הערכה פרה-קלינית של סטנטים בעורקים הכליליים

יש לבדוק עיצובים וחומרים חדשים של סטנטים בעורקים הכליליים לפני השימוש הקליני במודלים פרה-קליניים רלוונטיים. כאן אנו מתארים מודל אבי העורקים של ארנב טרשת עורקים ומודל עורק כלילי של חזיר לחקר סטנטים עם ניתוחים in vivo והיסטולוגיים.

מחלת עורקים כליליים היא תורמת מרכזית לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. בעוד ששינויים באורח החיים ותרופות הם אבני היסוד של הטיפול, אנגיופלסטיקה בבלון עורקים כליליים וסטנט מבוצעים באופן שגרתי בחולים עם תסמונות כליליות חריפות ומחלת עורקים כלילית כרונית שנותרו סימפטומטיים עם טיפול רפואי אופטי. בעשורים האחרונים פותחו כמה דורות של סטנטים כליליים. אנגיופלסטיקה וסטנט בבלון נתמכים על ידי שימוש בחומרים פרמצבטיים המונחים על בלונים ועל משטח הסטנט, או כדי לקדם את תכונות הריפוי של העורק לאחר ההתערבות או כדי למנוע היווצרות רסטנוזיס. מכשירים חדשים צריכים להיבדק בקפדנות לבטיחות ויעילות לפני קבלתם לפרקטיקה קלינית; לפיכך, קיים צורך מתמשך בשיטות פרה-קליניות אמינות וניתנות לשחזור להערכת סטנטים. אנו מתארים כאן מודל עורקים כליליים של חזיר וכן מודל ארנב טרשת עורקים לחקר סטנטים בעורקים כליליים ומתארים שלבים בסיסיים בהדמיה תוך-וסקולרית והיסטולוגיה של סטנטים.

מחלת עורקים כליליים טרשת עורקים גורמת לעומס משמעותי על מערכות הבריאות של מדינות ברחבי העולם¹. אנגיופלסטיקה בבלון עורקים כליליים וסטנט מבוצעים באופן שגרתי בחולים הסובלים מתסמונות כליליות חריפות וכן בחולים סימפטומטיים עם מחלת עורקים כלילית יציבה². אנגיופלסטיקה בבלון הייתה המצאה מהפכנית לרה-וסקולריזציה של עורקים כליליים צרים או אפילו חסומים. סטנטים בעורקים הכליליים שיפרו עוד יותר את התוצאות של התערבויות כליליות מלעוריות (PCIs) על ידי מניעת רתיעה חריפה של העורק לאחר אנגיופלסטיקה בבלון³. התוצאות של PCIs השתפרו עוד יותר עם הכנסת סטנטים להסרת תרופות (DESs) או סטנטים המצופים בתרופות אנטי-פרוליפרטיביות כדי להילחם ברסטנוזיס (ISR) - היצרות מחדש של סטנט שנפרס בעבר. DESs פותחו עוד יותר עם תמוכות סטנט דקות יותר אך עמידות יותר ופולימרים מתכלים לשחרור תרופות. מבחינה רעיונית, הפלטפורמה הנוקשה של הסטנט נדרשת רק למספר שבועות עד חודשים כדי למנוע רתיעה של העורק. זה הוביל לדור חדש של התקני פיגומים מתכלים לחלוטין. סטנטים ופיגומים מתכלים מוקדמים נתקלו בכמה מכשולים, מכיוון שמחקרים דיווחו על שכיחות מוגברת של פקקת סטנט⁴. כתוצאה מכך, סטנטים מתכלים אינם נמצאים בשימוש נרחב.

כמעט מיליון PCIs מבוצעים מדי שנה בארצות הברית בלבד. הפיתוח של חומרים ועיצובים חדשים של סטנטים יימשך ככל שיותר ויותר חולים יטופלו תוך וסקולרית. הערכת מכשירים חדשים מחייבת בדיקה בסביבה רלוונטית מבחינה ביולוגית, מה שמחייב שימוש במודל בעל חיים מתאים. מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים חיוניים עוד יותר בעת חקר מכשירים מתכלים, מכיוון שתכונות הפירוק של מכשירים אלה עשויות להיות בלתי צפויות. יש לבצע הערכה במודלים של בעלי חיים גדולים, בהם ניתן ללמוד מכשירים גדולים מספיק כדי להיות מיועדים לשימוש המטופל.

אנו מתארים כאן מודל עורקים כליליים של חזיר ומודל אבי העורקים של ארנב טרשת עורקים להערכת סטנטים פרה-קליניים ^5,6. שני הדגמים יכולים להכיל מכשירים וציוד המיועדים לשימוש קליני. אנו מציגים שיטות הדמיה in vivo להערכת ביצועי סטנטים, פקקת סטנטים ו-ISR. בנוסף, אנו מראים שיטות לניתוחים היסטולוגיים של רקמות משובצות פלסטיק, כולל אימונוהיסטולוגיה⁷.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי מועצת הניסויים בבעלי חיים בפינלנד. ארנבים בוגרים במשקל 3.0-4.0 ק"ג ניו זילנד לבנים (NZW) שימשו למודל הארנב הטרשתי. במחקר הכלילי של חזירים, החיות שקלו 30-40 ק"ג בתחילת הניסוי. הפרוטוקול של מודל טרשת העורקים של הארנב ומודל העורקים הכליליים של החזיר מתואר בנפרד, ואחריו תיאור כיצד ניתן לבצע היסטולוגיה עבור סטנטים כליליים שאינם מתכלים, ללא קשר למודל in vivo בו נעשה שימוש.

1. מודל טרשת עורקים של ארנב

הערה: כדי לגרום לשינויים מהירים בטרשת עורקים באבי העורקים, בעלי החיים מוזנים בתזונה עתירת כולסטרול, ואבי העורקים עוברים דה-אנדותליזציה לפני השתלת הסטנט. סטנטים והדמיה מבוצעים דרך עורקי הצוואר, והסטנטים מעובדים להיסטולוגיה כמפורט להלן. אולטרסאונד תוך-וסקולרי (IVUS) מתאים יותר מטומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) לאבי העורקים של ארנב מכיוון שאין צורך בשטיפה עורקית.

1. דיאטה עתירת כולסטרול (איור 1)
   1. המירו את הזנת הארנב הרגילה להזנת כולסטרול גבוהה על ידי הוספת כולסטרול. מערבבים כולסטרול לחלק אחד אתנול וחלק אחד אתר דיאתיל (250 גרם כולסטרול ל -2 ליטר של 96% EtOH ו -2 ליטר אתר דיאתיל) על מערבל מגנטי בכוס גדולה.
   2. כאשר הכולסטרול נמס, שפכו את התערובת על 25 ק"ג מזון ארנב באגן גדול בתוך מכסה המנוע. מערבבים את ההזנה מספר פעמים ביום למשך 3-4 ימים עד שהתערובת מתייבשת.
   3. זה יפיק מזון כולסטרול של 1%. כדי להכין מזון של 0.025% כולסטרול, הזנת הכולסטרול של 1% מעורבבת בהזנת ארנב רגילה ביחס של 1:40.
2. כריתת בלון של אבי העורקים של הארנב
   1. יש לערבב אספירין במי השתייה של הארנב, החל מ-3 ימים לפני הפגיעה בדנודציה ולהמשיך עד לסיום הניסוי (100 מ"ג אספירין ל-1 ליטר מי שתייה). מים מוצעים אד ליביטום.
   2. להרדים את הארנבים עם 0.3 מ"ג/ק"ג מדטומידין ו-20 מ"ג/ק"ג קטמין תת עורי (s.c). הסר את הפרווה מאזור המפשעה ומאזור הירך הפנימי של הרגל האחורית הימנית בעזרת קוצץ טיפוח ועיקר את העור עם חומר חיטוי על בסיס אתנול.
   3. יש לתת אנטיביוטיקה מונעת סביב הניתוח (125 מ"ג cefuroxime s.c.).
   4. יש למרוח חומר הרדמה מקומי לפני חתכים בעור עם 10 מ"ג/מ"ל לידוקאין s.c. לאורך אזור הירך הפנימי לאורך החריץ, המחזיק את כלי הדם והעצבים העיקריים באזור הירך.
   5. בצע חתך בעור והתקדם בזהירות דרך הרקמה התת עורית ושרירי הרגליים בעזרת מספריים לניתוח ומספריים לניתוח.
   6. לחשוף את עורק הירך ולהיפרד מהרקמות הסובבות ומהווריד והעצב.
   7. העבירו תפר כירורגי שאינו נספג 5-0 פעמיים מתחת לעורק בעורק הירך הפרוקסימלי. הרם את העורק בזהירות עם קו התפר (לא נוצרת קשירה, אלא התפר הניתוחי מוחזק עם זוג מברגי מחט או מלקחיים נגד יתושים). קו זה משמש לעצירה זמנית של זרימת הדם לעורק הירך.
   8. העבירו קו תפר שאינו נספג 5-0 פעמיים מתחת לחלק הדיסטלי של עורק הירך וקשרו היטב קשירה כדי לחסום את עורק הירך הדיסטלי (למשל, עם קשר מילר).
   9. בצע חתך קטן של 1-2 מ"מ או כריתת עורקים לתוך העורק בעזרת מספריים מיקרוכירורגיים או אזמל דק בזמן שהעורק נתמך ומוחזק במקומו מהקווים הכירורגיים הפרוקסימליים והדיסטליים על ידי עוזר.
   10. הכנס קטטר בלון לכריתת תוספות Fogarty 3F לעורק המכוון קרוב לכיוון עורק הכסל. לפני ההחדרה, הכינו את קטטר כריתת האמבולקטומיה על ידי חיבורו למזרק של 1 מ"ל מלא ב-0.6 מ"ל אוויר (ניתן להשתמש גם במי מלח, אך בלון מלא באוויר תואם יותר). קו הניתוח הפרוקסימלי מונמך כדי לאפשר מעבר של קטטר כריתת התסחיף.
       הערה: קטטר לכריתת תסחיף של פוגארטי ללא לומן חוט מנחה משמש להליך.
   11. העבירו את קטטר כריתת הקישוט 30 ס"מ לתוך העורק (כפי שנשפט על פי הסימונים על ציר הצנתר). נפחו עם המזרק ומשכו את הקטטר המנופח עד שהוא מגיע לפחות להתפצלות הכסלית, ובשלב זה מורגשת התנגדות על הצנתר.
   12. רוקן את קטטר כריתת התסחיף והכניס אותו מחדש לאבי העורקים. חזור על המשיכה לאחור בסך הכל שלוש פעמים.
   13. לאחר השלמת הניתוק, משוך את קטטר כריתת התסחיף וסגור את עורק הירך בקו התפר הפרוקסימלי. עורק הירך ייחסם אפוא לאחר ההליך. עם זאת, בשל זרימת הדם הצדדית הטובה בגפה האחורית של הארנב, לעתים רחוקות יש חששות בריאותיים הקשורים לאיסכמיה.
   14. קשרו את השריר המכסה את עורק הירך עם 4-0 תפרים נספגים, ואת העור עם תפר תוך עורי עם קו תפר נספג 4-0.
   15. בעלי החיים מנוטרים עד שהם ערים, ערניים ושותים או מאכילים. הקל על התאוששות הארנבים באמצעות תא מחומם עם גישה למים וחציר.
   16. יש לתת קרפרופן לאחר פרוצדורות כירורגיות במשך 1-3 ימים או יותר במידת הצורך (2 מ"ג/ק"ג SC, פעם ביום) לשיכוך כאבים.
3. סטנט של אבי העורקים של הארנב
   1. התחל קלופידוגרל ביום הסטנט במינון העמסה של 30 מ"ג והמשך עם 15 מ"ג ביום עד סוף הניסוי. טבליות קלופידוגרל טחונות במכתש, מערבבים במי ברז (5 מ"ל מים לטבלית קלופידוגרל אחת של 75 מ"ג; מינון ההעמסה הוא 2 מ"ל ואחריו 1 מ"ל ביום), ויש לתת דרך צינור קיבה.
      הערה: קלופידוגרל אינו מתמוסס לחלוטין במי ברז; הכינו מנה חדשה מדי יום לפני מתן תרופות לארנבים. בשלב זה, ודא שהארנבים נוטלים אספירין יומיומי לאחר פציעת הדנודיציה.
   2. להרדים את הארנבים עם 0.3 מ"ג/ק"ג מדטומידין ו-20 מ"ג/ק"ג קטמין s.c.
   3. יש לתת אנטיביוטיקה מונעת סביב הניתוח (125 מ"ג של cefuroxime s.c.).
   4. הסר שיער מהצד הקדמי של הצוואר בעזרת קוצץ גילוח ועיקר את העור בעזרת חומר חיטוי על בסיס אתנול.
   5. יש למרוח לידוקאין כחומר הרדמה מקומי לאורך קו האמצע של הצוואר (3-5 מ"ל) ולבצע חתך אורכי של 4-5 ס"מ דרך העור.
   6. פתח את הפלטיזמה על ידי חיתוך עם מספריים לדיסקציה לאורך. קרישת עורקים מדממים קטנים על ידי סחיטה בפינצטה כירורגית או קרישה באמצעות מכשיר קרישה חד קוטבי או דו קוטבי.
   7. חריץ טבעי מזוהה בתוך שרירי הצוואר, שביניהם ניתן למצוא את עורק הצוואר יחד עם עצב הנרתיק (בין שרירי הסטרנומסטואיד והסטרנוהיואיד) (איור 2A). נתח את העורק בזהירות והפריד אותו מרקמות אחרות. עורק הצוואר הימני מועדף מכיוון שהוא מספק קו גישה ישיר יותר לאבי העורקים היורד.
   8. העבירו קו תפר שאינו נספג 5-0 פעמיים מתחת לחלק הדיסטלי של עורק הצוואר וקשרו היטב את העורק. החזק את קו הניתוח כלפי מעלה כדי להרים את החלק הדיסטלי של עורק הצוואר.
   9. העבירו קו כירורגי שאינו נספג 5-0 פעמיים מתחת לחלק הפרוקסימלי של עורק הצוואר. מבלי ליצור קשירה, השתמש בקו הכירורגי הפרוקסימלי כדי להרים את עורק הצוואר כדי לחסום זמנית את זרימת הדם לעורק הצוואר באזור הניתוח.
   10. בצע כריתת עורקים קטנה של 1-2 מ"מ לעורק הצוואר בין קווי הניתוח בעזרת מספריים מיקרו-כירורגיים.
   11. הכנס נדן היכרות 5F או 6F מוכן במלואו לכיוון הפרוקסימלי.
       1. יש לשטוף את הנדן במי מלח, להכניס את המרחיב לתוך הנדן ולשטוף לפני החדרת הנדן לעורק. בנוסף, כדי להקל על התקדמות הנדן, הכנס חוט מנחה קצר דרך המרחיב כדי ליצור קצה מחודד לנדן.
       2. ברגע שקצה הנדן (או ליתר דיוק המרחיב) נמצא בתוך עורק הצוואר, הורד את קו הניתוח הפרוקסימלי כדי לאפשר לנדן לעבור לתוך העורק.
   12. מקדמים את הנדן 2-3 ס"מ לעורק הצוואר.
   13. הסר את האובטורטור ואת החוט ממעטפת המציג.
   14. אשר את מיקום הנדן בעורק על ידי פתיחת שסתום הנדן והוצאת כמות קטנה (1-2 מ"ל) של דם מהמעטפת.
   15. שטפו את הנדן במי מלח שעברו הפרין (5000 יחב"ל ל-1000 מ"ל, 0.9% NaCl) ותפרים כדי להדק אותו לווילונות הניתוח או לעור הארנב. הפרין את הארנב על ידי מתן הפרין לא מפורק דרך הנדן (150 IU/kg).
   16. יש להעביר את בעל החיים לשולחן הצנתורים אם הניתוח לא בוצע על שולחן מעבדת הצנתור.
   17. קדם חוט מנחה דק (0.014 אינץ') דרך נדן הכניסה והוביל אותו לתוך אבי העורקים היורד תחת פלואורוסקופיה. קדם קטטר מנחה 5F מעל חוט ההנחיה.
       הערה: ניתן להשתמש בצנתר מנחה עם עיקול אם מתקשים לנווט מעורק הצוואר אל אבי העורקים היורד.
   18. אם נעשה שימוש בצנתר מנחה עם קצה זוויתי כדי לגשת לאבי העורקים היורד, החלף אותו לצנתר מנחה ישר מעל חוט ההנחיה כדי לספק סטנטים או צנתרי הדמיה.
   19. רכוש תמונה אנגיוגרפית של אבי העורקים הבטני על ידי הזרקת ניגודיות דרך הצנתר המנחה עם חומר ניגוד על בסיס יוד (250-350 mgI/mL).
   20. בחר קטע מתאים בין העורקים המותניים באבי העורקים האינפרא כלייתי לפריסת סטנטים. פרוס את הסטנט ביחס של 1.1:1 (הסטנט מעט גדול מדי לעורק כדי למנוע מהסטנט לזוז בעת הוצאת קטטר הבלון) לתוך אבי העורקים בעזרת אינדיפלטור בהתאם להוראות יצרן הסטנט (לכל הסטנטים המותקנים על צנתרי בלון תישלח טבלת מידות עם הסטנט). רוקנו את הבלון והוציאו את צנתר הסטנט (איור 2B).
   21. בצע אנגיוגרפיה חוזרת עם חומר הניגוד כדי לאשר את מיקום הסטנט.
   22. הסר את מעטפת ההיכרות לאחר סטנט והדמיה. סגור את העורק עם קו התפר הפרוקסימלי בעורק הצוואר. זה יסתום לחלוטין את עורק הצוואר.
   23. סגור את שכבות השרירים של הצוואר (בדרך כלל שתי שכבות של תפרים) עם 4-0 תפרים נספגים ואת העור עם 4-0 תפרים תוך עוריים הניתנים לספיגה.
   24. עקוב אחר התאוששות בעל החיים ומתן משככי כאבים כמתואר בפעולת הסרת הבלון (שלבים 1.2.15-1.2.16).
4. הדמיית אבי העורקים של ארנב עם IVUS
   1. רכשו גישה לכלי הדם ומקמו קטטר מנחה ישר לתוך אבי העורקים היורד כמתואר עבור פעולת הסטנט של אבי העורקים של הארנב.
      הערה: ההדמיה מתבצעת בזמן הסטנט דרך אותה גישה לכלי הדם. ניתן ליצור נקודת זמן הדמיה שנייה על ידי שימוש בעורק הצוואר השמאלי.
   2. קדם את צנתר ההדמיה על חוט מנחה לתוך אבי העורקים הדיסטלי מעבר למקטע הסטנט (או היכן שהסטנט יוצב אם מתבצעת הדמיה מוקדמת).
   3. בצע משיכה באופן ידני בזמן שנתוני ה-IVUS נרשמים או התחל את המשיכה האוטומטית (ראה הוראות למערכת IVUS). במהלך הנסיגה, יחידת ההדמיה נעה מעל אזור המטרה באופן אוטומטי אם היא מופעלת על ידי מערכת ההדמיה או באופן ידני על ידי משיכת קטטר ההדמיה מעל אזור העניין (הסטנט) תוך כדי רישום נתוני ההדמיה.
   4. שמור את נתוני ההדמיה והסר את צנתר ההדמיה, את חוט ההנחיה ואת הצנתר המנחה.
   5. הסר את הנדן וסגור את פצע הניתוח כמתואר עבור הליך הסטנט (שלב 1.3).
   6. עקוב אחר התאוששות בעל החיים כפי שתואר קודם לכן. יש לתת משככי כאבים כפי שתואר קודם לכן (שלבים 1.2.15-1.2.16).
5. זלוף וקיבוע רקמות (דגם ארנב)
   1. להקריב את בעלי החיים בהרדמה של קטמין-מדטומידין עם הזרקה תוך ורידית של 20-30 מ"ל של מגנזיום גופרתי רווי (MgSO₄).
   2. להחדיר מי מלח, או אם אוספים דגימות רק להיסטולוגיה עם תערובת פרפורמלדהיד 1%, באמצעות משאבה ייעודית.
   3. לחלחל את אבי העורקים של הארנב על ידי החדרת מערכת הזלוף דרך מחט או צינורית ישירות לתוך אבי העורקים היורד מעל מפלס עורק הכליה או על ידי החדרת המחט דרך החדר השמאלי של הלב לתוך אבי העורקים (מה שיחלחל את כל החיה).
   4. מרחו מהדק על אבי העורקים היכן שקצה המחט או הצינורית נמצא כדי לאבטח אותו באבי העורקים במהלך הליך הזילוף.
   5. פרפיוז עם 1000 מ"ל (מאבי העורקים היורד) או 1500 מ"ל (מאבי העורקים העולה דרך החדר השמאלי) של מי מלח או 1% PFA.
   6. אסוף את הקטע הסטנט של אבי העורקים על ידי כריתה בזהירות מהרקמות שמסביב.
      הערה: שקול לאסוף מקטעים פרוקסימליים ודיסטליים של אבי העורקים לצורך היסטולוגיה. כמו כן, אסוף את כל רקמות הבטיחות הדרושות.
   7. הנח את הרקמות שנאספו המיועדות לניתוח היסטולוגי לתוך 4% פרפורמלדהיד למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT), או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   8. לאחסון נוסף, העבירו ל-50% EtOH ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ולאחר מכן ל-70% EtOH ב-4 מעלות צלזיוס עד להיסטולוגיה.

2. דגם עורק כלילי חזיר

הערה: לב החזיר דומה מבחינה אנטומית ופיזיולוגית ללב האדם. העורקים הכליליים דומים גם הם - הם עוברים בצורה אפיקרדילית ויוצרים שלושה ענפים כליליים עיקריים (העורק הכלילי הימני (RCA) והעורק הכלילי השמאלי (LCA), המתחלק עוד יותר לעורק הכלילי העולה השמאלי (LAD) ולעורק ההיקפי השמאלי (LCX)). הנה מודל עם סטנטים שבוצעו לעורקים הכליליים של חזירים מקומיים והדמיה תוך-וסקולרית המבוצעת עם OCT. חזירים צמים לילה לפני ההרדמה.

1. הרדמה וגישה לכלי הדם לסטנט והדמיה כליליים של חזירים
   1. הרגיעו את בעלי החיים עם אזפרון (8 מ"ג/ק"ג תוך שרירי (i.m.)) ואטרופין (0.05 מ"ג/ק"ג i.m.), וגרמו והמשיכו בהרדמה עם פרופופול תוך ורידי (15 מ"ג/ק"ג/שעה) ופנטניל (10 מיקרוגרם/ק"ג/שעה). החדירו את בעלי החיים והשאירו אותם על מכונת הנשמה לאורך כל ההליכים.
   2. גישה לכלי הדם נרכשת דרך עורק הירך הימני. אתר את עורק הירך בעזרת מתמר אולטרסאונד (ניתן להבחין בין העורק לווריד על ידי פעימת העורקים ועל ידי דחיסה עם המתמר).
   3. בהנחיית אולטרסאונד, קדם מחט אנגיוגרפית לעורק הירך.
   4. ברגע שנכנס לעורק, זרימת דם פועמת חזקה תגיע דרך המחט. קדם חוט מנחה לעורק והסר את המחט.
   5. קדם מכניס מורכב ושטוף בגודל מתאים (בדרך כלל 5F או 6F) לתוך העורק מעל החוט.
      הערה: הקפד לשמור על החוט גלוי בכל עת, כך שהוא לא יאבד בעורק.
   6. הסר את המרחיב ואת החוט ממעטפת המציג.
   7. יש לשטוף את הנדן בתמיסת מלח הפרינית (5 יחב"ל/מ"ל).
   8. יש לתת 1 מ"ג/ק"ג enoxaparin i.v. לאחר השלמת גישה לכלי הדם.
   9. יש לתת אנטיביוטיקה מונעת לכל הליך פולשני (500 מ"ג צפורוקסים i.m).
2. אנגיוגרפיה וסטנט של העורקים הכליליים של חזירים
   1. התחל תרופות אנטי-טרומבוטיות ביום הסטנט עם מינון העמסה של 300 מ"ג אספירין לכל מערכת הפעלה (po) ומינון העמסה של 600 מ"ג קלופידוגרל פו. יש להמשיך באספירין (100 מ"ג ביום) ובקלופידוגרל (75 מ"ג ביום) עד לסיום הניסוי.
   2. קדם חוט מנחה עם קצה J תחת פלואורוסקופיה אל אבי העורקים העולה.
   3. קדם קטטר מנחה עם זווית מתאימה מעל חוט J והפעל את העורקים הכליליים הימניים והשמאליים (בדרך כלל AR1 לעורק הכלילי הימני ו-AR2 לעורק הכלילי השמאלי).
      הערה: הצנתר המנחה מחובר למתאם Y ולסעפת עם קו לפחות לחומר הניגוד כדי למזער את הסיכון לכניסת אוויר למערכת ההדמיה.
   4. בצע אנגיוגרפיה כלילית על ידי הזרקת חומר ניגוד לעורק הכלילי.
      הערה: יש לבצע הדמיה משתי זוויות שונות לפחות עבור כל עורק כלילי. כמו כן, יש לתת חנקות תוך כליליות לפני הדמיה (50-300 מיקרוליטר).
   5. העבירו חוט מנחה כלילי (0.014 אינץ') לקטע הכלילי המתאים. הנח את הסטנט לתוך ה-RCA וה-LCX או העורק השולי הקהה שמקורו ב-LCX.
      הערה: ה-LAD הוא לרוב מחודד בצורתו, וניתן בקלות להשאיר סטנט מורחב יתר על המידה בחלק הדיסטלי או מורחב פחות בקצה הפרוקסימלי. יש לשקול היטב באילו עורקים כליליים משמשים. השתמש בתוכנת ניתוח ההיצרות של יחידת הרנטגן או הדמיה תוך-וסקולרית כדי לסייע בבחירת מקטע עורק טוב והתאמת גודל הסטנט.
   6. קדם את הסטנט מעל חוט ההנחיה ופרוס עם מתנפח לפי הוראות היצרן ליחס סטנט לעורק של 1.1:1, תוך הגדלה קלה של הסטנט בהשוואה לקוטר הייחוס של העורק.
   7. בצע אנגיוגרפיה חוזרת והדמיה תוך-וסקולרית במידת הצורך.
   8. הסר את ציוד הצנתור.
   9. הסר את מעטפת הכניסה והפעל לחץ על מקום הניקוב באופן ידני או בעזרת מכשיר דחיסת עצם הירך.
      הערה: התקני סגירת כלי דם בדרך כלל אינם פועלים היטב בחזירים בגלל הבדלים באנטומיה של הרגל האחורית של החזיר בהשוואה לאדם והגודל הקטן יחסית של עורק הירך.
3. הדמיית OCT של העורקים הכליליים
   1. בצע הדמיית OCT לפני ואחרי פריסת הסטנט ובמהלך המעקב. כדי להתחיל בהדמיית OCT, רכשו גישה לכלי הדם, העסיקו את העורק הכלילי המטרה עם קטטר מנחה, וקדמו חוט מנחה כלילי דיסטלי בעורק המטרה.
   2. חבר את צנתר ההדמיה OCT לתחנת העגינה של מערכת ההדמיה.
      הערה: פעל בהתאם להוראות מערכת ההדמיה, שכן הן משתנות בין יצרנים וכן בין דורות שונים של צנתרי הדמיה.
   3. צור מטופל חדש להקלטה עם קוד זיהוי לבחירתך.
   4. שטוף את לומן צנתר ההדמיה עם חומר ניגוד.
      הערה: ניתן לבצע הדמיה עם שטיפה במי מלח, אך עשויה לדרוש שינוי של הגדרות התמונה של המערכת לקבלת תוצאות מדויקות.
   5. הכנס את מערכת המונורייל של צנתר ההדמיה מעל חוט ההנחיה וקדם את סמני הדמיית הצנתר למיקום ההדמיה הרצוי.
      הערה: ודא תמיד שחוט ההנחיה מתקדם מספיק לתוך העורק; אל תתנו לצנתרים (הדמיה, בלון, סטנט) לעבור מעבר לקצה חוט המנחה.
   6. בצע הדמיה. כלול את כל הסטנט כמו גם את כלי הייחוס הדיסטליים והפרוקסימליים בנסיגה.
      1. שטוף את לומן צנתר ההדמיה עם חומר ניגוד.
      2. התחל את רצף הנסיגה האוטומטית.
      3. שטפו את העורק הכלילי עם בולוס גדול של חומר ניגוד דרך הצנתר המנחה (250-350 מ"ג/מ"ל).
4. זלוף וקיבוע רקמות (דגם חזיר)
   1. בהרדמה, החזיר מוקרב עם בולוס של 50-100 מ"ל של אשלגן כלורי רווי (KCl).
   2. להחדיר מי מלח, או אם אוספים דגימות רק להיסטולוגיה עם תערובת פרפורמלדהיד 1%, באמצעות משאבה ייעודית.
   3. חדרו את כל לב החזיר על ידי הנחת צינורית או מחט המחוברות למשאבת הזלוף באופן רופף לתוך אבי העורקים העולה.
   4. הנח clamp מחוץ לאבי העורקים כדי לסגור את אבי העורקים סביב המחט/צינורית.
      הערה: מוודא שפתחי המסתם האאורטלי פתוחים כדי לאפשר לנוזל הזלוף לזרום לעורקים הכליליים.
   5. החדרה עם 750-1000 מ"ל של נוזל זלוף נבחר.
   6. אסוף את הקטעים הסטנטים של העורק הכלילי על ידי כריתה בזהירות מהרקמות שמסביב.
      הערה: שקול לאסוף מקטעים פרוקסימליים ודיסטליים של העורק הכלילי לצורך היסטולוגיה. בנוסף, אסוף את כל רקמות הבטיחות הדרושות.
   7. הנח את הרקמות שנאספו המיועדות לניתוח היסטולוגי לתוך 4% פרפורמלדהיד למשך 4 שעות ב-RT, או לילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   8. לאחסון נוסף, העבירו ל-50% EtOH ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ולאחר מכן ל-70% EtOH ב-4 מעלות צלזיוס עד להיסטולוגיה.

3. היסטולוגיה של סטנטים

הערה: היסטולוגיה של סטנטים מסטנטים מתכתיים בלתי מתכלים דורשת שימוש במערכת הטמעה מפלסטיק וחתך דגימה עם מיקרוטום מיוחד. מערכת ההטמעה זמינה מסחרית, אך כדי לאפשר אימונוהיסטולוגיה מבוססת נוגדנים, יש לבצע כמה שינויים בפרוטוקול. פרוטוקול ההטמעה זהה עבור כל הדגימות ללא קשר למודל החיה בו נעשה שימוש. השתמש במערכת הטמעה מפלסטיק לתהליך ההטמעה. עבוד בתוך מכסה המנוע לכל הליכי ההטבעה וההיסטולוגיה.

1. לייבש את הדגימות מתמיסת EtOH לקסילן.
2. עקוב אחר הפרוטוקול עבור מערכת ההטבעה, למעט שימוש בתמיסה בסיסית לא יציבה החל מהשלב השני לפני החדירה.
   הערה: התמיסה הבסיסית מתערערת על ידי ניקוז דרך תחמוצת אמוניום.
3. שלב את נוזלי הפילמור בצנצנות דגימת פלסטיק עם הקטעים הסטנטים.
   הערה: ניתן לקבע את העורקים הסטנטים למקומם על ידי החדרת מחט קטנה דרך החלק החיצוני של המיכל.
4. מרחו ואקום על הדגימות למשך 10-15 דקות והשאירו לפילמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות.
5. ניסר את שולי גוש הפלסטיק (במיוחד אם משתמשים בתבנית גלילית) ליצירת משטחים ישרים. זה יאפשר חיבור בטוח למיקרוטום.
6. חותכים בעזרת מיקרוטום ייעודי למקטעים של 5-7 מיקרומטר.
7. השאירו את החלקים הטריים שנחתכו ב-50% EtOH למשך 5-10 דקות.
8. אסוף את החלקים מה-EtOH על שקופיות מיקרוסקופיה סטנדרטיות (שניים או שלושה חלקים לכל שקופית).
9. מכסים בשתיים או שלוש טיפות מהתמיסה של האופט ומכסים בניילון פלסטיק. הניחו שכבת נייר על גבי סרט הפלסטיק והניחו שקופית זכוכית ריקה על גבי הנייר.
10. הפעל לחץ על השקופית למשך 24 שעות לפחות ב-42 מעלות צלזיוס על ידי הנחת השקופיות בסגן שולחן קטן כשהן מרופדות בשכבות נייר.
11. אחסן את השקופיות ב-RT.
12. לפני צביעה היסטולוגית, הסר את השרף על בסיס פלסטיק על ידי דגירה של השקופיות במתיל מתאקרילט למשך 24-48 שעות.
13. שקוף בקסילן (דגירה של 2 x 10 דקות) לפני ההליך ההיסטולוגי או האימונוהיסטולוגי הסטנדרטי ^7,8.

יש לאשר הרחבת סטנט מוצלחת באמצעות אנגיוגרפיה ובאופן אידיאלי באמצעות הדמיה תוך-וסקולרית (איור 3A,B). מודל העורקים הכליליים של חזיר מאפשר מפגשי הדמיה מרובים, וניתן להשתמש ב-OCT ליצירת נתוני מעקב עם הדמיה תכופה. ניתן להעריך בקלות הרחבת ISR וסטנט, ושברים אפשריים בתמוכות מהדמיה אנגיוגרפית ו-OCT. הדמיה תוך-וסקולרית מייצרת גם נתונים לאורך הסטנט כולו, בניגוד להיסטולוגיה, שבדרך כלל יכולה להתבצע רק מכמה מקטעים לאורך הסטנט.

באמצעות השיטות ההיסטולוגיות לעיל, ובמיוחד פרוטוקול ההטמעה המותאם, ניתן לבצע אפילו אימונוהיסטולוגיה ממקטעים סטנטים. היסטולוגיה רגילה של ערכות כמו המטוקסילין ואאוזין (HE) מיושמת גם היא בקלות (איור 4A). אולם אפילו פרוטוקולים מבוססי נוגדנים יכולים לשמש בשיטה הזו כדי לזהות אנדותל, תאים דלקתיים וזיהוי של סוגי תאים אחרים (איור 4B).

איור 1: ציר זמן למחקר מעקב של 6 שבועות במודל טרשת עורקים של אבי העורקים של ארנב. מוצגים הפעולות העיקריות והמתווה לדיאטה ההיפרכולסטרולמית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מבט כירורגי של עורק הצוואר של ארנב וצילום רנטגן של הסטנט באבי העורקים של ארנב. (A) תצלום של אתר ניתוח עבור מודל הארנב עם האנטומיה של הצוואר לאחר הכנת עורק הצוואר לפני מיקום המציג. (B) אנגיוגרמה לפני הזרקת ניגודיות של אבי העורקים של ארנב עם סטנט מושתל (חיצים מסמנים קצוות סטנט). קיצורים: CA = עורק הצוואר; VN = עצב התועה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אנגיוגרמה כלילית של חזיר והדמיית OCT. (A) אנגיוגרפיה של העורק הכלילי הימני של החזיר עם סטנט מושתל (חיצים מסמנים קצוות סטנט). (B) תמונת OCT ממקטע של עורק כלילי עם סטנט. הקווים המקווקוים עוקבים אחר קצוות הסטנט והלומן, שמהם מחושב רסטנוזיס הסטנט באחוזים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות מייצגות מהיסטולוגיה ואימונוהיסטולוגיה סטנדרטיות. (A) כתם HE של סטנט מתכלה מחזיר כלילי 6 שבועות לאחר ההשתלה ו-(B) כתם RAM-11 עבור מקרופאגים של ארנב מסטנט מתכת חשוף שהושתל באבי העורקים של ארנב 6 שבועות קודם לכן. הקופסאות הריקות מייצגות תמוכות סטנט שנשטפו במהלך הליך הצביעה. חום כהה ב-(B) מציין מקרופאגים. קווי שגיאה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בעוד שהדור הנוכחי של סטנטים כליליים מכילים תרופות הוכיח את יתרונותיו, מכשירים חדשים מפותחים כדי להתאים טוב יותר לצרכים של מטופלים ואנשי מקצוע בתחום הבריאות. הסבב הראשון של פיגומים כליליים מתכלים לחלוטין עמד במספר אתגרים, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של בדיקת מכשירים חדשים בדגמים רלוונטיים מבחינה ביולוגית⁹. המודלים המוצגים כאן מספקים שתי אפשרויות לביצוע מחקר סטנטים. יש ליישם את המודל הכלילי והוא נדרש בדרך כלל למכשירים כליליים תוך-וסקולריים חדשים מכיוון שהאנטומיה והפיזיולוגיה הכליליים של החזיר דומים מאוד לאלו של בני אדם. המודל הטרשת מציע הזדמנות לחקור את השפעות הסטנט על דופן העורק, שכן המצב הקליני כמעט תמיד כרוך בנגע טרשת עורקים. מכיוון שקשה מאוד לגרום לטרשת עורקים בחזירים, יש צורך בשני מודלים שונים כדי לחקור את ביצועי הסטנט בעורק כלילי רלוונטי ובנגעים טרשת עורקים. זו גם המגבלה העיקרית של הדגמים המוצגים.

ניתן לשנות את לוחות הזמנים בהתאם לצרכי פרויקט המחקר. בדרך כלל, מעקב של 6 שבועות הוא ארוך מספיק כדי למצוא שינויים בין קבוצות המחקר בכל אחד ממודלים¹⁰. המודל הכלילי של חזיר משתמש בבעלי חיים גדלים, ולכן העורקים הכליליים ישתנו בקוטר עם הזמן. עם זאת, השתמשנו במודל לחקר מכשירים מתכלים עד 18 חודשים. מודל הארנב, לעומת זאת, מציע עורק מטרה בגודל קבוע, ומבחינה טכנית תקופות מעקב יכולות להיות באורך של 12 חודשים לפחות.

מודל החזיר מאפשר הדמיית מעקב עם אנגיוגרפיה ו-OCT למספר כמעט בלתי מוגבל של נקודות זמן. ההרדמה בטוחה, ועם טכניקה טובה ניתן לגשת לעורק הירך מספר פעמים. ניתן להשתמש גם בעורק הירך הנגדי. ניתן לצלם את הארנב בקלות באמצעות אנגיוגרפיה ו- IVUS רק מעורקי הצוואר. זה מאפשר רק נקודת זמן הדמיה אחת נוספת בנוסף לזמן הנחת הסטנט. ניתן לשנות את שני הדגמים כדי לחקור מגוון רחב של מכשירים תוך-וסקולריים⁸. המודלים ניתנים לשינוי בקלות כדי לחקור שיטות הדמיה תוך-וסקולריות חדשות מבוססות צנתר. אלה כוללים מערכות היברידיות IVUS-OCT וכן הדמיה פונקציונלית, כגון ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום.

המודלים דורשים מומחיות הן בהרדמה וטרינרית והן במשככי כאבים, כמו גם ניסיון בפרוצדורות כירורגיות וניתוחים תוך-וסקולריים. מלבד השלבים הקריטיים הללו במודלים של בעלי חיים, ההכנה להיסטולוגיה של רקמות קשות - כגון סטנטים כליליים מתכתיים - דורשת טיפול, במיוחד כאשר משתמשים בתמיסות בסיסיות מיוצבות ולא מיוצבות.

למחברים אין גילוי נאות.

המחברים מודים לסיוע המקצועי של Heikki Karhunen, Minna Törrönen ו-Riikka Venäläinen מהמרכז הלאומי לחיות מעבדה באוניברסיטת מזרח פינלנד. מחקר זה נתמך על ידי מענק הדגל של האקדמיה הפינית.