Ce protocole peut être utilisé pour mieux comprendre la dynamique et les rôles des phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial des mammifères. Ce protocole surmonte la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines à partir de deux contextes physiologiquement pertinents, les processus faciaux de souris et les cellules de mésenchyme palatale embryonnaire de souris cultivées. Il est impératif d’agir rapidement tout en gardant tous les réactifs et matériaux sur la glace et d’utiliser des inhibiteurs de phosphatase dans tous les tampons de lyse pour maintenir l’intégrité des protéines phosphorylées.
Pour commencer, posez le corps de la souris sur une planche de dissection avec le côté ventral tourné vers le haut et vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez ensuite la cavité abdominale en pinçant et en soulevant la peau antérieure à l’ouverture vaginale avec une pince Semken droite. Ensuite, coupez la peau soulevée en couches sous-jacentes avec des ciseaux chirurgicaux à lame droite à un angle de 45 degrés de chaque côté pour générer une forme en V qui s’étend à chaque surface latérale à peu près à mi-chemin entre les quatre membres et les membres postérieurs.
À l’aide de la pince Semken, saisissez l’une des cornes utérines et coupez sous l’oviducte et au-dessus du col de l’utérus avec des ciseaux chirurgicaux. Pour permettre l’élimination complète de la corne utérine, coupez le mésomètre, puis transférez la corne utérine disséquée à 10 millilitres de PBS histologique dans une boîte de Petri de 10 centimètres. De même, retirez la deuxième corne utérine du côté opposé de la cavité abdominale.
Ensuite, placez la boîte de Petri de 10 centimètres contenant les deux cornes utérines sur de la glace. Sous un stéréomicroscope disséquant, disséquez soigneusement chaque embryon des cornes utérines avec une pince fine Dumont 5. Ensuite, retirez lentement le myomètre, la décidua et le chorion.
Ensuite, déchirez et retirez l’amnion relativement transparent entourant l’embryon et coupez le cordon ombilical reliant l’embryon au placenta. Ensuite, transférez chaque embryon disséqué à 2,5 millilitres de PBS histologique dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits sur glace à l’aide d’un tuyau de transfert en plastique coupé. Préparez trois boîtes de Petri de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS histologique et conservez-les sur de la glace pour les utiliser en rotation entre les embryons.
Ensuite, transférez un embryon d’un puits individuel de la plaque de culture cellulaire de 12 puits à l’une des boîtes de Petri de 10 centimètres avec l’histologie PBS sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupée. Sous le microscope à dissection, séparez chaque processus maxillaire du visage à l’aide de la pince fine en faisant d’abord une coupe sur le côté antérieur d’un processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus nasal latéral dans le processus maxillaire. Ensuite, coupez la face postérieure du processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus maxillaire et le processus mandibulaire.
Ensuite, séparez complètement le processus maxillaire en faisant une coupe verticale des côtés antérieur à postérieur du processus maxillaire du côté oculaire du processus maxillaire où les indentations naturelles référencées ci-dessus se terminent. À l’aide d’une pipette Pasteur de neuf pouces avec une petite ampoule en latex de deux millilitres, transférez la paire disséquée de processus maxillaires dans une petite gouttelette d’environ 30 microlitres de PBS histologique dans une boîte de Petri étiquetée de 35 millimètres sur de la glace. Transférez ensuite la paire de tissus maxillaires dans un tube de microcentrifugation marqué de 1,5 millilitre sur de la glace à l’aide de la pipette Pasteur, minimisant ainsi le transfert de PBS histologique.
De plus, retirez tout excès de PBS histologique dans le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec la pipette Pasteur. Ajouter 0,1 millilitre de tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant utilisation sur glace. Puis pipette de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres.
Ensuite, vortexez pendant 10 secondes, puis pipetez de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres, tout en évitant la génération de bulles. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube. Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres.
Tout d’abord, aspirez le milieu des cellules de mésenchyme palatal embryonnaire de souris à l’aide d’une pipette Pasteur de 5,75 pouces fixée à un système de vide. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS de culture tissulaire glacé et inclinez la plaque sur le côté lors du dernier lavage pour vous assurer que tout le PBS de culture tissulaire est aspiré. Ensuite, ajoutez un tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant l’utilisation sur la glace pour lyser les cellules.
Incuber la plaque sur de la glace pendant cinq minutes avec une rotation d’environ toutes les minutes pour assurer une couverture complète de la plaque. Ensuite, grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellules pré-refroidi et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge pré-refroidi de 1,5 millilitre sur de la glace. Ensuite, incuber la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube.
Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres. L’analyse par transfert western de lysats de cellules entières provenant de cellules palatines embryonnaires immortalisées de souris après stimulation par ligand PDFG-B de 2 à 15 minutes a révélé des bandes reproductibles distinctes pour les phosphoprotéines qui courent à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante. Une augmentation de l’intensité de la bande des phosphoprotéines a été observée lors du traitement avec un facteur de croissance par rapport à celles des cellules non traitées, tandis que les intensités totales de la bande protéique étaient relativement égales entre les échantillons.
Ce protocole peut être utilisé pour sonder comment les perturbations et la phosphorylation influencent directement la signalisation intercellulaire, l’expression des gènes et l’activité cellulaire dans des contextes craniofaciaux.
