Les variantes structurelles telles que les insertions, les suppressions, les duplications et les inversions ont été dans le passé plus difficiles à suivre expérimentalement, et leurs fréquences ne peuvent pas être mesurées avec précision par séquençage d’amplicon. Ici, nous fournissons une technique simple et rentable, qui associe la conception d’amorce triple et l’électrophérèse capillaire parallèle pour suivre les fréquences des allèles des variantes structurelles au fil du temps. Cette méthode a été conçue pour compléter le séquençage des paramètres dans l’évolution expérimentale et pour retracer les fréquences des allèles émergents de novo.
Nous espérons que cette méthode profitera également à ceux qui travaillent avec des données sur les agents pathogènes intra-hôtes. La démonstration de la procédure sera assurée par Jeanne Hamet, une assistante de recherche de notre laboratoire. Les différentes étapes des méthodes seront montrées dans un cas où l’allèle dérivé résulte d’une insertion d’IS10 dans un gène bactérien appelé mutS.
Commencez par concevoir une paire d’amorces pour amplifier un amplicon court sur l’allèle de type sauvage autour du site d’insertion mutant. Concevez une troisième amorce avant deux dans la séquence d’insertion pour produire une légère variable de taille à partir de l’amplicon de type sauvage. Commencez par extraire l’ADN de cultures de 24 heures de clones d’allèles sauvages et mutants fixes.
Après avoir quantifié l’ADN, diluez chaque extrait d’ADN à cinq nanogrammes par microlitre avec de l’eau. Fixez les deux échantillons dans un rapport 50/50. Mettez en place une réaction de 20 microlitres contenant 10 nanogrammes d’échantillon d’ADN, d’amorces et de mélange principal PCR.
Ensuite, séparez le produit PCR par électrophorèse, à l’aide d’un gel d’agarose à 2%. La différence de taille entre les amplicons du type sauvage et le mutant doit être vérifiée sur le gel. Pour obtenir une courbe d’étalonnage, commencez par mélanger l’ADN de type sauvage et l’ADN mutant dans différents ratios.
Diluer les produits PCR à 0,1 nanogramme par concentration de microlitre. Pour préparer le gel de séparation, mélanger le gel frais et le colorant. Remplacez le tampon d’entrée (inlet buffer).
Placez le tampon de rinçage à l’emplacement correct du tiroir de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle. Ajouter 22 microlitres du marqueur de diluant aux puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez maintenant deux microlitres de produits PCR dilués à chaque puits d’échantillon.
À un puits, ajoutez une échelle de taille d’ADN à partir d’un kit haute sensibilité, allant de une à 6 000 paires de bases. Placez la microplaque dans l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle en exécution sélective sur le logiciel de l’instrument. Analysez les résultats à l’aide du logiciel d’analyse de données.
Tout d’abord, identifiez les pics en fonction de leur taille connue. Quantifier chaque amplicon pour produire une courbe d’étalonnage. Enfin, vérifiez que les quantités relatives des deux allèles sont correctement mesurées.
Cette courbe d’étalonnage est ensuite utilisée pour calculer la quantité de variantes structurelles après amplification PCR et électrophorèse capillaire parallèle. Ces résultats représentatifs font suite à une insertion perturbatrice dans le gène mutS. Les knockdowns et mutS conduisent à un phénotype hyper mutateur, permettant aux bactéries d’échantillonner plus de mutations que leur taux de mutation de base.
En utilisant la méthode présentée, la fréquence de la variante structurelle mutS a été suivie sur 1000 générations. Une trajectoire non monotone de l’allèle mutant émergent a été révélée. L’allèle mutant a été détecté pour la première fois à la génération 680.
L’allèle a ensuite rapidement augmenté en fréquence, atteignant 67% à la génération 713. Cette augmentation a ensuite stagné, n’augmentant que de 10% au cours des 53 générations suivantes, à 76%De manière inattendue, la fréquence des allèles mutants a ensuite diminué de 76% à 49% au cours de 13 générations, après quoi elle a augmenté jusqu’à la fixation. Cette méthode profitera à ceux qui travaillent sur l’évolution expérimentale.
Ce protocole permet à l’utilisateur de prendre des archives figées et d’explorer des trajectoires évolutives qui ne sont autrement pas observables avec des données de séquençage des points finaux.
