JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בדוח זה, אנו מתארים שיטת סיבוב כפול להכנת פלזמה עשירה בטסיות מופעלות (PRP). באמצעות תרומבין אוטולוגי, תרבבו תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs). PRP מופעל הוכח כמקדם התפשטות של hASCs.

Abstract

פלזמה פעילה עשירה בטסיות דם (PRP) שהוכנה מדם מלא באמצעות צנטריפוגה הדגימה השפעה מעוררת התפשטות בכמה סוגים של תאים מתורבתים, מה שמרמז על שימוש אפשרי ברפואה רגנרטיבית. כאן, נעשה שימוש בשיטת סיבוב כפול להכנת PRP מדם מלא. PRP הופעל עוד יותר על ידי תרומבין אוטולוגי. ספירת הטסיות נמדדה ב-PRP המופעל ונבדקה ההשפעה מעוררת התפשטות בתאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs). ספירת הטסיות שהתקבלה הייתה גבוהה פי 11.5 ב-PRP מאשר בפלזמת דם מלאה. התפשטות ה-hASCs הוגברה באופן ניכר על ידי דגירה עם 1% PRP. ניתן להשתמש בשיטה המתוארת להכנת PRP באופן חוזר עם ריכוז גבוה של טסיות דם. PRP שהוכן בשיטה זו מקדם באופן ניכר התפשטות של hASCs.

Introduction

פלזמה פעילה עשירה בטסיות דם (PRP) מוכנה על ידי צנטריפוגה של דם מלא והוכחה כמכילה טסיות דם הרבה מעל רמות הבסיס1. RPP אוטולוגי נמצא בשימוש נרחב בטיפול כירורגי, כולל ריפוי פצעים2, פגיעה בעצמות3 וניתוחים אסתטיים 4,5. לאחר הפעלת טסיות הדם ב-PRP, גרגירי α הקיימים בטסיות משחררים מספר גורמי גדילה, כגון גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF), גורם גדילה אפידרמלי (EGF), גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGFs), גורם גדילה טרנספורמטיבי בטא (TGF-β), גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) ואחרים 1,6,7. גורמי גדילה אלה ממלאים תפקיד חשוב בשגשוג תאים8, נדידה9 והתמיינות9.

עד כה, מספר מחקרים דיווחו על ההשפעה מעוררת התפשטות של PRP בסוגים שונים של תאים 10,11,12,13,14,15,16. אחד מסוגי התאים הללו הוא תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs); hASCs קיימים ברקמת השומן האנושית וניתן לאסוף אותם בקלות במספרים גדולים. ההשפעה הרגנרטיבית של hASCs מצביעה עוד על שימוש פוטנציאלי ביישומים קליניים8. המחקרים הקודמים שלנו דיווחו כי בהשוואה ל-PRP לא מופעל, ל-PRP מופעל הייתה השפעה פרוליפרטיבית ניכרת על hASCs ופיברובלסטים עוריים אנושיים (hDFs)8. בנוסף, דיווחנו כי PRP מקדם את התפשטות ה-hDFs באמצעות מסלול איתות ERK1/217. לאחרונה, דיווחנו גם כי PRP מקדם את התפשטות ה-hASCs דרך מסלולי האיתות ERK1/2, JNK ו-Akt18. ב-hASCs, PRP ממלא תפקיד חשוב כתוסף המקדם שגשוג. ידע על השפעת PRP על hASCs יסייע בפיתוח שיטות תרבית בקנה מידה גדול ויאפשר מחקרים נוספים על מנגנון ההתפשטות ב-hASCs.

בדוח זה אנו מציגים ומתארים שיטה להכנת PRP מדם מלא באמצעות צנטריפוגה. שיטה זו משתמשת בשיטת הסיבוב הכפול כדי להכין בקלות דגימה יציבה של PRP. כדי להעריך את התפקוד הביולוגי של PRP, מדדנו את ספירת הטסיות המרוכזת ואת הריכוז של מספר גורמי התפשטות. אישרנו גם את האפקט הממריץ של הגדילה על ידי שימוש ב-PRP המוכן לטיפוח hASCs.

Protocol

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת האתית של האוניברסיטה הרפואית קנסאי בהתאם להנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי משנת 1975. כל הדגימות נאספו ונעשה בהן שימוש בהסכמה מדעת של התורמים.

1. הכנה

  1. לאחר קבלת הסכמה מדעת, יש ליטול דם מתורמים בוגרים בריאים. כאן, נאסף דם מארבעה תורמי דם גברים בגילאי 28-38.
    1. ממליץ לתורמים לשתות 500 מ"ל מים 6 שעות לפני איסוף הדם.
      הערה: טווחי הייחוס להמוגלובין (Hb), ספירת תאי דם אדומים (RBC) וריכוז טסיות דם (PL) במבוגרים בריאים מתוארים על ידי Vajpayee19. על מנת להתאים לתרומת דם, בדיקת הדם של התורם נדרשת להיות בטווחים אלה.

2. איסוף דם

  1. בקש מתורמי הדם לשבת במהלך ההליך.
  2. ללבוש כפפות. הדקו חוסם עורקים על זרועו העליונה של התורם בזמן שהתורם מכה באגרוף.
  3. לאחר שנמצא וריד מתאים, יש לעקר את העור פעמיים עם 70% אלכוהול ולהחדיר את המחט.
  4. השתמש במזרק 21 גרם כדי לאסוף דם. אין לשחרר את חוסם העורקים במהלך שאיבת הדם.
    1. השתמש בצינור איסוף דם של 8.5 מ"ל כדי לאסוף את הדם. התבונן במצב הדם בצינור והחלף לצינור חדש ברגע שזרימת הדם מואטת.
    2. אסוף כמות מספקת של דם כדי להכין את ה-PRP. אסוף ארבע צינורות של דם נוגד קרישה בנפח כולל של 34 מ"ל. הפוך את הצינורות 10 פעמים כדי לערבב את הדם עם נוגד הקרישה.
    3. השתמש בצינור איסוף דם בסרום של 10 מ"ל (ראה טבלת חומרים) ללא נוגד קרישה כדי לאסוף דם לייצור המפעיל (ראה שלב 4). אסוף 10 מ"ל של דם שאינו נוגד קרישה.

3. שיטת סיבוב כפול להכנת PRP

  1. קח 40 מיקרוליטר של דם מלא נוגד קרישה לספירת טסיות הדם. השתמש בקצות פיפטות מסוננות כדי להגן על הפיפטה מפני זיהום דם.
  2. צנטריפוגה הדם המלא נוגד הקרישה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 450 x גרם וטמפרטורת החדר. זהו הספין הראשון להשגת דגימות דם בשכבות. השכבה העליונה היא חלק הפלזמה, השכבה האמצעית היא סירת באפי הדקה, והשכבה התחתונה ביותר מורכבת מתאי דם אדומים.
  3. השתמש בטוש כדי ליצור קו ב -2 מ"מ מתחת למעיל האפי.
  4. השתמש במזרק של 20 מ"ל עם צינורית ארוכה כדי לאסוף את הפלזמה רק עד לסימון 2 מ"מ מתחת למעיל האפי. הפלזמה הצהובה עם פרווה באפי מכילה טסיות דם, לויקוציטים וכמה אריתרוציטים. אסוף את הפלזמה משני צינורות לתוך צינור איסוף דם בסרום. שלב את התוכן של 4 צינורות ל-2 צינורות לנפח כולל של 16 מ"ל פלזמה שנאספה.
  5. צנטריפוגה של הפלזמה עם מעיל באפי למשך 5 דקות ב-1,600 x גרם וטמפרטורת החדר. זה הספין השני. הסופרנטנט של דגימות הדם השכבתיות הוא פלזמה דלה בטסיות דם (PPP).
  6. השתמש במזרק של 20 מ"ל עם צינורית ארוכה כדי להעביר את ה-PPP לצינור איסוף דם בסרום של 50 מ"ל המכיל 1 מ"ל נוזל כמידה. טסיות דם שהצטברו בגלולת הטרומבוציטים בפלזמה הנותרת של 1 מ"ל שימשו כ-PRP. הנפח הכולל של PRP שנאסף היה 2 מ"ל.
  7. מערבל את ה-PRP בכל צינור ולאחר מכן אגר לצינור אחד (סה"כ 2 מ"ל).
  8. קח 400 מיקרוליטר של ה-PRP לספירת טסיות דם.
  9. יש לצרף את ה-PRP למספר צינורות של 1.5 מ"ל, המכילים כ-400 מיקרוליטר בכל צינור. יש בסך הכל ארבעה צינורות. מומלץ כ-500 מיקרוליטר PRP לכל צינור.

4. הכן את המפעיל

  1. אפשר ל-10 מ"ל דם ללא נוגד קרישה בצינור איסוף דם בסרום (שלב 2.3.3) לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. צנטריפוגה דגימת הדם ללא נוגד קרישה למשך 8 דקות ב-2,015 x גרם וטמפרטורת החדר בצנטריפוגה במעבדה.
  3. אסוף את הסופרנטנט כטרומבין אוטולוגי.
  4. מערבבים 0.5 M CaCl2 ותרומבין אוטולוגי ביחס של 1:1 (v/v) כמפעיל. לדוגמה, 500 מיקרוליטר של CaCl2 מעורבב עם 500 מיקרוליטר של תרומבין אוטולוגי. צור נפח כולל של 1 מ"ל של המפעיל.

5. הפעלת PRP

  1. מערבבים PRP והמפעיל ביחס של 10:1 (v/v). מערבבים 400 מיקרוליטר של PRP עם 40 מיקרוליטר של המפעיל בכל צינור של 1.5 מ"ל, ולאחר מכן מדגרים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. זהו PRP מופעל בצורה קרושה.

6. אחסון PRP

  1. צנטריפוגה הפעילה PRP ב-9,000 x גרם למשך 10 דקות בצנטריפוגה מעבדתית של 4 מעלות צלזיוס.
  2. אסוף את הסופרנטנט באמצעות פיפטה למזרק בנפח מתאים.
  3. מסננים את הסופרנטנט דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר.
  4. אחסן את ה-PRP הסופי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

7. מדידת ריכוזי טסיות דם ורמות מקדמי גדילה

  1. ספרו את מספר הטסיות בפלזמה שלמה וב-PRP באמצעות מערכת המטולוגיה אוטומטית (ראו טבלת חומרים).
  2. לנתח ריכוזים של רמות PDGF-BB, IGF ו-EGF בפלזמה שלמה ו-PRP מופעל באמצעות ערכות ELISA זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).

8. בדיקת התפשטות תאים

  1. בודד hASCs בשיטה שתוארה קודם לכן18.
    1. זרעי hASCs בצפיפות של 1.0 x 104 תאים לבאר בצלחות תרבית של 24 בארות ודוגרים ב-DMEM המכיל 10% FBS ואנטיביוטיקה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. השתמש ב-hASCs מקטעים 7-9 בניסויים.
  2. החלף את המדיה הסלולרית ב-DEM ללא סרום. לאחר 6 שעות, הוסף PRP בריכוזים המיועדים ודגר עוד יותר במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. דגירה עם תמיסת WST-8 (ראה טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ספיגת קריאה ב-450 ננומטר עם קורא צלחות מרובה בארות.
  4. בנה עקומה סטנדרטית: זרעים hASCs בצפיפות של 0, 6,250, 12,500, 25,000, 50,000 ו-100,000 תאים/באר בלוחות של 24 בארות ב-DMEM עם 10% FBS למשך 3 שעות. קרא את הספיגה ב-450 ננומטר לאחר הדגירה עם תמיסת WST-8 למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס
    1. צייר את העקומה הסטנדרטית על ידי התוויית מספר התאים לעומת A450 ננומטר.
  5. הערך את מספר ה-hASCs מהספיגה על סמך העקומה הסטנדרטית.

תוצאות

ריכוזים מועשרים של טסיות דם ו-PDGF-BB ב-PRP
ריכוזי טסיות הדם ו-PDGF-BB ב-PRP עלו פי 11.5 ופי 25.9, בהתאמה, גבוהים כמו אלה בפלזמה שלמה. עם זאת, ריכוזי ה-EGF ב-PRP לא השתנו ו-IGF היה רק 70% מזה של פלזמה שלמה (טבלה 1). הניסויים שוחזרו ארבע פעמים בשיטת הסיבוב הכפול.

Discussion

לאחר הפעלת PRP, מספר גורמי גדילה, כגון PDGF, EGF, IGF, TGF-β ו-VEGF 1,6,7 "מפעילים" תאים ורקמות של פצעים המקדמים ריפוי פצעים20,21. במקרה של ניתוח שחזור קוסמטי, תאים מופעלים הוכחו כגורמים לריפוי ומשפרים את ה?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

לא ישים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20 mL Syringe, Terumo syringe lock typeTerumo, Tokyo, Japan.SS-20LZP
50 mL Tube, Polypropylene Conical TubeCorning, NY, USA.352070
Automated Hematology SystemSysmex Corp., Tokyo, JapanXE-2100
Blood Collection Needle, SafeTouch PSV set with luer adapter, 21 G x 3/4”Nipro, Osaka, Japan.32-384
Blood Collection Tube, ACD Solution A Blood Collection Tube, 8.5 mLBD Vacutainer, NJ, USA.364606
Blood Collection Tube, Serum Blood Collection Tube/monovette, 10 mLBD Vacutainer, NJ, USA.366430
Calcium Chloride, 1 mEq/ mL,Otsuka Pharmaceutical Factory, Tokushima, Japan.3215400A1061
Cannula, BS non-bevel needle, 18 G (1.2 mm) x 75 mmBS Medical, Tokyo, Japan.BS-81007Not for sale
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, JapanCK04
CentrifugeKokusan, Tokyo, Japan.H-19F
CentrifugeEppendorf, Hamburg, Germany.5415R
EnSpire 2300 Multilabel ReaderPerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA
Filter UnitMerck Millipore, Co. Cork, Ireland.SLGP033RS
Human EGF Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADEG00
Human IGF-I Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA KitR&D Systems, Minneapolis, MN, USADBB00
Pipette Tip, ART 1000 Reach Barrier TipThermo Scientific, MA, USA.2079-05-HR
Pipette, Nichipet EXII 100-1000 μLNichiryo, Saitama, Japan.00-NPX2-1000
Sterling Nitrile Power-Free Exam GlovesKimberly-Clark50707
Yamazen Alcohol for DisinfectionYamazen Pharmaceutical, Osaka, Japan.A7L07

References

  1. Eppley, B. L., Woodell, J. E., Higgins, J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 114 (6), 1502-1508 (2004).
  2. Salcido, R. S. Autologous platelet-rich plasma in chronic wounds. Advances in Skin & Wound. 26 (6), 248 (2013).
  3. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 85 (6), 638-646 (1998).
  4. Bhanot, S., Alex, J. C. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plastic Surgery. 18 (1), 27-33 (2002).
  5. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 107 (1), 238 (2001).
  6. Eppley, B. L., Pietrzak, W. S., Blanton, M. Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 147-159 (2006).
  7. Lubkowska, A., Dolegowska, B., Banfi, G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 26, 3-22 (2012).
  8. Kakudo, N., et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 122 (5), 1352-1360 (2008).
  9. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Medical Molecular Morphology. 47 (2), 83-89 (2014).
  10. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair and Regeneration. 10 (5), 336-340 (2002).
  11. Lucarelli, E., et al. Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells. Biomaterials. 24 (18), 3095-3100 (2003).
  12. Kilian, O., et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. European Journal of Medical Research. 9 (7), 337-344 (2004).
  13. Kanno, T., Takahashi, T., Tsujisawa, T., Ariyoshi, W., Nishihara, T. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (3), 362-369 (2005).
  14. Gruber, R., et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets. 15 (1), 29-35 (2004).
  15. Koellensperger, E., von Heimburg, D., Markowicz, M., Pallua, N. Human serum from platelet-poor plasma for the culture of primary human preadipocytes. Stem Cells. 24 (5), 1218-1225 (2006).
  16. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25 (5), 1270-1278 (2007).
  17. Hara, T., et al. Platelet-rich plasma stimulates human dermal fibroblast proliferation via a Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Journal of Artificial Organs. 19 (4), 372-377 (2016).
  18. Lai, F., et al. Platelet-rich plasma enhances the proliferation of human adipose stem cells through multiple signaling pathways. Stem Cell Research and Therapy. 9 (1), 107 (2018).
  19. Vajpayee, N., Graham, S. S., Bem, S. Basic examination of blood and bone marrow. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22, 509-535 (2011).
  20. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound. 24 (4), 176-181 (2011).
  21. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  22. Cervelli, V., et al. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP. BioMed Research International. 2013, 434191 (2013).
  23. Gentile, P., et al. Platelet-Rich Plasma and Micrografts Enriched with Autologous Human Follicle Mesenchymal Stem Cells Improve Hair Re-Growth in Androgenetic Alopecia. Biomolecular Pathway Analysis and Clinical Evaluation. Biomedicines. 7 (2), (2019).
  24. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 3 (6), 406 (2015).
  25. Gentile, P., Casella, D., Palma, E., Calabrese, C. Engineered Fat Graft Enhanced with Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells for Regenerative Medicine: Clinical, Histological and Instrumental Evaluation in Breast Reconstruction. Journal of Clinical Medicine. 8 (4), (2019).
  26. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and Potentiality of Human Adipose-Derived Stem Cells (hASCs) Obtained from Enzymatic Digestion of Fat Graft. Cells. 8 (3), (2019).
  27. Scioli, M. G., Bielli, A., Gentile, P., Cervelli, V., Orlandi, A. Combined treatment with platelet-rich plasma and insulin favours chondrogenic and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in three-dimensional collagen scaffolds. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (8), 2398-2410 (2017).
  28. Marx, R. E., Garg, A. K. . Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma. , (2005).
  29. Kakudo, N., Kushida, S., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma: the importance of platelet separation and concentration. Plastic and Reconstructive Surgery. 123 (3), 1135-1136 (2009).
  30. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Medical Molecular Morphology. 44 (4), 233-236 (2011).
  31. Kushida, S., et al. Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison of seven commercial separation systems. Journal of Artificial Organs. 17 (2), 186-192 (2014).
  32. Morimoto, N., et al. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with a gelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol. British Medical Journal Open. 5 (5), 007733 (2015).
  33. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y., Kusumoto, K. Utilization of Platelet-Rich Plasma for a Fistula With Subcutaneous Cavity Following Septic Bursitis: A Case Report. Eplasty. 15, 31 (2015).
  34. Eby, B. W. Platelet-rich plasma: harvesting with a single-spin centrifuge. Journal of Oral Implantology. 28 (6), 297-301 (2002).
  35. Castillo, T. N., Pouliot, M. A., Kim, H. J., Dragoo, J. L. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. The American Journal of Sports Medicine. 39 (2), 266-271 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PRPHASCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved