Culture primaire de faible densité facile et reproductible utilisant un stock congelé de neurones embryonnaires de l’hippocampe

Les stocks congelés de neurones embryonnaires de rat sont prêts à l’emploi et aucune technique avancée n’est nécessaire pour cultiver les cellules. Cette technique est très facile et vous n’avez besoin d’aucune autorisation pour l’expérimentation animale, l’organisation d’animaux gravides chronométrés ou la dissection d’embryons. Les neurones peuvent être cultivés dans d’autres vaisseaux de culture et appliqués à d’autres types d’expériences.

Par exemple, des plaques matricielles à microélectrodes pour des expériences électrophysiologiques. Commencez par recouvrir une microplaque de 96 puits avec 100 microlitres de poly-L-lysine par puits. Ensuite, incuber les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, retirer la solution de poly-L-lysine. Lavez les assiettes deux fois avec de l’eau stérilisée et une fois avec un milieu de culture frais sans supplément. Placez les assiettes à sécher.

Les assiettes sèches peuvent être emballées et stockées jusqu’à un mois à quatre degrés Celsius. Pour commencer l’ensemencement cellulaire, ajoutez 50 microlitres du milieu de culture à chaque puits dans les plaques enrobées. Remplissez les puits périphériques avec 200 microlitres d’eau stérilisée et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Retirez le flacon cryogénique de neurones du réservoir d’azote liquide et placez-le dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius pour décongeler partiellement son contenu. À l’aide d’une pipette d’un millilitre avec une pointe de large alésage, transférez lentement le contenu des flacons goutte à goutte dans un tube stérile de 50 millilitres. Rincez le flacon cryogénique vide avec un millilitre de milieu de culture à température ambiante.

Transférer la solution de rinçage dans le tube de 50 millilitres contenant la suspension cellulaire. Ensuite, ajoutez neuf millilitres du milieu de culture à température ambiante goutte à goutte dans le tube de 50 millilitres, ce qui porte le volume à 11 millilitres. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, transférer la suspension cellulaire dans un réservoir.

Maintenant, à l’aide d’une pipette multicanal avec des pointes de large alésage, distribuez la suspension cellulaire avec un compte final de 1,0 fois 10 à quatre cellules par puits dans la plaque de 96 puits revêtue. Incuber les neurones pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, remplacez le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de culture préchauffé et incuber à nouveau dans les mêmes conditions.

Après quatre jours in vitro, ajouter la cytosine bêta-D-arabinofuranoside à la concentration finale de 0,2 micromolaire par puits pour réduire la croissance des cellules gliales. Replacez l’assiette dans l’incubateur. Après 21 jours in vitro, traiter les cellules avec les médicaments d’intérêt.

Pour maintenir un contrôle positif, traiter les cellules avec 100 micromolaires de glutamate par puits pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius avant la fixation. Avant d’effectuer des études immunocytochimiques, fixez les cellules pendant 20 minutes en remplaçant la solution de culture par 100 microlitres de paraformaldéhyde dans chaque puits. Après la fixation, laver les puits deux fois avec 250 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate par puits pendant cinq minutes chacun.

Dans la présente étude, les neurones ont été développés normalement sans échanger le milieu de culture pendant trois semaines. L’immunohistochimie a révélé des épines dendritiques positives à la drébrine le long des dendrites MAP2-positives. La réduction dose-dépendante des densités des grappes de drebrine contre la stimulation du glutamate a été observée.

La greffe de la suspension cellulaire avant qu’elle ne devienne trop chaude est très importante. L’ajout goutte à goutte de milieu de culture est également crucial pour éviter un changement soudain de l’osmolarité.