L’isolement des champignons entomopathogènes est important pour le développement d’un biopesticide et peut être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. L’utilisation d’appâts à insectes pour isoler les champignons entomopathogènes est considérée comme une méthode peu coûteuse et très efficace. le chloramphénicol, le thiabendazole, le cycloheximide, les milieux artificiels n’utilisent pas de dodine et nécessitent moins d’espace dans le processus d’échantillonnage du sol.
Les étapes critiques comprennent l’étude des plaques CTC après une et deux semaines pour empêcher d’autres champignons de se rétrécir et les champignons entomopathogènes en développement, puis l’identification des colonies de champignons entomopathogènes en fonction de leur macromorphologie et de leur micromorphologie. Commencez par collecter 800 grammes de sol à une profondeur de 10 centimètres à l’aide d’une petite pelle. Conservez les échantillons dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience.
De petites racines peuvent également être collectées car les champignons entomopathogènes sont connus pour avoir une compétence rhizosphère. Pour isoler les champignons à l’aide de chloramphénicol, de thiabendazole, de cycloheximide ou de milieu artificiel sélectif CTC, peser 0,35 gramme de l’échantillon de sol avec ou sans racines. Placez cet échantillon dans un microtube de 1,5 millilitre.
Lorsque vous travaillez dans une armoire de biosécurité, ajoutez un millilitre de suspension aqueuse stérile de 0,01 % de volume de polyoxyéthylène sorbitan à la suspension aqueuse contenant du microtube contenant du sol et vortexez le tube pendant 30 secondes. Une fois terminé, retirez et pipetez 50 microlitres du surnageant sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Utilisez ensuite une spatule stérile Drigalski de six millimètres de diamètre pour disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu.
Incuber les plaques dans des chambres climatiques à 25 degrés Celsius et un minimum de 80% d’humidité relative dans l’obscurité. Après sept, 14 et 21 jours d’incubation, observez les plaques pour la croissance des colonies fongiques. Isoler les champignons à l’aide de galleria mellonella désinfectés en surface et de larves de Stade avancé de Tenebrio molitor comme appâts pour insectes.
Immerger la larve dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute pour la stérilisation. Ensuite, lavez les larves deux fois avec de l’eau stérile. Assemblez les appâts dans des pots en plastique avec 10 petits trous de 10 millimètres de diamètre dans le couvercle contenant 250 grammes du sol collecté.
Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol et analyser les pots quotidiennement, à la recherche d’insectes morts. Après avoir retiré les insectes morts du pot, stérilisez superficiellement les insectes avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant une minute. Pour favoriser la mycose, placez les insectes stériles dans une chambre humide à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius pendant sept jours.
Sur la mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte et, à l’aide de la boucle microbiologique, placez les conidies sur un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre contenant 0,05% de chloramphénicol ou de milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Et incuber les plaques de culture dans une chambre climatique comme expliqué précédemment.
Après 14 jours d’incubation, identifiez les espèces EPF en analysant les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques telles que décrites dans le manuscrit. Ensuite, transférez les conidies aériennes dans des cultures de glissement pendant trois jours à 80% d’humidité relative et 25 degrés Celsius. Après trois jours, colorez la lame avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques.
Au microscope optique, observez les structures fongiques telles que l’arrangement, les conidiophores, la forme et la taille des conidies à 400 fois et confirmez l’identification EPF. Dans l’étude, 51 souches EPF des espèces Metarhizium et Beaveria ont été isolées à partir de 524 échantillons de sol. L’analyse représentative montre les caractéristiques micromorphologiques de quelques isolats d’espèces de Metarhizium et de Beaveria.
La présence d’EPF dans les 24 échantillons de sol a été étudiée à l’aide de trois méthodes d’isolement différentes. L’appât Galleria mellonella s’est avéré plus efficace dans l’isolement, suivi de l’appât tenebrio molitor et du milieu CTC. Les mêmes 24 échantillons de sol n’ont montré aucune récupération d’espèces de Beaveria, mais seulement de Metarhizium.
Les choses les plus importantes à retenir sont le transfert des conidies aériennes sur une couche de lame en observant les caractéristiques du microscope et en confirmant l’identification des champignons entomopathogènes à l’aide de clés morphologiques. D’autres méthodes comprennent l’utilisation d’autres milieux artificiels sélectifs avec un produit chimique spécifique pour réduire la croissance de contaminants tels que la dodine. La recherche de nouveaux isolats fongiques avec des caractéristiques de contrôle biologique exceptionnelles est cruciale pour accroître l’efficacité des champignons dans la lutte contre les arthropodes nuisibles et explorer d’autres questions dans le domaine de la pathologie des invertébrés.
