Nos recherches visent à comprendre les mécanismes immunitaires sous-jacents à la pathogenèse de la fibrose pulmonaire. L’un des plus grands défis dans le domaine reste de traduire des modèles in vitro et in vivo en fibrose pulmonaire humaine. Il existe un certain nombre de modèles animaux pour étudier la fibrose pulmonaire.
Nous cherchons à normaliser l’un des modèles les plus couramment utilisés, le modèle murin de bléomycine, afin qu’il soit facilement adaptable à d’autres laboratoires. Nous présentons une méthode peu invasive, hautement reproductible et sûre d’administration de la bléomycine dans le modèle murin de fibrose pulmonaire. Ce modèle animal complète in vitro les études humaines.
Il implique l’analyse des types de cellules critiques pour la pathogenèse et reproduit physiologiquement les changements de ventilation, de perfusion et d’échange gazeux qui se produisent lors d’une lésion. Nous prévoyons que les interventions qui réduisent considérablement la gravité histopathologique in vivo pourraient indiquer de meilleurs résultats cliniques. Procéder à la préparation des solutions de bléomycine dans une hotte chimique tout en suivant les précautions chimiothérapeutiques appropriées.
Dissoudre d’abord la poudre de bléomycine dans du PBS stérile pour préparer une concentration de stock de 10 unités par millilitre. En fonction de la bléomycine spécifique utilisée et de l’objectif de l’expérience, préparer la concentration de travail finale selon la dose requise en fonction du poids corporel. Pour ajuster le volume final d’administration, diluez la bléomycine à 0,375 unité par millilitre, assurant un volume total de 50 millilitres pour une souris de 25 grammes.
Suspendez la souris correctement anesthésiée sur la plate-forme procédurale à un angle de 60 à 80 degrés en la suspendant par ses incisives avant pour ouvrir efficacement l’oropharynx. Obstruez le passage nasal à l’aide d’une pince microvasculaire lisse pour forcer la respiration par l’oropharynx. À l’aide d’une pince, rétractez la langue de l’oropharynx.
À l’aide d’une pipette pas à pas avec une pointe de leurre, placez doucement le volume désiré de bléomycine ou de sérum physiologique à l’arrière de l’oropharynx. Assurez-vous qu’une bulle de liquide visible est grossièrement apparente. Continuez à maintenir la langue en place jusqu’à ce que la souris aspire la solution, ce qui est visible et souvent audible.
Une fois l’aspiration confirmée, retirez soigneusement le pince-nez. Observez la souris en position suspendue pendant 15 secondes pour éviter tout reflux de la solution de bléomycine avant de la remettre dans sa cage. Placez ensuite l’animal sur le côté dans sa cage avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir la thermo neutralité.
Pincez doucement les orteils et assurez-vous que les animaux restent euthermiques pour faciliter le réveil. Surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles retrouvent leur pleine conscience, ce qui prend généralement une à deux heures en fonction de la dose de kétamine, de la taille et du métabolisme de l’animal. Surveillez cliniquement les souris quotidiennement pour détecter les changements de poids corporel, de toilettage, de niveau d’activité et d’état respiratoire.
Le poids de la piste est un marqueur clé de l’efficacité du modèle. Au moment opportun, prélevez les poumons des souris correctement euthanasiées. Pour l’histologie, disséquez les poumons en bloc et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 heures.
Procédez à l’enrobage, à la section et à la coloration à la paraffine à l’aide d’hématoxyline et d’éosine ou de trichrome de Masson. Pour mesurer le collagène soluble, homogénéisez le poumon droit. Pour la cytométrie en flux, digérer le poumon droit à l’aide d’un dissociateur tissulaire et d’une solution enzymatique pour obtenir une suspension unicellulaire.
Effectuer la coloration et l’analyse par cytométrie en flux selon les protocoles standard. Par rapport au contrôle PBS, des modifications fibrotiques dans les septa alvéolaires et de petites zones inflammatoires ou fibrotiques ont été observées dans des échantillons de poumons traités à la bléomycine au septième jour. Au 14e jour, des régions fibrotiques plus grandes et plus confluentes sont apparues avec une destruction significative de l’architecture alvéolaire normale.
Au 21e jour, les changements fibrotiques ont persisté sans augmentation plus significative. Le système de notation Ashcroft modifié a confirmé que les niveaux de fibrose étaient similaires entre les jours 14 et 21. Les dosages d’hydroxyproline effectués le 14e jour ont démontré une augmentation de la teneur totale en collagène soluble dans les poumons traités à la bléomycine par rapport au témoin.
L’analyse quantitative de l’amplification en chaîne par polymérase a montré une régulation à la hausse des gènes profibrotiques Col1A1 et TGFB en réponse à la bléomycine. L’analyse par cytométrie en flux a révélé une infiltration robuste de cellules myéloïdes, y compris les macrophages interstitiels, les macrophages alvéolaires dérivés des monocytes et les neutrophiles dans les poumons.
