Les méthodes décrites dans ce protocole fourniront une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des ICM pour les études de reprogrammation cardiaque. Le flux de calcium est exclusivement observé dans les ICM et fournit un moyen d’évaluer la maturation fonctionnelle de l’ICM. Cette souche de souris simplifie les procédures d’évaluation et améliore la reproductibilité des résultats.
Ce protocole est une nouvelle méthode pour évaluer la maturation fonctionnelle des ICM dans le domaine de la reprogrammation cardiaque. Il peut également être appliqué pour évaluer la différenciation des cardiomyocytes et la fonction cardiaque. Commencez par obtenir huit à 10 petits, des chiots P0 à P2 pour isoler 10 millions de fibroblastes cardiaques néonatals, ou NCF.
Anesthésier profondément les chiots par hypothermie. Observez les cœurs au microscope à fluorescence pour vous assurer que le cœur avec le génotype souhaité montre un flux de calcium, indiqué par GCaMP3 avec les cœurs battant. Les autres génotypes ne montreront pas de fluorescence.
Après l’isolement des cœurs, coupez-les en quatre morceaux de manière à ce qu’ils soient vaguement connectés. Lavez-les soigneusement plusieurs fois dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS, dans une plaque de six centimètres pour limiter la pollution des cellules sanguines dans les cellules isolées. Digérez les cœurs avec huit millilitres de trypsine-EDTA chaude à 0,25% à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez le surnageant de trypsine et ajoutez cinq millilitres de 0,5 milligramme par millilitre de collagénase chaude de type deux dans la solution saline équilibrée de Hank. Vortex le mélange à fond et incubé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, encore une fois, vortexez le mélange à fond et laissez le tissu non digéré se déposer par gravité.
Recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres avec cinq millilitres de fibroblaste froid. Diluer les cellules avec un milieu fibroblastique de telle sorte que la densité d’ensemencement soit d’environ deux à 2,5 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre cube. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plats ou des assiettes.
Les fibroblastes attachés doivent avoir une forme ovale à ronde le deuxième jour après l’ensemencement. Le jour zéro, ensemencez les NCF à la densité d’environ une à deux fois 10 à la quatrième cellule par centimètre cube dans le milieu fibroblastique. Le premier jour, remplacez le milieu de culture par un milieu contenant un virus pour chaque puits comme on le souhaite.
Le jour 2, 24 heures après l’infection virale, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu ICM ordinaire. Évaluez le flux d’ions calcium à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée à température ambiante. Observez les cellules GCaMP3 positives sous l’objectif 10X, en veillant à ce qu’elles montrent des cellules spontanées battant dans le canal du champ lumineux.
Les cœurs avec le génotype correct ont montré un flux d’ions calcium synchronisé avec les battements, visualisé comme la fluorescence GCaMP3. Bien qu’aucune fluorescence n’ait été observée dans les cœurs témoins. Isolés NCF attachés au puits dans les deux heures et ont montré une forme ovale à ronde un jour après l’ensemencement.
L’oscillation des ions calcium a montré un changement de fluorescence GCaMP3 entre le maximum et le minimum et l’oscillation des ions calcium de ces cellules a changé périodiquement. Après l’introduction de l’IMAP, le nombre de grappes battantes était significativement plus élevé que dans le groupe contrôlé, car le nombre de cellules GCaMP3 positives avec flux d’ions calcium pour un champ de puissance élevé a été augmenté dans le groupe traité par un milieu IMAP. Les NCF doivent être fraîchement préparés et en bonne santé après l’isolement.
Une procédure rapide d’isolement cardiaque, de coupure et de temps de digestion approprié peut aider à éviter une réduction de la viabilité et de l’état cellulaires. Cette méthode fournit un moyen d’identifier les ICM fonctionnels matures pour les chercheurs en reprogrammation cardiaque. Avec plusieurs autres méthodes d’évaluation, on peut obtenir une compréhension plus concise des ICM fonctionnels matures.
