פיתוח מודל חולדות להפרעה דו קוטבית

מאמר זה מציג פרוטוקול לאינדוקציה של מודל עכברוש ייחודי של הפרעה דו קוטבית הלוכד התנהגות דמוית מאניה ודיכאון.

הפרעה דו קוטבית היא מצב נפשי המאופיין בתנודות קיצוניות במצב הרוח, כולל תקופות של שיאים רגשיים (מאניה) ושפל (דיכאון). בעוד שהנוירוביולוגיה המדויקת הבסיסית עדיין לא מובנת במלואה, נראה כי חוסר איזון במערכות נוירוטרנסמיטורים, במיוחד דופמין, ממלא תפקיד מרכזי. מסיבה זו, נעשה שימוש במניפולציות של מסלולים דופמינרגיים למודל מאניה או דיכאון במכרסמים. עם זאת, מודלים המייצגים במדויק את המעבר האופייני בין שני הפרקים הללו הם נדירים, ומגבילים את תוקף הפנים. במודל ייחודי משתמשים בטכניקות מודרניות להגברה זמנית של ביטוי קולטן דופמין D1, אשר היה מעורב בפתולוגיה של הפרעה דו קוטבית. מבנה לנטי-ויראלי המושרה על ידי טטרציקלין המבטא את קולטן הדופמין D1 בשליטת מקדם האלפא קלמודולין קינאז II מוזרק באופן סטריאוטקטי לקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של חולדות בוגרות. ביטוי יתר של קולטן דופמין D1 מושג על ידי הוספת דוקסיציקלין אנלוגי טטרציקלין למי השתייה של בעלי החיים, מה שמוביל לעלייה בהתנהגויות הקשורות לתגמול, אימפולסיביות ולקיחת סיכונים ולירידה בחרדה. התנהגויות אלה דומות לפנוטיפ דמוי מאניה. על ידי הוצאת דוקסיציקלין ממי השתייה, ניתן לגרום לפנוטיפ דמוי דיכאון, המאופיין בחוסר אונים מוגבר ואנהדוניה, בתוך אותה חיה. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע הניתוח, כמו גם נהלים להשראת פנוטיפ דמוי הפרעה דו קוטבית. בנוסף, מתוארים שיקולים להערכת שינויים התנהגותיים הקשורים להתנהגות דמוית מאניה ודיכאון. מודל מבטיח זה, המדגים מבנה טוב ותוקף פנים, מציע כלי רב ערך להמשך חקירה של המנגנונים הפתופיזיולוגיים של הפרעה דו קוטבית.

הפרעה דו קוטבית (BD) היא הפרעת מצב רוח חמורה המשפיעה על כ-1% מאוכלוסיית העולם¹. הוא מאופיין באפיזודות של מצב רוח קיצוני, דיכאון ומאניה, לצד מצבים אותימיים. תסמינים של אפיזודות דיכאון ב-BD דומים לאלה של דיכאון חד קוטבי. מטופלים מראים עניין והנאה מופחתים בפעילויות ותחושות של עצב, חוסר תקווה וחוסר ערך. בנוסף, לעתים קרובות ניתן להבחין בשינויים בתיאבון, בהתנהגות השינה, כמו גם בליקויים קוגניטיביים². אפיזודות מאניות מאופיינות במצב רוח מוגבר באופן חריג, ירידה בצורך בשינה, חוסר עכבות חברתיות, הערכה עצמית מוגברת ותחושות גרנדיוזיות, כמו גם לקיחת סיכונים ועצבנות מוגברת².

נראה כי אטיולוגיה של המחלה היא משחק גומלין מורכב של גורמים גנטיים והתפתחותיים³, אך המנגנונים המדויקים המעורבים בפתופיזיולוגיה שלה עדיין אינם מובנים במלואם. סבורים כי התסמינים נובעים מחוסר איזון במערכות נוירוטרנסמיטורים⁴ ובמיוחד מחקרים המתמקדים במערכת הדופמין השפיעו⁵. לדוגמה, ברק ואחרים.6 הניחו את השערת הדופמין, בהנחה שמצב היפרדופמינרגי עומד בבסיס המאניה, בעוד שדיכאון נובע מהיפודופמינרגיה. מאז, עדויות ממודלים של בעלי חיים, כמו גם מחקרים פרמקולוגיים והדמיה, אספו תמיכה חזקה לקשר בין תסמינים מאניים להיפרדופמינרגיה. כמו כן, ניתן למצוא קשר בין ירידה באיתות דופמינרגי לאפיזודות דיכאון, אם כי במידה פחותה⁷. בנוסף, תוצאות מחקירות גנטיות חיזקו את הרעיון של השערת דופמין של BD⁸.

כדי לשפוך אור נוסף על תפקידה של מערכת הדופמין ב-BD, ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את המנגנונים הנוירוביולוגיים העומדים בבסיס הסימפטומים. יישומים ומגבלות של מודלים של מחלות מוערכים לעתים קרובות על סמך שלושה קריטריוני אימות, שהוצעו במקור על ידי וילנר⁹. אלה כוללים תוקף פנים, מבנה וחיזוי. תוקף פנים מתאר את יכולתו של המודל לחקות את המאפיינים ההתנהגותיים של ההפרעה. תוקף המבנה מושג כאשר הפתופיזיולוגיה והאטיולוגיה של ההפרעה הם הבסיס למודל, בעוד שתוקף ניבוי מרמז על כך שניתן לשחזר טיפול תרופתי בהפרעה בתוך המודל.

עד כה, מודלים שונים של מכרסמים תרמו להבנת BD¹⁰ וכוללים מגוון רחב של שינויים גנטיים, התערבויות תרופתיות, כמו גם מניפולציות סביבתיות¹¹.

מניפולציות ניסיוניות של גן השעון , למשל, הוכחו כגורמות לפנוטיפ דמוי מאניה בעכברים. גורם השעתוק CLOCK ממלא תפקיד חשוב בוויסות השעון הביולוגי, ועכברים מהונדסים גנטית, המבטאים חלבון שאינו יכול להפעיל את שעתוק השעון, מאופיינים בהיפראקטיביות ובתגובות תגמול מוגברות¹². נראה כי הפנוטיפ המתקבל מתווך על ידי גנים מווסתים באופן דיפרנציאלי לאיתות דופמינרגי באזור הגחון של המוח¹³.

השפעה ישירה על איתות הדופמין באמצעות מתן תרופות מגבירות דופמין, כגון הפסיכוסטימולנט אמפטמין, הוכחה כמעוררת תנועת יתר, ונסיגה לאחר מכן נקשרה לתסמינים דמויי דיכאון, כולל אנהדוניה¹⁴. אתגרים פרמקולוגיים עם קטמין או קולטן דופמין D2/D3 אגוניסט קווינפירול הוכחו גם כגורמים להתנהגות רלוונטית ל-BD^15,16.

בנוסף להתערבות תרופתית, ניתן להשתמש במניפולציות של הסביבה, כגון מניעת שינה, כדי לגרום לפנוטיפים התנהגותיים הרלוונטיים ל-BD¹⁷. בעלי חיים חסרי שינה מראים פנוטיפ דמוי מאניה המאופיין בתנועה מוגברת ופליטה של קולות קוליים הקשורים לשינויים באיתות דופמין¹⁸.

ישנם מודלים רבים אחרים של מכרסמים לחקר התנהגות דיכאונית¹⁹ או דמוית^{מאניה 20} . עם זאת, בעוד שכל המודלים הללו תרמו רבות להבנת הפתולוגיה של BD, הם מוגבלים על ידי חקר אפיזודה אחת בלבד בכל פעם או השפעות קצרות טווח. לעומת זאת, מידול המעבר האופייני בין מצבים רגשיים היה קשה להשגה.

כאן מוצג פרוטוקול למודל חולדה ייחודי ל-BD. הוא מדגים תוקף פנים מוגבר על ידי השראת שני האפיזודות בבעל חיים אחד באמצעות מניפולציה ממוקדת אחת של מערכת הדופמין, כלומר, ביטוי יתר מותנה של קולטן הדופמין D1 (DRD1) בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ממבנה לנטי-ויראלי המושרה על ידי טטרציקלין. על ידי הנעת שעתוק גנים תחת שליטת מקדם הקלמודולין קינאז II אלפא (CamKIIa), DRD1 מתבטא בעיקר בתאי עצב גלוטמטרגיים, ובכך מגדיל את הספציפיות של המניפולציה הגנטית.

עמוד השדרה המקורי של lentivirus pRRL.cPPT.WPRE.Sin סופק על ידי ד"ר דידייה טרונו (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland)²¹ ושונה על ידי החלפת המיניגן GFP באתר פולילינקר (וקטור lentivirus PL13). PL13 שימש אז לייצור PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 או PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3. ה-cDNA של החולדה DRD1 התקבל מד"ר דיוויד סיבלי (NINDS/NIH)²², וה-cDNA המפעיל ההפוך הנשלט על ידי טטרציקלין 3 (rtTA3) מד"ר אצה דאס ובן ברקהוט (המרכז הרפואי האקדמי, אוניברסיטת אמסטרדם)²³. ה-DNA של מקדם CamKIIa סופק על ידי ד"ר קארל דיסרוט (אוניברסיטת סטנפורד, קליפורניה), ורצפי dsRedExpress ואלמנט התגובה הטטרציקלין 2 (pTRE2) שובטו מפלסמידים פנימיים pcDNA3.1-dsRedExpress ו-pcDNA3.1-pTRE2, בהתאמה. וקטורים נגיפיים נוצרו על ידי תת-שיבוט של רצפי DNA מוגברים ב-PCR המוקפים באתרי הגבלה.

המודל המשתמש בווקטור ויראלי זה הוכיח כי ביטוי יתר של DRD1 בתאי עצב חיוביים ל-mPFC CamKIIa מוביל לפנוטיפ דמוי מאניה^24,25, בעוד שהפחתת הוויסות של ביטוי הגנים לאחר מכן גורמת להתנהגות דמוית דיכאון²⁶. מכיוון שניתן להשרות את הפנוטיפ דמוי המחלה שוב ושוב בבעל חיים אחד²⁷, המודל משקף רמה גבוהה של תוקף פנים. בנוסף, מניפולציות של מערכת הדופמין מחזיקות בתוקף קונסטרוקטיבי חזק עבור מודלים של בעלי חיים של BD⁷, שכן שינויים ברמות DRD1^28,29 או פולימורפיזמים של DRD1 נקשרו לפתולוגיה של BD 30,31,32.

מחקרים אחרים בבעלי חיים הובילו גם להבנה מוגברת של התפקודים של DRD1 הקדם-מצחי. לדוגמה, ירידה ב-DRD1 הייתה ממצא עקבי במודלים של דיכאון^33,34, בעוד שגירוי אופטוגנטי של DRD1 בתאי עצב גלוטמטרגיים mPFC מפחית חרדה וגורם להשפעות נוגדות דיכאון³⁵. בפרסום שפורסם לאחרונה על ידי Wu et ^al.36, הוכח תפקידו של mPFC DRD1 במעברי מצב רגשי. מחקר זה מדגיש כי קולטנים אלה חיוניים לשינויים בסיסיים בפלסטיות הסינפסה המעוררת.

בסך הכל, שימוש במודל חולדה של BD המורכב ממניפולציה ממוקדת ומותנית של DRD1 בתאי עצב חיוביים ל-CamKIIa של ה-mPFC מהווה מערכת מודל עם תוקף מבנה ופנים גבוה, ולכן מציגה פוטנציאל חזק למחקר תרגומי על BD.

להלן מתוארים הליכים כירורגיים ליצירת מודלים. בנוסף, יוצגו שיקולים מתודולוגיים לאינדוקציה של מודלים והערכות התנהגותיות לצד תוצאות מייצגות של הפנוטיפ דמוי המחלה המתקבל. נדונים מכשולים אפשריים וגורמים משפיעים ביצירת מודלים והערכה התנהגותית, וניתנת תחזית לכיוונים עתידיים.

הפרוטוקול להזרקה סטריאוטקטית המתואר כאן אושר על ידי ה-LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Northrhine-Westfalia, Germany). נעשה שימוש בחולדות ספראג דולי זכרים בוגרים (350-650 גרם משקל גוף). הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. המבנים הלנטי-ויראלים

הערה: מערכת לנטי-ויראלית מהדור השלישי משמשת לביטוי מותנה של DRD1 או חלבון פלואורסצנטי אדום (dsRed) כמצב בקרה^25,27.

1. לייצר את ה-lentivirus על סמך הפרוטוקול של Stewart et ^al.37 עם אריזות פלסמידים 8454 ו-8455 ממאגר Addgene.
   הערה: אם ייצור הנגיף אינו מתוכנן באופן עצמאי, מתקני ליבה רבים מספקים וירוס בעל טיטר גבוה, כגון Charité Berlin, גרמניה.
2. טיטר וירוסים מרוכזים ואחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
3. הכן 2 × 10⁷ יחידות מתמר (TU) למיקרוליטר להזרקות.
4. הובלת וירוסים לחדר הניתוח על קרח יבש.

2. בעלי חיים

הערה: מודל החולדות ל-BD הוקם בחולדות Sprague Dawley זכרים בוגרים (350-650 גרם משקל גוף). לצורך חקירה של חולדות נקבות או נקודות זמן התפתחותיות מוקדמות יותר, חיוני לקחת בחשבון שביטוי של DRD1 בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית משתנה במהלך ההתפתחות ויכול להיות מושפע ממחזור הייחום 38,39,40.

1. חולדות זוג עם בעלי חיים באותו מצב עם מזון ומים אד ליביטום בתנאי טמפרטורה ולחות קבועים (45%-65% לחות יחסית, טמפרטורה 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס).
2. שמור על חולדות במחזור אור-חושך הפוך של 12 שעות (האורות כבויים בשעה 11 בבוקר), מכיוון שיש לבצע חקירה התנהגותית בשלב הפעיל של בעלי החיים בחושך.
3. תנו לבעלי החיים לפחות שבעה ימים להתאקלם במתקן ובטיפול על ידי הנסיינים לפני תחילת הניסויים.

3. הזרקה סטריאוטקטית של המבנה הנגיפי

הערה: בצע ניתוח מתחת למכסה בטיחות (אמצעי זהירות לעבודה עם lentivirus) ותנאים אספטיים.

1. הכנה
   1. ודא שכל החומרים הדרושים זמינים ופונקציונליים (טבלת חומרים).
   2. הגדר את המסגרת הסטריאוטקטית כשמחזיק המזרק מחובר לזרוע הסטריאוטקטית. חבר את מחזיק המזרק למשאבת המזרק.
   3. הגדר את המקדחה הדנטלית והרכיב קוצים של 0.9 מ"מ.
   4. הניחו את כרית החימום והגדירו אותה ל-37 מעלות צלזיוס. הרם את כרית החימום לגובה מתאים למיקום קל יותר של החולדה.
   5. מכסים את כרית החימום בווילון סופג.
   6. הכן מכשירים כירורגיים חיטוי על משטח סטרילי.
   7. התקן מזרק הזרקה סטריאוטקסי של 10 מיקרוליטר עם מחט הזרקה של 33 גרם למחזיק המזרק.
   8. משוך 2.3 מיקרוליטר של תרחיף ויראלי לזריקות דו-צדדיות של 1 מיקרוליטר כל אחת. אשר חזותית את הנסיגה המוצלחת. הקפד לבצע שלב זה כשלב ההכנה האחרון כדי למזער את הזמן שלוקח לנגיף הלנטי להיות בטמפרטורת החדר.
2. שיכוך כאבים ואינדוקציה להרדמה
   1. בבוקר הניתוח, יש לתת מלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, p.o).
   2. עשרים דקות לפני תחילת ההליכים הכירורגיים לשיכוך כאבים, יש להזריק לחולדה בופרנורפין (0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, s.c).
   3. הפעל את מכונת ההרדמה עם זרימת חמצן של 0.8-1 ליטר לדקה.
   4. הציפו את תא האינדוקציה ב-4% איזופלורן והניחו את החולדה בתא האינדוקציה.
   5. לאחר אינדוקציה מוצלחת של הרדמה, הנראית לעין על ידי נשימה מואטת ואובדן הכרה, הוציאו את החולדה מתא האינדוקציה והעבירו אותה למסגרת הסטריאוטקטית.
3. מיקום החולדה
   1. ודא שזרימת ההרדמה מועברת למסכת האף.
   2. העבירו את החולדה מתא האינדוקציה למסגרת הסטריאוטקטית, והניחו את שיניה הקדמיות במחזיק.
   3. הנח כראוי את מסכת ההרדמה על האף וסובב את האיזופלורן ל-1.5-2.3% לצורך תחזוקה.
   4. יש להגן על העיניים באמצעות קרם עיניים סטרילי.
   5. לפחות 10 דקות לפני ביצוע חתך כלשהו, יש להזריק לחולדה לידוקאין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף, s.c) ישירות מתחת לאתר החתך המתוכנן.
   6. אבטח את החולדה במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מוטות אוזניים. ודא שמוטות האוזניים אחידים ובתנוחת ראש ישרה.
   7. חתוך פרווה סביב אתר החתך בעזרת מספריים. הסר חתיכות פרווה באמצעות כרית תאית לחה בחומר חיטוי לעור.
   8. חיטוי השדה הניתוחי באמצעות חומר חיטוי לעור.
4. קרניוטומיה והזרקת מבנה ויראלי
   1. הקפידו על הרדמה נכונה על ידי בדיקת היעדר רפלקס הבוהן.
   2. חיטוי ידיים ומעבר לכפפות סטריליות לפני נגיעה בציוד כלשהו.
   3. בצע חתך מדיאלי קטן (~1.5 ס"מ) באמצעות להב אזמל.
   4. אבטח גישה לשדה הניתוחי על ידי דחיפת העור לצדדים בעזרת מלחציים של בולדוג.
   5. נקה את שדה הניתוח מדם ורקמות שנותרו באמצעות החלפות סטריליות. הקפידו על ראייה נכונה של הברגמה ומרווח קדמי מספיק.
   6. הגדר את קואורדינטות A/P ו-M/L לאפס בהתבסס על ברגמה.
   7. הזיזו את הזרוע הסטריאוטקטית לקואורדינטות A/P + 2.7 ו-M/L ± 0.4 ודמיינו באמצעות עיפרון מחוטא.
   8. קדחו חור בקוטר ~1 מ"מ, המכסה את דפנות ההזרקה לשתי ההמיספרות.
   9. הסר כל דם באמצעות החלפה סטרילית.
   10. הגדירו את קואורדינטות D/V לאפס על פני השטח של המוח והורידו לאט את מחט ההזרקה ל-2.8- כדי להזריק לאזור הקדם-לימבי של קליפת המוח הקדם-מצחית.
   11. המתן 5 דקות כדי לאפשר הרפיה של הרקמה.
   12. הזרקו 1 מיקרוליטר של תרחיף ויראלי בקצב של 0.1 מיקרוליטר לדקה.
   13. אפשר 5 דקות לספיגה לפני הסרה איטית של המחט.
   14. חזור על ההזרקה בחצי הכדור השני.
5. סגירה וטיפול לאחר ניתוח
   1. הסר את המחט וסגור את הפתח בגולגולת באמצעות שעוות עצם.
   2. הסר את מהדקי הבולדוג ותפור את העור (3-0 תפר כירורגי).
   3. יש להזריק לחולדה מלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג, s.c.) לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.
   4. כבו את ההרדמה, הוציאו את החיה מהמסגרת הסטריאוטקטית והכניסו אותה לכלוב הביתי שלה. ודא שהחולדה מתעוררת לחלוטין.
   5. שטפו את המזרק ב-100% אתנול כדי לנטרל את ה-lentivirus שנותר, ולאחר מכן H₂O מזוקק כהכנה לזריקה הבאה.
   6. בצע משככי כאבים לאחר הניתוח עם מלוקסיקם (1 מ"ג/ק"ג, p.o.) כל 24 שעות במשך 3 ימים ודרג את מצב בריאות בעלי החיים למשך שבוע אחד.
   7. חיות בית בודדות במשך 24 השעות הראשונות לאחר הניתוח כדי למנוע מאחרים להתעסק עם התפרים. החזירו אותם עם חבריהם לכלוב לאחר מכן.

4. טיפול בדוקסיציקלין לאינדוקציה של מודל

הערה: התחל באינדוקציה של הדגם כבר 24 שעות לאחר ההזרקה. ניתן גם להמתין פרקי זמן ארוכים יותר בין הזרקה לזירוז של עד מספר חודשים, למשל, כדי לבדוק קבוצות גדולות יותר של בעלי חיים בו זמנית. זה הוכח כלא משפיע על הפונקציונליות של המבנה הנגיפי.

1. אינדוקציה של אפיזודה דמוית מאניה
   1. כדי לגרום לפנוטיפ דמוי מאניה, תן לבעלי חיים 0.5 גרם/ליטר דוקסיציקלין היקלט על ידי הוספתו למי השתייה. זה גורם לשעתוק ויראלי ולביטוי יתר של DRD1 נוסף.
   2. הכינו את המים המכילים דוקסיציקלין טריים כל 48 שעות עד 72 שעות, פרק זמן שבו יציבות הדוקסיציקלין אינה מושפעת, אפילו בבקבוקי מים לא אטומים⁴¹.
      הערה: לאחר טיפול בדוקסיציקלין במשך שבעה ימים, ביטוי יתר בתיווך הנגיף יגיע למקסימום, וניתן לבצע חקירה התנהגותית במהלך האפיזודה דמוית המאניה.
2. אינדוקציה של אפיזודה דמוית דיכאון
   1. החזירו את בעלי החיים למי שתייה רגילים, כדי לגרום לאפיזודה דמוית דיכאון.
   2. המתן 4 ימים עד שהשעתוק הנגיפי ייפסק, ולאחר מכן בצע הערכה התנהגותית של האפיזודה דמוית הדיכאון.
   3. בצע זירוזי אפיזודה עוקבים לפי אותו דפוס.

5. הערכה התנהגותית

הערה: בעקבות אינדוקציה של מודל, ניתן להעריך התנהגות דמוית דו קוטבית. הוצעו מסגרות שונות של תרגום מתסמינים קליניים לדפוסי התנהגות הנצפים במכרסמים. אחד המשפיעים ביותר הוא קריטריון⁴² בתחום המחקר, שבו נבחנים שינויים בתחומי התפקוד וההתנהגות, שעשויים להיות מושפעים בהפרעות פסיכיאטריות. עם זאת, חשוב לציין כי בשל מחסום המינים, לא ניתן לחקור תסמינים מסוימים, למשל אובדנות, במכרסמים⁴³. בגלל היכולות הקוגניטיביות והרגשיות המתקדמות שלהם, למודלים של חולדות יש פוטנציאל חזק במיוחד להערכת סימפטומים תרגומיים,^מה שמאפשר הליכי בדיקה מורכבים יותר. שיקולים להערכה התנהגותית מתוארים בטבלה 1.

1. תכנן חקירה התנהגותית כסוללה של מבחנים התנהגותיים⁴⁵, כדי לספק תמונה מקיפה של הפנוטיפ המתקבל.
2. שימו לב לביצוע בדיקות פולשניות יותר אחרונות.
3. קחו בחשבון שינויים בהתנהגות שעשויים לנבוע מניסיון ניסויים קודמים כאשר מנסים לבחון חיה אחת בשני האפיזודות דמויות המחלה.
   הערה: בהתאם לשאלה שעל הפרק, זה יכול להיות מועיל לבדוק קבוצות שונות של חולדות במהלך האפיזודה המאניה או הדיכאונית, מה שיאפשר גם איסוף רקמות במהלך האפיזודה המתאימה. הניסיון הראה שבדיקת בעלי חיים נאיביים מבחינה התנהגותית יכולה לגרום לפנוטיפ בולט יותר במבחנים התנהגותיים מסוימים.
4. כמו כן, קחו בחשבון גורמים אחרים כמו תנאי דיור⁴⁶ או מין הנסיין⁴⁷.
5. לאמץ את כל האמצעים האפשריים להפחתת לחץ לא מכוון על בעלי החיים, לא רק לרווחת בעלי החיים, אלא גם לשלול אינטראקציות אפשריות של פנוטיפים פסיכיאטריים עם מתח⁴⁸.
6. שימו לב במיוחד לשעון הביולוגי, שכן שיבושים בשעון הביולוגי הם סימפטום של BD¹⁷. מכיוון שהחולדות פעילות ביותר בשעות בין הערביים והזריחה, יש לבדוק באור אדום עמום עם בעלי חיים השוכנים תחת מחזור אור-חושך הפוך⁴⁹.
   הערה: רוב התוצאות המייצגות המוצגות כאן נאספו בהתאם לגישה זו. עם זאת, עדיין ניתן להבחין בפנוטיפ דמוי מחלה אם מבוצעת הערכה התנהגותית מבלי לשנות את מחזור היום-לילה של בעלי החיים²⁷.
7. רשום תמיד מראש את הניסוי ובצע ותאר בהתאם להנחיות PREPARE⁵⁰ ו-ARRIVE⁵¹ .

כאשר מוסיפים דוקסיציקלין למי השתייה של החיות, יתבטא DRD1 נוסף, ולאחר 7 ימים, יהיה ביטוי יתר מספיק כדי לבדוק את החיה להתנהגות דמוית מאניה. עד כה הודגמה עלייה בהתנהגויות הקשורות לתגמול. בעלי חיים דמויי מאניה שותים יותר תמיסת סוכרוז ביחס למים במבחן בחירה של שני בקבוקים בהשוואה לביקורת²⁵. כאשר מכניסים אותם לתיבת תצפית עם נקבה קולטת ונצפים במשך 25 דקות, חיות דמויות מאניה מראות יותר הרכבות מיניות בהשוואה לקבוצת ביקורת²⁷ (איור 1A). בפרדיגמה של ניהול עצמי של קוקאין, הם נותנים יותר קוקאין תחת לוח זמנים של יחס קבוע ומראים נקודת שבירה גבוהה יותר בלוח זמנים של יחס פרוגרסיבי. עקומת המינון-תגובה שלהם מוסטת לכיוון רגישות גבוהה יותר למינונים נמוכים²⁵. שינוי זה ברגישות נצפה גם בבולטות מוטיבציונית מוגברת במספר פרדיגמות התניה של מקום. בעלי חיים דמויי מאניה בילו יותר זמן בצדדים המותנים לניקוטין, אלכוהול וקוקאין בהשוואה לקבוצת הביקורת²⁵. חיפוש חידושים מוגבר ובחירות אימפולסיביות יותר במבחן מבוסס מבוך T על הנחה מושהית נמצאו גם²⁵. בגרסת חולדה אופרנטית של מטלת ההימורים באיווה, חיות דמויות מאניה מחליטות לעתים קרובות יותר עבור הבחירות השליליות (סיכון גבוה, רווח גבוה) בהשוואה לקבוצת הביקורת²⁴ (איור 1B). החרדה אצל בעלי חיים דמויי מאניה מופחתת, כפי שמעיד זמן רב יותר על הזרועות הפתוחות במבוך המוגבה פלוס²⁵.

ניתן לגרום לפנוטיפ דמוי דיכאון על ידי הפסקת ביטוי יתר של DRD1. באפיזודה דמוית דיכאון, ניתן היה להבחין בעלייה בחוסר האונים. בפרדיגמה משולשת של חוסר אונים, הקבוצה שהוצגה לראשונה עם שוק חשמלי (איור 1C), כמו גם הקבוצה שלמדה לשלוט בהלם, היו חסרי אונים יותר עם חביון בריחה מוגבר בהשוואה^לקבוצת הביקורת שלהם. הקבוצות שבהן נגרם חוסר אונים, לא הראו הבדלים בין חיית הניסוי לחיית הביקורת. אנהדוניה נמצאה במבחן בחירת שני בקבוקים לסוכרוז²⁷ ובהתנהגות מינית (נתונים שלא פורסמו). במבחן קבורת השיש, חיות דמויות דיכאון היו גם חרדות יותר²⁶ (איור 1D).

מודל החיות המתואר לא רק מציע את האפשרות לחקור התנהגות דמוית מאניה או דיכאון, אלא הוא גם מספק הזדמנות ייחודית להתבונן בשינוי בהתנהגות בעת הפסקת ביטוי היתר של DRD1, הדומה למעבר ממאניה לדיכאון אצל חולים. כאן, חשוב לזכור הרגלה להתנהגויות מסוימות ולבחור מבחנים עם הרגלה מינימלית. לדוגמה, התנהגות מינית מוגברת באפיזודה דמוית מאניה ובאפיזודה דמוית דיכאון, הוכחה ירידה של התנהגות כזו לרמות כמו שנראו בחיות ביקורת. בניסוי זה, שלושה מחזורים דמויי מאניה/דיכאון הושרו בתוך אותה חיה²⁷. עבור שתיית סוכרוז, ההעדפה לתמיסת סוכרוז במצב דמוי מאניה לא רק הופחתה לרמות בקרה כאשר הועברה למצב דמוי דיכאון, אלא ירדה²⁷. בגרסת העכברושים של משימת ההימורים באיווה, מספר הבחירות השליליות גדל בבעלי חיים דמויי מאניה, אך לא שונה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת כאשר החיות היו במצב דמוי דיכאון. במדינה האחרונה, מספר הכדורים הכולל שנצברו, הופחת בהשוואה לחיות ביקורת²⁴.

בסך הכל, בעלי חיים מראים פנוטיפ דו-קוטבי חזק, שניתן להבחין בו בתחומי התנהגות שונים במהלך שני הפרקים. המעבר בין פרקים במודל זה תורם לשיפור תוקף הפנים. סקירה כללית של תחומי ההתנהגות המושפעים ניתנת באיור 2.

איור 1: שינויים התנהגותיים במצבים דמויי מאניה ודיכאון בעקבות ביטוי יתר של DRD1 נגיפי. במהלך ביטוי היתר של DRD1 הנגיפי, במצב דמוי מאניה, בעלי חיים מראים יותר הרכבות מיניות (A) ועלייה בבחירות המסוכנות במשימת ההימורים של איווה (B) בהשוואה לביקורת. לאחר סיום ביטוי היתר, בעלי חיים עוברים למצב דמוי דיכאון. הם מראים עלייה בחוסר האונים (C) ובחרדה (D). *עמ' < 0.05; **עמ' < 0.01; קווי שגיאה מציינים שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פנוטיפ התנהגותי של המודל. באפיזודה דמוית מאניה, יש עלייה בהתנהגויות הקשורות לתגמול (למשל, התנהגות מינית), אימפולסיביות ולקיחת סיכונים. החרדה הופחתה במבחן המבוך המוגבה פלוס. במהלך האפיזודה דמוית הדיכאון, החרדה גברה במבחן קבורת השיש, ההתנהגות המינית פחתה, ובעלי החיים הראו יותר חוסר אונים. תמונת החולדה באיור נלקחה מ-Servier Medical Art והיא מורשית תחת CC BY 4.0. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שיקולים להערכה התנהגותית. הטבלה מדגישה שיקולים חשובים לשלבי הניסוי העיקריים במהלך הערכה התנהגותית. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

כאן מוצג מודל חולדה חדש ל-BD עם תוקף פנים מוגבר. מניפולציה ממוקדת של DRD1 בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית מאפשרת אינדוקציה של פנוטיפ דמוי מאניה ודיכאון באותה חיה. תוצאות מייצגות מדגישות פנוטיפ דמוי מחלה שניתן להבחין בו בשני הפרקים. הדגם קל יחסית ליישום. יש צורך בשני וקטורים לנטי-ויראליים הניתנים להשראה המבטאים DRD1 או dsRed כבקרה. לצורך ייצור ושימוש במערכות לנטי-ויראליות בבעלי חיים, נדרשות רמות בטיחות מסוימות, שצריכות להיות במקום. אם הציוד הדרוש לייצור וירוסים אינו זמין, הניסיון בעבודה עם מתקני ליבה היה חיובי.

השלב המכריע ביותר ליצירת המודל הוא הזרקה סטריאוטקטית של המערכת הלנטיויראלית. ניתוחים סטריאוטקטיים הם הליכים מבוססים היטב במדעי המוח, ושיעורי ההצלחה בקרב חוקרים מיומנים גבוהים. ישנם שני מקורות אפשריים עיקריים לטעות. בעיות בהרדמה עלולות להוביל למוות במהלך ההליך הכירורגי. כאן, שימוש בהרדמה באינהלציה של איזופלורן, כמתואר בפרוטוקול, הוכיח את הגישה הטובה ביותר, שכן רמות התרופה הניתנות להתאמה בקלות מהוות יתרון ברור בהשוואה להרדמה בהזרקה. מכיוון שאיזופלורן אינו מספק השפעות משככות כאבים וקוציטני קרום המוח רגישים לגירוי⁵², מומלץ להשתמש באופיואיד לשיכוך כאבים תוך ניתוחי. בשילוב עם תרופות מתאימות לאחר הניתוח, כמתואר בפרוטוקול, אין סימנים נראים לעין של כאבים לאחר הניתוח. עם זאת, יש לשקול תמיד השפעות אפשריות על שאלות מחקר, למשל, ביחס לאינטראקציות של דופמין עם מערכת האופיואידים, ויש לבחור משטר תרופתי מתאים בהתאם⁵³. אם הניתוח מבוצע בתנאים אספטיים, התרחשות זיהומים או פגיעה בריפוי הפצעים היא נדירה. אם מתרחשות בעיות במהלך ניתוח או התאוששות, פתרון הבעיות צריך להתמקד בביצוע נכון של הפרוטוקול המתואר. הקפדה על תנאי עבודה אספטיים ומינון מדויק של תרופות הם חיוניים. מתן תמיסות נוזלים או גלוקוז יכול בנוסף לסייע בהחלמה. אם מתרחשים זיהומים, הטיפול לא צריך לכלול טטרציקלינים מכיוון שהם יתקשרו עם שעתוק של המערכות הנגיפיות. טיפול קו ראשון לזיהומים בפצעים לאחר הניתוח יהיה אנרופלוקסצין, אולי בשילוב עם קרפרופן.

מקור אפשרי נוסף לטעות במהלך הניתוח הוא מיקום הזריקה מחוץ לאזור המטרה. עם זאת, זה קורה לעתים רחוקות כאשר מקפידים על הפרוטוקול בצורה נכונה ומובטח מיקום נכון של ראש החיה. השמה מוצלחת תמיד צריכה להיות מאומתת. בעוד שמיקום הנגיף המבטא dsRed ניתן לזיהוי בקלות בחיות ביקורת, אימות מיקום של וירוסים המבטאים DRD1 דורש שלבים נוספים. ביצוע צביעת נוגדנים על חלקים שונים של המבנה הנגיפי לא הניב תוצאות משביעות רצון. מומלץ לאמת את מיקום הנגיף על ידי ניתוח קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית וביצוע PCR לאיתור תעתיקי rtTA3 כמתואר ב-Beyer et ^al.24. כמו כן, חשוב לציין כי הזרקת הנגיף צריכה להיות דו-צדדית עם כמויות שוות של נגיף. הוכח כי לרוחב מוחי והתנהגותי שונים בחולים עם הפרעה דו קוטבית^54,55, וזריקות ויראליות חד צדדיות עשויות שלא לגרום לפנוטיפ ההתנהגותי הרצוי.

אינדוקציה של ביטוי DRD1 ויראלי ואפיזודה דמוית מאניה על ידי הוספת דוקסיציקלין למי השתייה עובדת טוב מאוד. הוכח כי החלפת מי שתייה רגילים בדוקסיציקלין אינה גורמת לשינויים ניכרים בהתנהגות השתייה. עם זאת, יש לעקוב אחר צריכת הנוזלים. מודולציות אפשריות, אם חומרים אחרים, למשל תרופות, מיועדים למתן באמצעות מי שתייה. מתן דוקסיציקלין יכול להתבצע גם באמצעות כדורי מזון. אבל זה עדיין לא אושר.

עבור חקירה התנהגותית, מספר שיקולים מפורטים בטבלה 1. במיוחד יש להעריך דרישות ספציפיות לדגם בעת תכנון ניסוי. לדוגמה, יש להחליט אם שתי קבוצות של בעלי חיים ייבדקו, או אם בעל חיים אחד יעבור הערכה התנהגותית במהלך שני האפיזודות, מה שעשוי לדרוש בדיקה חוזרת. אם הפנוטיפ הדו-קוטבי אינו ניתן לזיהוי במהלך החקירה ההתנהגותית, למרות שניתן לאמת את המיקום, פתרון בעיות יכול להתמקד בגורמים שונים שעשויים להשפיע על התוצאה ההתנהגותית. יש להעריך באופן ביקורתי שינויים בנסיינים או בשעון הביולוגי במהלך התהליך, מכיוון שתנאי לחץ בסביבה יכולים להשפיע על תוצאות התנהגותיות.

בעוד שהמודל מדגים תוקף טוב של מבנה ופנים, עדיין יש להעריך את תוקף הניבוי. מתן ליתיום כרוני, כטיפול קו ראשון ב-BD⁵⁶, אמור להצליח במניעת שינויים בהתנהגות הנגרמים על ידי המודל. תגובות לתרופות אחרות המשמשות ב-BD, כגון תרופות אנטי-פסיכוטיות או נוגדות פרכוסים, עשויות להיחקר כדי לבחון באופן מלא את תוקף הניבוי של המודל.

בנוסף, מגבלה נוכחית היא שתוקף המודל בחיות נקבות עדיין צריך להיבחן במחקרים עתידיים. אמנם יש מגמה לכלול חיות נקבות במחקר פרה-קליני, אך לעתים קרובות זה עדיין מוזנח. עבור המודל המוצג, יש לצפות לאינטראקציות של מערכת הדופמין עם מחזור הייחום. עם זאת, לא ברור באיזו מידה הם יתרחשו. חשוב גם לזכור את המגבלות הכלליות של מודלים של בעלי חיים פסיכיאטריים. בעוד שהאפשרות לגרום לשני אפיזודות דמויות מחלה בחולדה אחת מספקת תוקף פנים מוגבר, שינויים המושרים חיצונית עדיין שונים מהתרחשות ספונטנית ומחזוריות של אפיזודות מחלה בחולים עם BD. מכיוון שהמודל מבוסס אך ורק על מניפולציה ממוקדת של מערכת הדופמין, ההשפעות העיקריות ייגרמו משינויים בהעברת הדופמין והשפעות משניות נלוות. לכן תרומות של מערכות אחרות לסימפטומולוגיה של BD אינן נלקחות בחשבון.

לסיכום, למודל המוצג יש פוטנציאל חזק לחקור BD, שכן ניתן לחקור את שני אירועי המחלה בבעל חיים אחד. זה מציג אפשרויות ייחודיות לחקירת מעברים בין אפיזודות בהשוואה לרוב המודלים המבוססים. הפרוטוקול המוצג דורש ציוד ומיומנויות טכניות הזמינים ברוב מעבדות המחקר הפרה-קליניות, מה שהופך אותו ליישום נרחב. עד כה, הפנוטיפ ההתנהגותי שנוצר היה חזק על פני התנהגויות שונות. תחומים אחרים כמו התנהגות חברתית⁵⁷ או תפקודים קוגניטיביים עדיין לא נחקרו. בעוד שהפרוטוקול שהוצג התמקד בתוצאות התנהגותיות, ישנן אפשרויות שונות ליישומים עתידיים לחקור עוד יותר מנגנונים מולקולריים. הרחבת החקירות להבנת המנגנונים הבסיסיים בפתוגנזה של BD, במיוחד בנוגע למעבר בין אפיזודות, עשויה להוביל לזיהוי מטרות טיפוליות שבסופו של דבר יכולות להיות מתורגמות ליישומים קליניים עתידיים.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הגרמנית (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG): פרויקט מספר 552842155 ופרויקט GRK2862/1, פרויקט מס': 492434978. JA קיבלה מימון מקרן המחקר FoRUM של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת רוהר בוכום (מענק מס' P109-24). תמונת החולדה באיור 2 נלקחה מ-Servier Medical Art והיא מורשית תחת CC BY 4.0.