Cette méthode est un outil précieux dans le domaine de la biologie cellulaire pour évaluer les niveaux de ROS cellulaires dans les cellules primaires vivantes cultivées in vitro en tant qu’organoïdes à l’aide d’une sonde fluorogénique. Le principal avantage de cette technique est que les ROS peuvent être visualisées qualitativement dans des organoïdes intestinaux intacts par microscopie et analysées quantitativement dans des cellules dissociées par cytométrie en flux à l’aide de plaques de 96 puits. Cette méthode peut être appliquée à d’autres modèles organoïdes et d’autres capteurs fluorescents peuvent être utilisés pour analyser différentes voies cellulaires.
Avant d’appliquer ce protocole pour la première fois, l’expérimentateur doit se familiariser avec la culture organoïde et le passage. Bien que notre protocole soit bien adapté aux approches de dépistage, les débutants devraient commencer par quelques échantillons. Sophie Dulauroy, une ingénieure du laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Après avoir sacrifié une souris Lgr5-GFP âgée de 8 à 10 semaines, collectez cinq à huit centimètres du jéjunum englobant la région située entre le duodénum et l’iléon, et placez-la dans du DPBS froid complété par des antibiotiques sur la glace. Ensuite, nettoyez le contenu intestinal en rinçant avec cinq à 10 millilitres de DPBS froid contenant des antibiotiques. Ensuite, à l’aide de ciseaux à pointe de bille, ouvrez l’intestin longitudinalement et, à l’aide de pinces, transférez le tissu dans une boîte de Petri contenant du DPBS froid avec des antibiotiques.
Secouez le tissu à l’intérieur du plat pour le rincer. Ensuite, attrapez l’intestin par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et transférez-le dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’EDTA froid de 10 millimolaires. Inverser le tube trois fois et l’incuber sur de la glace pendant 10 minutes.
Après l’incubation, transférer le tissu dans un tube contenant 10 millilitres de DPBS et de vortex pendant deux minutes. Ajoutez immédiatement 10 microlitres de la fraction dans une boîte de Pétri et utilisez un microscope pour évaluer la qualité de la fraction. Après deux transferts dans des tubes contenant du DPBS avec un vortex de deux minutes entre chaque transfert, incuber l’intestin dans de l’EDTA sur de la glace pendant cinq minutes, comme démontré précédemment.
Après trois transferts successifs dans des tubes contenant du DPBS avec un vortex de trois minutes entre chaque transfert, combinez les meilleures fractions dans un tube de 50 millilitres en inversant les tubes sélectionnés trois fois et en filtrant à travers une passoire cellulaire de 70 microns. Ensuite, faites tourner les cryptes, jetez le surnageant et perturbez mécaniquement la pastille avant d’ajouter cinq millilitres de DMEM F12 froid. Comptez manuellement le nombre de cryptes présentes dans une aliquote de 10 microlitres au microscope.
Après avoir compté, faites tourner à nouveau les cryptes et retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, perturbez mécaniquement la pastille et ajoutez un milieu de culture de croissance au tube pour obtenir une concentration de 90 cryptes par microlitre. Ensuite, ajoutez deux volumes de matrice de membrane basale non diluée ou BMM pour obtenir une concentration finale de 30 cryptes par microlitre et pipetez soigneusement la suspension de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.
Pour l’analyse par cytométrie en flux, la plaque 10 microlitres des cryptes BMM se mélangent comme un dôme au centre de chaque puits d’une plaque à fond rond préchauffée de 96 puits. Et pour l’imagerie, déposez 10 microlitres du mélange sous forme de couche mince dans une chambre à microslide préchauffée de huit puits. Après avoir laissé le BMM se solidifier à température ambiante pendant cinq minutes, placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après 15 minutes, ajoutez 250 microlitres de milieu de croissance dans chaque puits, en prenant soin de ne pas détacher le BMM, et placez la plaque dans l’incubateur. Pour visualiser le stress oxydatif par microscopie confocale, ajoutez un microlitre de solution mère de n-acétylcystéine dans les puits correspondants de la chambre à huit puits de microslide plaquée d’organoïdes. Après une incubation d’une heure, ajouter un microlitre de solution mère d’hydroperoxyde de tert-butyle dans les puits correspondants et incuber pendant 30 minutes supplémentaires.
Ensuite, ajoutez un microlitre de la dilution de 1,25 millimolaire de la sonde fluorogénique par puits, suivi d’un microlitre de 1,25 milligramme par millilitre de solution de Hoechst. Après une autre incubation de 30 minutes, retirez le milieu sans perturber le BMM et ajoutez doucement 250 microlitres de DMEM chaud sans rouge phénol. Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une chambre thermique et d’une alimentation en gaz qui détecte la sonde fluorogénique.
À l’aide du contrôle positif, configurez l’intensité du laser et l’exposition temporelle pour le signal ROS, et vérifiez que ce signal est plus faible dans le contrôle négatif. Ensuite, à l’aide d’un oculaire, filtrez la diapositive pour identifier les organoïdes exprimant GFP et ajuster l’intensité du laser. Mettez en place une pile z de 25 micromètres et définissez des positions pour obtenir une image cousue de l’organoïde entier afin d’obtenir une section des organoïdes montrant une couche de cellules.
Ajouter un microlitre de la solution mère de n-acétylcystéine dans les puits témoins négatifs de la plaque inférieure ronde de 96 puits contenant les organoïdes. Après une incubation d’une heure, ajouter une solution mère d’hydroperoxyde de tert-butyle microlitre dans les puits correspondants et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, retirez le fluide sans perturber le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque inférieure ronde de 96 puits.
Gardez cette assiette de côté. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine et en utilisant une pipette multicanal, pipette de haut en bas cinq fois pour détruire le BMM. Après une courte incubation de cinq minutes, dissociez les organoïdes en pipetant de haut en bas une deuxième fois.
Faites tourner la plaque et jetez le surnageant en inversant la plaque. Ajoutez le milieu précédemment recueilli dans une autre plaque de 96 puits dans les puits correspondants et remettez en suspension les cellules en pipetant cinq fois de haut en bas. Ensuite, ajoutez un microlitre de la sonde fluorogénique et incubez pendant 30 minutes.
Ensuite, faites tourner à nouveau la plaque et remettez en suspension les cellules avec 250 microlitres de solution de DAPI. Transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie en flux et maintenez les tubes sur la glace. Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur les tensions de contrôle et laser non colorées pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons monocolores.
Ensuite, à l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée, collectez un minimum de 20 000 événements. Des images confocales représentatives de la coloration ROS et des organoïdes ont montré qu’en présence de l’inhibiteur NAC, seul le signal des cellules mortes contenues dans la lumière de l’organoïde est visible. Dans l’organoïde non traité, les niveaux de ROS basaux peuvent être observés, en particulier dans les cellules GFP positives, prouvant que les cellules souches produisent des ROS plus élevées que les cellules différenciées.
Les cellules GFP positives présentent un signal cytoplasmique plus important avec l’inducteur en présence de la sonde fluorogénique, démontrant que les niveaux de ROS augmentent particulièrement dans les cellules souches après le traitement. L’analyse par cytométrie en flux de la production de ROS dans les organoïdes intestinaux montre que les niveaux de ROS basaux diminuent après stimulation avec inhibiteur et augmentent après provocation avec inducteur. Les cellules prétraitées avec un inhibiteur puis stimulées avec un inducteur présentent des niveaux inférieurs à ceux stimulés avec un inducteur seul.
Une analyse similaire sur les cellules souches contrôlées comme GFP positives montre une diminution de 3,5 fois du taux de ROS lors du traitement inhibiteur et une multiplication par quatre lors du traitement inducteur par rapport aux cellules non stimulées. Lorsqu’ils tentent cette procédure, les utilisateurs doivent se rappeler de limiter le stress cellulaire lors de la manipulation et de la dissociation organoïdes. De plus, les témoins positifs et négatifs doivent toujours être inclus lors de l’analyse des ROS.
Après cette procédure, l’analyse peut être complétée par une coloration par immunofluorescence sur des organoïdes intacts fixes, le tri cellulaire et l’analyse de l’expression génique pour obtenir des informations supplémentaires sur la régulation des ROS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devez savoir comment cultiver des organoïdes intestinaux murins, effectuer une analyse d’imagerie en direct d’organoïdes intacts et traiter les organes intestinaux pour l’analyse de cytométrie en flux.
