Dans notre laboratoire, nous développons de nouvelles technologies de mesure pour la biologie à l’échelle nanométrique. Nous nous concentrons particulièrement sur le développement de la microscopie à force atomique à grande vitesse pour étudier les processus biologiques dynamiques à l’échelle nanométrique. Et pour cela, nous avons récemment développé un nouveau mode d’imagerie, que nous appelons Photothermal Off Resonance Tapping, ou PORT.
Dans ce mode, nous utilisons un laser d’entraînement dédié pour actionner les porte-à-faux très contrôlés à grande vitesse, ce qui nous permet d’obtenir les données et jusqu’à deux ordres de grandeur plus rapidement qu’avec le taraudage conventionnel hors résonance. La référence en matière d’AFM à grande vitesse est l’imagerie en mode résonant. Dans ce mode, le cantilever est actionné à cette fréquence de résonance, ce qui signifie que la position du cantilever ne peut pas être contrôlée, seulement son amplitude d’oscillation.
Pour l’AFM à vitesse normale, les modes hors résonance sont de plus en plus courants. Cependant, la fréquence d’actionnement est limitée ici, ce qui rend ces modes d’imagerie assez lents. En utilisant un laser secondaire pour actionner le cantilever, nous pouvons atteindre des fréquences d’actionnement plus élevées, ce qui signifie des vitesses d’imagerie plus élevées.
Cette approche nous permet de conserver les avantages associés aux autres modes de dotation en personnel hors résonance, ce qui signifie que nous pouvons optimiser l’équilibre entre la sensibilité et la vitesse de l’image. Nous sommes limités dans la vitesse d’imagerie par le portrait le plus élevé. Si nous souhaitons augmenter le portrait, nous devons augmenter la puissance du laser afin de maintenir la même amplitude d’actionnement.
Cela peut entraîner un mauvais contrôle de la force et endommager l’échantillon. L’amélioration de la bande passante des porte-à-faux en réduisant leur taille et en améliorant l’efficacité de l’absorption laser nous permettra d’atteindre des débits de port plus élevés tout en assurant un dégagement adéquat de l’échantillon. Cette avancée facilitera des taux d’imagerie plus rapides, ce qui est crucial pour examiner les subtilités de la dynamique d’assemblage.
Pour commencer, nettoyez et préparez les porte-à-faux. Montez les porte-à-faux sur un support compatible avec la microscopie électronique à balayage ou le système MEB. Chauffez ensuite le gaz précurseur à utiliser sur le système d’injection de gaz pour faire pousser la nouvelle pointe.
Une fois que le vide atteint moins 10 à la puissance moins cinq millibars, purgez la conduite d’injection de gaz 10 fois pendant deux secondes chacune pour éliminer tout air résiduel de la ligne de buse. Utilisez le MEB pour localiser l’extrémité du porte-à-faux. Inclinez le support à un angle pour aligner correctement le cantilever pour l’imagerie par microscopie à force atomique.
Ajustez la position et la mise au point du MEB pour une vue claire de la pointe du cantilever où la pointe nano de carbone sera développée. Ensuite, définissez les paramètres de dépôt dans le logiciel pour faire pousser la nouvelle pointe. Lancez le processus de dépôt pour faire grossir la pointe avec un rayonnement du faisceau d’électrons sur la pointe en porte-à-faux tout en injectant le gaz précurseur et arrêtez l’injection de gaz une fois le dépôt terminé.
Effectuez une imagerie MEB post-croissance pour évaluer la qualité et les caractéristiques de l’extrémité nouvellement développée, y compris son rayon et sa longueur. Retirez le support de la chambre SEM. Pour commencer, préparez un microscope à force atomique à grande vitesse.
À l’aide d’une pince à épiler, placez un porte-à-faux ultra court sous le clip à ressort du support en porte-porte-à-faux. À l’aide d’une seringue, ajoutez 50 microlitres de liquide par l’orifice d’accès au liquide gauche. Utilisez ensuite trois boutons sur la tête AFM pour aligner le laser de lecture sur le cantilever.
Observez l’ombre du porte-à-faux sur un papier blanc tout en maximisant la somme. Centrez ensuite le spot laser sur la photodiode à l’aide des deux boutons dédiés. Ensuite, cochez la case d’excitation activée dans l’excitation VI pour allumer et aligner le laser d’entraînement, en actionnant et en faisant osciller le cantilever.
Affichez les signaux d’excitation et de déviation en porte-à-faux sur un oscilloscope. Utilisez la méthode de l’ombre et maximisez l’amplitude d’oscillation avec les boutons de réglage du laser d’entraînement. Pour régler l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux dans le port, ajoutez une tension continue au circuit de commande de la diode laser dans la boîte de configuration de l’excitation VI et entrez l’entrée AC crête à crête pour le circuit de commande de la diode laser.
Pour obtenir des courbes d’interaction, réglez le VI du contrôleur Z en mode contact et cliquez sur Démarrer pour vous approcher de la surface de l’échantillon. Une fois la surface atteinte, effectuez une courbe force en fonction de la distance dans la rampe VI pour l’étalonnage de la sensibilité à la déflexion en porte-à-faux. Cliquez sur retirer pour rétracter le piézo Z de la surface que la pointe ne peut pas atteindre.
Après une rétraction complète, passez en mode port dans le contrôleur Z VI et allumez le laser d’excitation dans l’excitation VI.Réglez le mode port sur la fréquence souhaitée. Des courbes d’interaction claires ont été obtenues en soustrayant l’oscillation libre de l’oscillation de contact, cruciale pour l’imagerie non destructive des échantillons biologiques. À une fréquence de port de 100 kilohertz, une bonne qualité d’image a été obtenue.
Cependant, à mesure que la fréquence d’excitation s’approchait de la résonance en porte-à-faux, le contrôle par rétroaction se détériorait, entraînant des courbes d’interaction obscurcies et une dégradation de la qualité de l’image. Pour commencer, préparez une solution de 10 millimolaires d’acétate de magnésium. À l’aide d’une seringue Hamilton, injectez 50 microlitres de solution dans le canal fluidique du support en porte-porte-à-faux, créant ainsi une goutte de liquide qui enveloppe le porte-à-faux.
Réglez la taille de balayage dans le VI de balayage sur 800 par 800 nanomètres et le débit de ligne sur 100 hertz. Pour numériser la surface, cliquez sur la flèche du cadre pour vérifier la qualité. Après le balayage, cliquez sur retirer dans le VI du contrôleur Z pour rétracter le porte-à-faux de la surface.
À l’aide d’une seringue Hamilton, retirez la solution tampon du support en porte-à-faux. Préparez ensuite une solution d’ADN dilué à trois points en étoile et injectez 50 microlitres de cette solution dans le support en porte-à-faux. Effectuez l’imagerie avec une zone de 800 par 800 nanomètres à une fréquence de ligne par défaut de 100 hertz.
Après le balayage initial, ajustez la taille et la vitesse de l’imagerie et balayez le VI aux valeurs spécifiées pour une acquisition de données ultérieure. Maintenez l’entrée du point de consigne dans la boîte de point de consigne du VI du contrôleur Z au niveau le plus bas nécessaire pour un suivi précis tout au long du processus d’imagerie. Répétez cette opération pour toutes les zones d’échantillonnage requises. En utilisant ce protocole, l’assemblage en temps réel de motifs d’étoiles à trois points d’ADN en îlots stables a été observé par AFM portuaire à grande vitesse.
Des images claires ont été obtenues à des débits de ligne de 100 et 200 hertz pour un débit de port de 100 kilohertz. Cependant, des vitesses d’imagerie plus élevées sans augmentation des fréquences de port réduisent la qualité de l’image en raison des changements rapides de topographie. Les résultats d’imagerie de l’ADN étoile à trois points pour l’entrée AC la plus basse de crête à crête ont montré des structures intactes, tandis que l’entrée AC de crête à crête la plus élevée a entraîné des dommages observables de l’échantillon en raison de forces plus élevées.
De même, l’entrée de décalage CC la plus basse a révélé des structures intactes, tandis que l’entrée de décalage CC la plus élevée a causé des dommages structurels.
