Ce protocole décrit les techniques utilisées pour produire le virus de la maladie de Newcastle afin qu’il puisse être administré en toute sécurité aux souris et à d’autres animaux tels que les hamsters et les moutons. L’utilisation de la filtration à flux tangentiel permet de traiter plus efficacement de grands volumes de départ par rapport aux procédures existantes qui n’utilisent que des procédés de centrifugation. Il s’agit d’une longue procédure impliquant plusieurs étapes complexes, ce qui signifie que la gestion du temps peut être un problème.
Je recommanderais d’identifier toutes les étapes de pause potentielles afin que la technique puisse être divisée de manière appropriée, minimisant ainsi le stress. Alex, un assistant de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour la purification du virus de la maladie de Newcastle ou NDV, commencez par amorcer le système expérimental précédemment défini en y faisant passer 50 millilitres de PBS.
Arrêtez la pompe lorsqu’environ cinq millilitres de PBS sont laissés dans le tube. Ensuite, fixez un filtre de profondeur avec un indice de rétention micromolaire de un à trois sur le tube. Pour évacuer le filtre, retirez le deuxième bouchon du côté épique du filtre de profondeur, puis commencez à faire passer 50 millilitres supplémentaires de PBS dans le système.
Une fois que le PBS commence à circuler à travers l’évent situé en haut du filtre, fermez le port et continuez à faire circuler le PBS à travers les lignes. Après cela, remplacez le récipient à déchets par un nouveau récipient de collecte stérile et commencez à faire passer le fluide allantoïque à travers le filtre de profondeur. Ensuite, configurez le système de filtration à flux tangentiel ou TFF dans une confirmation ouverte et exécutez-le comme décrit dans le manuscrit.
Lorsqu’il reste environ cinq millilitres de fluide dans le réservoir, mettez la pompe en pause et ajoutez du liquide allantoïque filtré en profondeur au réservoir. Reprenez ensuite le débit de la pompe. Pour éviter le cisaillement du virus, il est important de s’assurer que la pression du système ne dépasse pas 10 livres de force par pouce carré.
Pour augmenter l’illusion, une combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et de la pince C doit être utilisée. 150 à 100 millilitres de liquide allantoïque sont laissés dans le réservoir, mettent la pompe en pause et échangent le tampon en ajoutant 150 à 200 millilitres de tampon ML. Encore une fois, mettez la pompe en pause lorsque cinq à 10 millilitres de liquide sont laissés dans le réservoir, puis en utilisant deux pinces C, fermez la taille.
Découplez la ligne rétendue alimentant le réservoir et insérez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, reprenez l’écoulement et faites une pause lorsqu’il reste quelques gouttes de liquide dans le réservoir du réservoir. Ensuite, retirez les pinces C des conduites de déchets et rattachez la conduite d’alimentation en place au réservoir du réservoir.
Pendant ce temps, pour se préparer à l’ultracentrifugation du gradient de densité de l’iodixanol, ajoutez d’abord un 0,5 millilitre de 40% d’iodixanol à un tube ultra centrifugeuse à paroi mince à toit ouvert de 13,2 millilitres. Ensuite, préparez la colonne avec des ajouts successifs de 2,5 millilitres de 20% d’iodixanol et de 2,5 millilitres de 10% d’iodixanol. Avant l’ultracentrifugation, ajoutez soigneusement six à 6,5 millilitres de la solution virale évoquée du système TFF à la colonne d’iodixanol sans perturber le gradient.
Après ultracentrifugation, retirez les tubes avec une paire de pinces stériles. La bande cible doit être une grande bande entre les gradients de 10 et 20 %. Ensuite, suspendez le tube sur le dessus d’un bécher à l’aide d’un support d’autoclave.
Après cela, attachez une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 à une seringue de cinq millilitres, puis perforez le côté du tube d’ultracentrifugation avec l’aiguille et retirez la bande cible en étendant lentement le piston. Après avoir retiré l’iodixanol de la solution virale décrite dans le manuscrit, utilisez une seringue pour injecter soigneusement le virus dans une cassette de dialyse. Pour concentrer la solution virale, retirez la cassette de dialyse du tampon de dialyse et placez-la dans un petit sac en plastique scellable.
Ajoutez ensuite 15 à 25 millilitres de polyéthylène glycol à 40% dans le sac afin que la cassette de dialyse soit complètement immergée. Après la dialyse, rincez brièvement la cassette de dialyse avec du PBS. Ensuite, remplissez une seringue équipée d’une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 avec de l’air, insérez la seringue dans la cassette de dialyse et poussez le piston.
Faites pivoter l’appareil pour éliminer le virus sans retirer l’air introduit. Pour déloger le virus résiduel adhérant à la membrane, massez soigneusement la membrane avec des doigts gantés sans l’endommager. Pour faciliter le processus de délogement, retirez une partie de l’excès d’air dans la cassette de dialyse.
Pour les tests de contrôle de la qualité, diluez d’abord la solution virale 100 fois en ajoutant 10 microlitres à 990 microlitres de PBS dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, continuez la dilution en série en ajoutant 100 microlitres de la dilution précédente à 900 microlitres de PBS. Pour les tests d’infection, ajoutez 20 microlitres de chaque illusion à chaque puits d’une plaque de 96 puits.
Avant d’examiner l’effet cytopathique de la protéine de fluorescence verte, ou d’effectuer un test d’immunofluorescence indirecte, incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 48 heures. En utilisant ce protocole, le NDV hautement purifié a été obtenu, comme l’a démontré l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de sulfate de sodium des protéines virales. L’infectiosité du virus purifié par cette méthode a également été vérifiée par la dose d’infection par culture tissulaire de 50% ou le test TCID50 effectué dans 96 plaques de puits.
Le TCID50 a été déterminé à partir du nombre de puits positifs pour chaque dilution à l’aide du calculateur Spearman-Karber. Le test d’infection a révélé la différence entre les effets cytopathiques du VND lentogène et mésogénique sur les cellules DF one dans différentes conditions après 10 et 24 heures d’incubation. Le test immuno florence s’est également avéré efficace pour étudier l’infection des cellules Vero par le VND lentogène.
Lors de l’amorçage du système expérimental, assurez-vous que les lignées sont amorcées efficacement, car tout hydroxyde de sodium résiduel inactivera le virus. Il est également important de maintenir l’intégrité de la membrane, car compromettre cela nuira considérablement à la purification et au rendement du virus.
