En utilisant notre protocole, nous pouvons visualiser et évaluer quantitativement la dynamique des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs et sensoriels de souris anesthésiées vivantes. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre la physiologie basale des axones in vivo et révéler un important mécanisme pathologique à l’origine de la neurodégénérescence périphérique dans un modèle murin de la maladie. Notre technique peut être utilisée pour évaluer l’effet de traitements potentiels tels que les agents pharmacologiques et les thérapies géniques sur le transport axonal dans les neurones moteurs et sensoriels vivants.
Cette technique peut être utilisée pour imager simultanément différents organites dans un axone nerveux périphérique spécifique et relayer l’étude de modèles de maladies motrices ainsi que le vieillissement. Commencez les préparations en tirant une micropipette en verre graduée pour des injections intramusculaires optimales dans les muscles plus petits. Pour la chirurgie, fixez un drap chirurgical stérile sur un tapis chauffant réglé à 37 degrés Celsius et positionnez et concentrez le microscope opératoire.
Ensuite, déballez tous les outils et instruments chirurgicaux requis comme décrit dans le manuscrit. Lorsque les préparations sont terminées, transférez la souris anesthésiée à l’embout buccal situé dans une zone séparée de l’espace chirurgical et assurez-vous que les réflexes de retrait de la cornée et de la pédale sont absents avant de raser la fourrure de la zone chirurgicale. Ensuite, retirez la fourrure rasée de la souris en utilisant le côté collant du ruban chirurgical.
Ensuite, placez la souris sur des balances pour enregistrer le poids pré-chirurgical. Ensuite, utilisez un coton-tige pour appliquer du lubrifiant pour les yeux et transférez la souris et l’embout buccal dans la zone chirurgicale. Pour injecter le tibialis antérieur, ou muscle TA, placez la souris sur le dos et étirez le membre postérieur à 10 degrés de la ligne médiane.
Lorsque le membre postérieur est dans la bonne position, placez un ruban chirurgical sur le pied. Stériliser la zone rasée à l’aide d’une solution à 70 % d’éthanol ou d’une solution équivalente. Dessinez le fragment toxique de travail de tétanos, de neurotoxine ou de solution de HcT dans une micropipette en verre tirée.
Ensuite, faites une petite incision sur le muscle d’intérêt dans la zone qui correspond aux régions du moteur et de la plaque. Alors. percer le fascia externe sur le muscle pour injecter le HcT. Laissez la micropipette en position pendant cinq à 10 secondes avant de vous retirer lentement.
Après l’injection, fermez les incisions avec un à deux points de suture. Ensuite, transférez la souris dans une cage de récupération isolée sous observation pendant 30 minutes. Préparez-vous à exposer le nerf sciatique en disposant les outils et instruments chirurgicaux autour de la zone chirurgicale.
Créez un coin en coupant un parafilm dans un rectangle étroit de largeur d’un centimètre avec une pointe inclinée pour faciliter le processus d’imagerie. Une fois les préparations terminées, transférez la souris sur l’embout buccal dans la zone chirurgicale et utilisez du ruban chirurgical pour fixer la tête à l’embout buccal. Étendez et fixez le membre postérieur ciblé à 45 degrés de la ligne médiane avec du ruban chirurgical.
Si les réflexes de retrait de la cornée et de la pédale sont absents, coupez la peau recouvrant le nerf sciatique à l’aide de ciseaux. Ensuite, retirez le muscle fémoris du biceps sus-jacent et la musculature ou le tissu conjonctif sans endommager le nerf sciatique et les vaisseaux sanguins. Lorsque le nerf sciatique intact est suffisamment exposé, appliquez une solution saline stérile préchauffée sur la zone autour du nerf sciatique pour éviter la dessiccation.
Ensuite, utilisez des pinces incurvées pour perturber le tissu conjonctif profond et placez le coin de parafilm pré-préparé sous le nerf. Placez du coton imbibé de solution saline sur la zone exposée avant de déplacer la souris sur le tapis chauffant dans la chambre à induction remplie d’isoflurane et d’oxygène. Pour l’imagerie, placez un verre de couverture de 22 x 64 millimètres sur l’étage de microscope personnalisé et fixez la position du verre de couverture avec un ruban adhésif.
Après avoir appliqué de l’huile d’immersion sur l’objectif, connectez l’étage du microscope au microscope inversé et soulevez lentement l’objectif immergé dans l’huile pour entrer en contact avec le verre de couverture. Lorsque la configuration est prête, fixez l’embout buccal de l’anesthésique sur l’étage du microscope à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, retirez le coton du nerf sciatique et transférez la souris de la chambre d’induction à l’embout buccal avec le nerf exposé face au verre de couverture.
Fixez la tête de la souris à l’embout buccal et, tout en maintenant le niveau d’anesthésie adéquat le plus bas, soulevez doucement la souris par la queue pour ajouter une solution saline stérile au glissement de couverture près du nerf sciatique exposé. À l’aide des oculaires, localisez le nerf sciatique pour déterminer le point focal optimal et sélectionnez une zone d’intérêt contenant des organites axonaux mobiles. Ensuite, passez au logiciel informatique en cliquant sur le bouton Acquisition et en sélectionnant une zone d’intérêt.
Utilisez le zoom numérique pour obtenir un grossissement de 80 fois et faites pivoter la zone sélectionnée pour visualiser les axones horizontalement Cliquez sur la zone Régions et sélectionnez une région rectangulaire d’intérêt. En mode Acquisition, définissez la taille d’image sur un minimum de 1024 x 1024 pixels et commencez l’acquisition en accéléré de 100 à 1 000 images. Capturez un minimum de 10 cargaisons mobiles à partir des trois axones par souris.
Dans l’étude, un marquage axonal-spécifique moteur in vivo a été réalisé à l’aide de souris transgéniques. La protéine de floraison verte améliorée, ou expression eGFP, dans les axones moteurs cholinergiques a été observée à partir d’un ChAT vivant anesthésié. Souris eGFP.
Avec la méthode alternative, tdTomato expression dans un nerf fraîchement excisé d’un ChAT. tdTomato souris a été atteint sans traitement tissulaire supplémentaire. De plus, les axones ont été identifiés en injectant des traceurs ou des marqueurs tels que hcT ou des adénovirus codant pour l’eGFP dans les muscles squelettiques.
L’analyse représentative démontre une série d’images en accéléré représentant le transport axonal in vivo d’endosomes de signalisation dans les motoneurones vivants d’un HB9. Souris GFP. Le GFP avait un modèle plus granulaire dans HB9.
Axones GFP. L’élevage de Mito. Souris CFP avec ChAT.
tdLes souris tTomato ont permis la visualisation des mitochondries dans les axones moteurs. De plus, le nœud de Ranvier a également pu être identifié. L’injection de HcT dans les muscles du Mito.
Les souris CFP ont permis la visualisation simultanée d’endosomes de signalisation et de mitochondries dans les mêmes axones in vivo. Des organites en mouvement antérograde et rétrograde, ainsi que des organites bloqués, ont été observés. Une anesthésie réduite pendant le processus d’imagerie est avantageuse car elle peut limiter l’impact des gros artefacts respiratoires et ainsi simplifier le suivi et l’analyse du transport axonal.
Les nerfs sciatiques peuvent être instructifs pour l’analyse de l’ARN et des protéines afin de corréler la dynamique des organites avec les composants clés de la machinerie de transport axonal, tels que les protéines motrices et les adaptateurs spécifiques à la cargaison.
