Notre protocole permet de visualiser le métabolisme spatial des interactions microbiennes qui se produisent pendant l’infection. Nous avons développé ce flux de travail de spectrométrie de masse d’imagerie pour les co-cultures bactériennes cultivées sur gélose et modèles tissulaires. L’analyse de substrats non traditionnels tels que les cultures bactériennes cultivées sur gélose présente de nombreux défis.
En utilisant notre protocole, les échantillons bactériens peuvent être séchés de manière appropriée pour faciliter l’application de la matrice MALDI dans l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse par imagerie. Cette méthode est largement applicable à une variété de métabolites, d’agents pathogènes microbiens ou de maladies, et de types d’échantillons pour lesquels une mesure spatiale de la biochimie cellulaire ou tissulaire est souhaitée, en particulier lors de l’étude de types d’échantillons nécessitant une déshydratation avant l’analyse. Après avoir préparé les macrocolonies de culture bactérienne, retirez du matériau d’emballage les colonies bactériennes d’agarose montées sur des lames de microscope revêtues d’ITO.
Placer les échantillons dans une boîte sèche avec dessiccant pendant 48 à 72 heures à température ambiante. Inspectez visuellement les colonies à la recherche de déformations dans la surface de la gélose. Ensuite, fermez la conduite de vide de la chambre d’échantillonnage et allumez l’interrupteur d’alimentation de la pompe à palettes rotatives pour permettre à la pompe à vide de se réchauffer et d’atteindre une pression de vide appropriée.
Allumez le transformateur à tension variable pour chauffer le filament de fil enroulé autour de la chambre. Ajustez l’alimentation variable jusqu’à ce que la température interne de la chambre à vide atteigne environ 50 degrés Celsius. Pendant que la pompe se réchauffe, placez une boue de glace sèche et d’éthanol à 100 % dans le condenseur du piège à froid.
Ouvrez la chambre à vide à l’aide d’une clé pour desserrer les pinces à double bride en tissu de 16 millimètres. Insérez les échantillons d’agarose dans la chambre et scellez hermétiquement la chambre avec les pinces à bride en tissu double de 16 millimètres. Ouvrez ensuite la vanne de la pompe pour évacuer la chambre et laissez les échantillons sécher pendant 60 à 120 minutes.
Lorsque vous avez terminé, évacuez lentement la chambre à vide à la pression ambiante en fermant la vanne de la pompe à palettes rotatives et en ouvrant la bride de vide à l’air ambiant. Ouvrez la chambre comme démontré précédemment et retirez l’échantillon d’agarose séché de la chambre. Utilisez la matrice MALDI 1 ,5-diaminonaphtalène pour sa désorption favorable et son ionisation des acides aminés et son mode d’ions négatifs.
Fixez l’échantillon au plateau du pulvérisateur et chargez les solutions préparées dans la ligne de pulvérisation. À l’aide du logiciel informatique, spécifier les paramètres nécessaires pour un revêtement uniforme du composé matriciel. Surveillez la séquence de pulvérisation jusqu’à ce qu’elle soit terminée.
Retirez l’échantillon du plateau du pulvérisateur et conservez-le dans une armoire de dessiccation jusqu’à l’analyse. Insérez l’échantillon revêtu de matrice dans l’adaptateur de lames de microscope à plaque cible MALDI. Inscrire au moins trois marqueurs fiduciaires qui englobent la zone d’échantillonnage à l’aide de marqueurs permanents.
Utilisez un scanner à plat pour acquérir une image optique de la lame de microscope, y compris les marqueurs fiduciaires. Définissez maintenant une méthode d’instrument de spectrométrie de masse telle que décrite dans le manuscrit. En mode ion négatif, sélectionner la fenêtre de masse de 100 daltons de masse par charge 100 à 200 pour l’enrichissement du signal en phase gazeuse en utilisant une approche d’accumulation continue d’ions sélectionnés qui englobe les valeurs masse par charge des métabolites d’intérêt.
Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images de l’instrument et utilisez l’assistant de configuration pour définir le nom et l’emplacement du fichier, le mode d’acquisition MS, les régions d’intérêt à échantillonner et la résolution spatiale de l’image. Enseignez l’échantillon en utilisant les marqueurs fiduciaires de l’image optique pour le synchroniser avec le support d’échantillon de l’instrument. Définissez ensuite les régions d’intérêt sur l’image optique à l’aide de l’outil de sélection des régions d’intérêt du logiciel.
Une fois tous les paramètres définis, démarrez la séquence d’acquisition pour acquérir en série un spectre de masse à chaque pixel dans la région d’intérêt définie. Après l’acquisition de l’image, enregistrez les données avec une extension de fichier MIS, un format de fichier spécifique au fournisseur pour les plates-formes de spectrométrie de masse d’imagerie. Ouvrez le fichier de données dans des packages logiciels flexImaging ou SCiLS, ou exportez-le vers un format de données non propriétaire tel que mzML et visualisez à l’aide d’un logiciel indépendant du fournisseur.
À l’aide du logiciel de référence, définissez des fenêtres de masse pour les pics d’intérêt afin de générer des cartes thermiques en fausses couleurs des distributions d’ions dans les régions échantillonnées. Sur l’affichage du spectre de masse moyen, effectuez un zoom avant sur le pic d’intérêt et sélectionnez une fenêtre de masse appropriée qui englobe la zone du profil de crête. Maintenant, faites un clic droit sur la fenêtre de masse en surbrillance et sélectionnez Ajouter un filtre de masse.
Étiqueter la masse sélectionnée par valeur de charge en utilisant l’identification provisoire du métabolite suspecté déterminée par la mesure de masse précise à haute résolution. Sélectionnez le seuil d’intensité pour ajuster la plage dynamique de l’image de l’analyte affichée par la carte thermique en fausses couleurs. Ajustez davantage les paramètres de filtrage de masse de sorte que la fenêtre de masse englobe la zone du profil de crête, puis ajoutez le filtre de masse.
Nettoyez tout l’équipement de cryosectionnement en le rinçant avec de l’éthanol à 100% et laissez sécher avant de placer les échantillons dans la chambre du cryostat. Préparez des lames de microscope revêtues d’ITO à l’aide d’un ohmmètre pour identifier le côté de la lame avec le revêtement conducteur. À l’aide d’un scribe à pointe de diamant, gravez et étiquetez le côté recouvert d’ITO de la lame de microscope.
Effectuez ensuite la cryosectionnement sur un cryomicrotome de recherche. Transférer les tissus céca de souris intégrés dans les OCT d’un congélateur à 80 degrés Celsius dans la chambre cryomicrotome sur glace sèche. À l’intérieur de la chambre du cryomicrotome, monter le tissu incorporé dans les OCT sur un mandrin d’échantillon à l’aide d’une solution OCT supplémentaire.
Une fois que la solution OCT s’est solidifiée, fixer le mandrin à la tête de l’échantillon et commencer la cryosection par incréments de 10 à 50 micromètres pour atteindre la profondeur tissulaire ou le plan souhaité de l’organe. Une fois qu’une section transversale optimale du tissu est atteinte, commencez à collecter des sections à 12 micromètres d’épaisseur. Manipulez délicatement la tranche à l’aide de pinceaux d’artiste et placez-la sur une lame de microscope recouverte de téflon.
Pour ramasser le tissu de la lame recouverte de téflon, roulez la lame de microscope recouverte d’ITO sur la section de tissu. Décongelez la section de tissu sur la lame de microscope en appuyant la paume à l’arrière de la lame revêtue d’ITO. Continuez à décongeler jusqu’à ce que la section de tissu passe d’une texture translucide à une texture opaque ou mate.
Pour une analyse le jour même, transférer les lames de microscope montées sur tissu sur de la glace sèche dans une boîte sèche avec dessiccant pour le stockage. Effectuez l’application matricielle MALDI et la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI comme démontré précédemment. Analysez les images ioniques provenant de plusieurs réplications biologiques et comparez les résultats pour une signification via des comparaisons de diagrammes en boîte d’intensité à l’aide du logiciel statistique SCiLS.
L’analyse MALDI en mode ion négatif d’échantillons de culture bactérienne permet de détecter des dizaines de métabolites. Des mesures de masse précises à haute résolution permettent d’identifier provisoirement l’ornithine et l’arginine. Les régions de mesure pour l’analyse par spectrométrie de masse par imagerie sont représentées.
La spectrométrie de masse par imagerie de ces échantillons permet de cartographier l’espace des métabolites d’acides aminés ornithine et arginine qui se révèlent altérés et localisés différentiellement en présence d’Enterococcus faecalis. La morphologie tissulaire du ceca de souris infectée a été visualisée à l’aide d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Des images optiques de tissus céca de souris après application d’une couche matricielle MALDI 1 ,5-diaminonaphtalène sont montrées.
Les images ioniques MALDI pour l’ornithine et l’arginine montrent des distributions spatiales uniques dans les échantillons de tissus. La considération la plus importante pour ce protocole est de maintenir un séchage et une manipulation en douceur des échantillons de culture bactérienne afin de minimiser les bulles, les fissures et autres déformations de l’échantillon. Après la spectrométrie de masse par imagerie, des analyses par microscopie à fond clair et par fluorescence d’échantillons de tissus peuvent être effectuées pour évaluer la morphologie des tissus.
Cela peut également permettre une validation ciblée des voies moléculaires à l’aide de méthodes d’imagerie basées sur les anticorps.
