ידי 2-3 DPF ובצקת 15,17. יתר על כן, haploids מצליח לנפח 15,17 שלפוחית ​​השחייה. ללא קשר להבדלים מורפולוגיים אלה, רוב האיברים ורקמות גדולים נוצרים, כולל הלב, עיניים, ו15,17 notochord. תכונה אחת שצוין על ציפורני הפלואידים הוא שהם מכילים מגוון של פנוטיפים במונחים של סוגים שונים של עוברים &amp; # פגומים8212; תכונה שנצפתה על פני זני דג הזברה. לפיכך, יש לוודא אם הרקמה (ים) ונקודת העניין בזמן להראות התפתחות תקינה באופן סביר במתח הפלואידים הסוג בר, ולכן יש לו את הפוטנציאל להיות מוערך על פגמים גנטיים במסך או פרויקט מחקר אחר. למרות אתגרים אלו, מסכי הפלואידים יושמו בהצלחה לזיהוי גנים הנדרשים לתהליכי התפתחות מוקדמים בדג הזברה, ופרוטוקולים הפלואידים כבר מבוססים היטב משאבים בקהילה במשך שנים רבות 15-19. לאחרונה, התהליך של יצירת עוברי דגים הפלואידים נוצל בעבר על ידי חוקרים כדי ליצור גזע עוברי הפלואידים (ES) בתרביות תאים מדגי medaka 20,21. לאחר הייצור של עוברי הפלואידים medaka חוץ גופייה, העוברים המשמשים לחישוב תרביות תאים ראשוניים שpassaged ל-15 שבועות ואחריו עוד 5-8 שבועות כדי ליצור שיבוטים טהורים של תאים הפלואידים עםמאפייני תא ES 15-19. הדור של שורות תאי דגים הפלואידים ES טומן בחובו הבטחת עתיד רחבה לניתוח פנוטיפים רצסיבי בשושלות תאים בעלי חוליות, ומייצג גישה חדשה לניתוח גנטי בשנים הקרובות. כך, הדור של עוברי דגים הפלואידים יש גובר יישומים בקהילת המחקר ביו. מאמר וידאו זה מספק הדגמה ויזואלית של השלבים כרוכים ביצירת עוברי דג הזברה הפלואידים במבחנה באמצעות זרע מומת UV המבוסס על פרוטוקולים הוקמו 15-19,22.

<table><tbody><tr><td>Hank&#039;s Stock Solution #1</td><td></td><td></td><td>8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Stock Solution #2</td><td></td><td></td><td>0.358 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt; anhydrous; 0.60 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Stock Solution #4</td><td></td><td></td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Stock Solution #5</td><td></td><td></td><td>1.23 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O in 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Premix</td><td></td><td></td><td>Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Stock Solution #6</td><td></td><td></td><td>0.35 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; in 10.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; make fresh on day of use.</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Final working solution</td><td></td><td></td><td>Combine 9.9 ml of Hank&#039;s Premix with 0.1 ml HS Stock #6</td></tr><tr><td>XX-Series UV Bench lamp</td><td>UVP</td><td>95-0042-05</td><td>Model XX-15S Bench Lamp</td></tr><tr><td>XX Bench Stand (Adjustable)</td><td>UVP</td><td>18-0062-01</td><td>Model XX-15 Stand</td></tr><tr><td>Embryo incubation dish</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 16.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10&lt;sup&gt;-5&lt;/sup&gt; M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Dilute 50 X E3 in distilled water</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000</td><td></td></tr></tbody></table>

production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization

דג הזברה הפכה מודל חוליות הזרם המרכזי שהוא רלוונטי לתחומים רבים של מחקר מדעי. דג הזברה מתאים במיוחד גם לניתוח גנטי קדימה של תהליכים התפתחותיים עקב ההפריה שלהם החיצונית, גודל עוברי, ontogeny המהיר, ובהירות אופטית - מערך של תכונות המאפשרות תצפית הישירה של אירועים החל gastrulation לorganogenesis עם סטראו בסיסי. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים לשרוד במשך כמה ימים במדינה הפלואידים. הייצור של עוברי הפלואידים במבחנה הוא כלי רב עוצמה לניתוח מוטאציות, כפי שהיא מאפשרת זיהוי של אללים מוטציה רצסיבית הנמצא בדור הראשון (F1) נושאות נשיות הבאות mutagenesis בדור ההורים (P). גישה זו מבטלת את הצורך להעלות את מספר דורות (F2, F3 וכו &#39;) הכולל רבייה של משפחות שעברו מוטציה, ובכך לחסוך הזמן חוקר יחד עם הפחתההצרכים למרחב דג הזברה מושבה, עבודה ועלויות גידול. למרות שהדג זברה שימשה לנהל קדימה מסכי בעשורים האחרונים, חלה הרחבה מתמדת של כלים לעריכה מהונדסים וגנום. כלים אלה עכשיו מציעים שפע של דרכים ליצירת מבחני ניואנסים למסכי דור הבאים שיכול לשמש כדי לנתח עוד יותר את רשתות הרגולציה גנים המניעים את חוליות ontogeny. כאן, אנו מתארים כיצד להכין עוברי דג הזברה הפלואידים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם למסכי רומן עתיד הפלואידים, כמו במסכים משפר ומדכאים, כדי לטפל במנגנונים של פיתוח למספר רחב של תהליכים ורקמות היוצרים בשלבים עובריים מוקדמים.

הייצור של עוברי הפלואידים ניתן ליישם כדי לזהות מוטציות רצסיבי בדור F2 כאשר haploids מתקבלים מנקבות דג הזברה בוגרות, כי הם הצאצאים של הורי mutagenized (איור 1). זה חוסך זמן ומרחב בהשוואה למסך דיפלואידי המסורתי, שבו חוקרים צריכים להעלות משפחות F2 שדיפלואידי צאצאים לאחר מכן העריכו לפנוטיפים של עניין (איור 1). השלבים העיקריים בפרוטוקול מתואר בשלבי 1-5 לעיל לקבלת עוברי הפלואידים דג הזברה באמצעות הפריה חוץ גופית הם schematized כתרשים זרימה (איור 2). צעדים אלו, כרוכים בהכנה של פתרונות ויחולו נשים על ידי חשיפה להורמונים זכריים בטנקי הזדווגות (יום 1), ואחריו זרע וביצית ורכש בהפריה חוץ גופית (יום 2), ולבסוף גידול של haploids (ימי 3-5) (איור 2). כאשר combined עם מסך גנטי, הליך mutagenesis נפוץ בדג הזברה כולל חשיפה קודמת של המבוגרים סוג בר דג הזברה הזכר לmutagen (למשל, לmutagen כימי כמו ENU, למרות שהליכים אחרים, כגון mutagenesis רטרווירלי מבוסס יכולים להיות מיושמים שגם להקל על שיבוט של פגם כרומוזומלי), ואחרי רבייה עם נקבות סוג בר ליצור דור F1 mutagenized. היערכות כזו דורשת מספר חודשים של עבודה (כ 6 חודשים) המבוססת על זמני הדור נזקקו לסוגים האחוריים פראיים, לבצע mutagenesis, ומאחור F1 15,17,22 mutagenized שלאחר מכן. נקודה חשובה נוספת לשיקול בהעסקת haploids למסך היא הבחירה של זן דג הזברה. זן AB * (כוכבית א.ב.) הפך ידוע להפקת עוברים הפלואידים עם מאפיינים טובים יותר כולל ובריאות יותר מאשר זנים אחרים 15. עם זאת, בזן טובינגן נגזר גידל בlaboraטורים, יש לנו לאחרונה נצפו תכונות עובריות שאפשרו מסכי מוצלחים עבור חריגות התפתחותית של מערכת הכליות (ג&#39;גרלך ור &#39;Wingert, לא פורסם). זכרים מתח למבוגרים דג הזברה טובינגן היו mutagenized על ידי סדרה של שלושה טיפולי ENU, ולאחר מכן עברו לנקבות טובינגן סוג בר לייצר דור F1 להקרנה. נקבות F1 נדחקו כדי להשיג ביצים וביצי F2 אלה הופרו בזרע UV מומת. בהשוואה לציפורני דיפלואידי מתקבלות על ידי הזדווגויות טבעיות של הורים מסוג בר טובינגן (איור 3 א), עובר בציפורני מתח אלה הפלואידים טובינגן מוצג אופייני קצר יותר, מוצק תא מטען של המדינה הפלואידים (3B דמויות, C). יתר על כן, ציפורניים הפלואידים בדרך כלל מורכבת של אחים עובר המציגים מגוון רחב של פגמים, שבו צפה, כמו גם (3B דמויות, C), אשר ידוע להשתנות בתוך זנים, כפי שנדון בהמשך 15,17. </p&gt; מחקרים קודמים קבעו שורה לדירוג הקנונים, המקביל לכיתות א &#39;עד ד&#39;, לסווג את מגוון רחב של פגמים פנוטיפ הפלואידים 15,17, ובנוסף haploids יש גם מכונה במונחים של התארים באיכות טובה, בינונית וגרועה 22. haploids כיתה, המקביל ל haploids באיכות גבוהה, הם הכי נורמלי במראה, עם גוף קצר ומוצק אבל בסך הכל מראה מראה מורפולוגיים דומה לdiploids 15,17,22 (השווה אחים דיפלואידי (ד) לכיתה הפלואידים (שכותרתו א) אחים, איור 3 ב). עוברי כיתה הפלואידים גם לפתח בצקת קרום הלב צנועה, אשר היא תכונה אופיינית של פיתוח דג הזברה הפלואידים 15,17,22 (איור 3 ב). בהשוואה לhaploids כיתה, עוברי הפלואידים כיתה ב &#39;ביניים או מה שנקרא (ב שכותרתו, דמויות 3B, C) ​​נבדל ביניהם בפיתוח של עוד קיצר או מפותל / twisתא מטען טד, אם כי תכונות של ראש וזנב הם באופן ברור 15,17,22 להבחין. לבסוף, haploids C כיתה או באיכות ירודה (גם מופיע בכמה הפניות כמו C / D) 15,17,22 מאוד פגומים ולהציג המוני מאורגנת של תאים בהתאחדות עם חלמון כדור (C שכותרת, איור 3 ג). גם בקרב אותו הזן, מצמדים הפלואידים להשתנות בחלוקת פנוטיפים A, B, ו-C שאחד לא רואה. למשל, המצמד הפלואידים מנקבה אחת טובינגן מוצג התפתחות טובה יותר בסך הכל, עם בעיקר וצאצאים הפלואידים רמת B (איור 3 ב) בהשוואה לhaploids מתקבל מנשי טובינגן שנייה, המצמד שכן היה מורכב מצאצאים הפלואידים C כיתה רבים ופנוטיפים B הפלואידים (איור 3 ג). השתנות זן דומות של ציוני עובר הפלואידים כבר נצפו בעבר בדגי זן AB ו AB * כמו גם 15. למרות מור אלההבדלי phological, organogenesis של מבנים רבים ממשיך יחסית בדרך כלל בעובר הפלואידים. אמנם יש להם תא מטען, פיתוח גוף קצר יותר של איברים כמו העיניים ולב הוא יחסית דומה לזה של עוברי דיפלואידי סוג בר, והוא יכול גם להעריך סוגי תאים כמו תאי פיגמנט (melanophores וxanthophores) 15. בנוסף, יש לנו תיעדנו לאחרונה כי הכליה ראשית, או בכליות עוברית, שפותחה על ידי ביום 1 לאחר הפריה בהפלואידים הסוג בר, בדומה לdiploids סוג בר. כראיה לכך, דפוסים סוג תא כליה ראשית מציג את הדפוס הטיפוסי של מגזרים (איור 4). יתר על כן, את הפנוטיפ של מוטציות רצסיבי שמשנות את התפתחות כליה ראשית, כמו המוטציה lib שמפחיתה את ייצור חומצה רטינואית, הראה דפוס דומה במדינה הפלואידים בהשוואה למצב דיפלואידי (איור 4) 23,24. תצפית זו עולה בקנה אחד עם זה של reces האחרsive מוטציות המובילות לפנוטיפים דומים בשני תנאי הפלואידים ודיפלואידי, אם כי זה לא תמיד מקרה עם כל המוטציות וצריך לזכור אם הערכת סוג זה של אסטרטגית מסך 15. מספר הרקמות והאיברים הם בדרך כלל לא נורמלים בhaploids. לדוגמא, haploids להציג פגמים במחזור, בדרך כלל מציגים איגום דם, מה שעשוי להפוך את היכולת שלהם ללמוד כמה היבטים של vasculogenesis מוגבלת 15. בנוסף, זה כבר ציין כי haploids יכול להיות אי סדרים בהתפתחות אוזן, כזה שהם יכולים להיות מוערכים על מוטציות המונעות היווצרות שלפוחית ​​otic לגמרי, אבל לא למוטציות המשפיעות על תהליכים עדינים מעורבים עם המורפוגנזה של מבנה זה 15. כדוגמא נוספת לזה, המורפוגנזה המוח היא חריגה בhaploids, ולכן מסכים הפלואידים לזהות מסלולי התפתחות המוח הנדרשים מוגבל 15. למרות מגבלות אלה, שלנוnalysis של התפתחות כליה במדינה הפלואידים (איור 4) מוסיף איבר זה לרשימה של מבנים עובריים &#39;screenable&#39;. ממצא זה מדגיש כי המתודולוגיה מסך הפלואידים יכולה לשמש גם כדי לנתח את המרכיבים הגנטיים של דפוסים אב כליות ומוסיפה דגש לסנטימנט שגישות מסך גאוני יכולות לעקוף את המגבלות של ontogeny עובר הפלואידים לחשוף דגמי מוטציה חדשים יקרים ללמוד פיתוח חוליות 15. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. סכמטי של אסטרטגיות מסך דיפלואידי והפלואידים במודל דג הזברה. בעקבות mutagenesis של דור ההורים, דור F1 יכול להיות מורם ומשמש גם ליצירת משפחות המוטציה F2 המשמשים מסך דור F3 במצב דיפלואידי (משמאל ) או ישירות מסךאד באסטרטגיה הפלואידים (מימין). במסך הפלואידים, נקבות דור F1 לבגרות מינית הם משמשים לאיסוף ציפורני F2 הפלואידים לניתוח גנטי. נשאים הטרוזיגוטיים נקבה מזוהים אם כמחצית מhaploids F2 להציג פנוטיפ מוטנטי (עוברים אדומים) בהשוואה לאחי הסוג בר הפלואידים (עוברים צהובים). <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig2highres.jpg" width="400" /> תרשים זרימת איור 2. הפלואידים עובר ייצור. השלבים העיקריים של הפריה במבחנה כדי לייצר עוברי הפלואידים הם schematized כמשימות שבוצעו ביום 1 (תיבות הוורודות) כדי להכין פתרונות זרע ומבוגר ראש נקבות, משימות שבוצעו על דג הזברה 2 (קופסות כתומות היום ) לאסוף וזרע להשבית UV, לאסוף ביצים, כדי להפרות את הביצים עם זרע UV מומת ליצור haploids, ולאחר מכן להחיות את הנקבה האם, וfinallמשימות y בוצעו בימים שלאחר מכן 3-5 (תיבה צהובה) כאשר הציפורניים מודגרת לנקודה הרצויה בזמן (ות) עבור התבוננות וניתוח. <img alt="איור 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig3highres.jpg" width="300" /> איור 3. השוואה של עוברי דג הזברה זן דיפלואידי והפלואידים טובינגן. א) עובר סוג בר דיפלואידי יוצרו על ידי השרצה טבעית ולאחר מכן הודגרו עד כ 30 hpf. B, עובר סוג בר C) הפלואידים יוצרו על ידי הפריה חוץ גופית של ציפורניים המתקבלות מנקבות mutagenized דור F1 עם זרע מומת UV, וטופחו עד כ 30 hpf. Haploids הציג מגוון רחב של הפרעות בהתפתחות בהשוואה לעוברי דיפלואידי סוג בר (ראשי חץ שחורים, ד כדי לציין דיפלואידי). היה לי haploids הנורמלי יחסית קיצרתי, הגוף של המניה יותר דומה לתכנית לדירוג של15 הפלואידים (ראשי חץ אדומים, שכותרתו), ואילו haploids עם מומים גולמי הציג ציר קשה קטוע גוף (ראשי חץ סגולים, ב &#39;שכותרתו) מקביל לכיתה של ב&#39;, ולבסוף C כיתה (ראשי חץ כחולים, C שכותרתו) המבוסס על תיאורים שפורסמו 15. כל העוברים צולמו בשידור חי בהגדלת 2.5x. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. דפוסים התפתחותית של סוגי תאים המרכיבים את האיברים כליות עובריים הכליה ראשית בדג זברת מתח טובינגן הפלואידים. סוגים הפלואידים פראיים מוצג דפוס נורמלי של סוגי תאים במבנה העוברי הכליות (שורה העליונה). הכליה העוברית מורכבת של זוג יחידות תפקודיות מפולחות הידועה בשם nephrons. הדפוס המפולח של סוגי תאים בדידים הווה בnephrons ניתן דמיינו מבוסס על ההר השלם <eמ&gt; בדפוס ביטוי הכלאה באתרו של תעתיקי גנים שהנם ייחודיים לסוגי תאי נפרון מבודלים, הכוללים podocytes (P) בסימן wt1b וnephrin, אבובית הפרוקסימלי המפותלת (PCT) בסימן slc20a1a, אבובית ישר פרוקסימלי (PST ) מסומן על ידי trpm7, דיסטלי מוקדם (DE) בסימן slc12a1, ואבובית סוף דיסטלי (DL) בסימן slc12a3. עוברי lib הפלואידים מוטציה (podocytes תצוגה בשורה התחתונה) מופחת, PCT וPST נעדר, יחד עם DE מורחב וקטע DL, בדומה לעוברי lib דיפלואידי 18. עוברים צולמו בתצוגת הגבי, עם קדמי בצד השמאל, בהגדלת 10X.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization at JoVE.com

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

24.5K Views.  University of Notre Dame. The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Video: Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genetics

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Developmental Biology

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video