Le système bipartite GAL4-UAS est un outil polyvalent pour l’analyse génétique fonctionnelle chez Anopheles gambiae par modification génétique de l’expression des gènes de manière contrôlée spatio-temporelle. Le système binaire permet une flexibilité dans les approches expérimentales pour la caractérisation phénotypique de l’expression du transgène, même si des coûts de condition physique élevés sont induits. Ce système peut être utilisé pour la caractérisation phénotypique des gènes potentiellement impliqués dans la résistance aux insecticides, la transmission d’agents pathogènes ou ceux qui ont des utilisations dans les méthodes de contrôle génétique.
Fraser Coleman, un technicien de recherche, aidera à démontrer cette procédure Commencez par collecter des nymphes à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique de trois millilitres dont l’extrémité est coupée sur un plat transparent adapté à une utilisation avec un stéréomicroscope. Retirez soigneusement la majeure partie de l’eau autour des pupes. Allumez l’ampoule fluorescente et laissez-la se réchauffer.
Considérez les motifs spatio-temporels de couleur d’une expression et le rapport de différents phénotypes qui sont attendus lors du dépistage du marqueur fluorescent. Sélectionnez le filtre requis sur le stéréoscope à fluorescence et vérifiez qu’il y a un faisceau de lumière coloré visible qui est dirigé vers le centre de la plaque de scène. Sous la lumière blanche, centrez les nymphes dans le champ de vision et mettez-les au point.
Éteignez la lumière blanche et utilisez la mise au point fine pour mettre au point la zone des nymphes portant le phénotype d’intérêt avec un motif fluorescent visible. Utilisez un pinceau aux détails fins pour tourner doucement les nymphes et déplacer les pagaies anales afin que les organes génitaux externes puissent être identifiés. Séparez les nymphes en fonction des organes génitaux externes distinctifs.
Les mâles ont un long tube qui extrude du segment dorsal final environ la moitié de la longueur des pagaies anales. Les organes génitaux externes des nymphes femelles sont considérablement plus courts et bifurqués. Séparez les nymphes sexées en groupes de 10 ou moins dans des tubes transparents de 20 millilitres avec de l’eau et scellez les tubes avec une boule de coton.
Aspirer le nombre souhaité d’adultes mâles et femelles des tubes dans une cage ou un petit seau, en prenant soin de ne pas endommager les adultes pendant ce transfert. Maintenez la croix pendant cinq à sept jours avant de nourrir le sang. Le lendemain, des ovules peuvent être prélevés pour étudier le développement embryonnaire.
Assemblez la chambre de ponte et introduisez-y soigneusement 10 à 15 femelles nourries au sang. Couvrir la chambre de ponte et laisser reposer pendant 20 minutes. Détachez soigneusement le tube en polypropylène de 50 millilitres du pot de ponte, en veillant à ne pas relâcher les moustiques.
Couvrir le pot et laisser les œufs mûrir jusqu’au stade de développement d’intérêt. Ramassez les œufs du pot à l’aide d’un pinceau aux détails fins et placez-les sur l’eau dans un bloc de verre excavé de 40 millimètres carrés. Retirez soigneusement l’eau du bloc de verre avec une micropipette et couvrez les œufs dans 500 microlitres de FAA.
Oscillez doucement sur le shaker orbital à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez soigneusement les œufs 15 fois avec de l’eau distillée pour éliminer toute trace de solution de FAA. À l’aide d’une micropipette de 1000 microlitres, ajoutez puis retirez un millilitre d’eau distillée à la fois en prenant soin de ne pas endommager les œufs en le faisant.
Couvrir les œufs fixés avec un millilitre de solution de Trpis et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Les œufs commenceront à développer des taches pâles après cinq minutes d’incubation pour finalement atteindre une couleur blanche laiteuse une fois éliminés. Rincez soigneusement les œufs 15 fois avec de l’eau distillée pour éliminer toute trace de solution de Trpis.
L’expression de marqueurs fluorescents entraînés par le promoteur 3xP3 est observée dans les yeux et les ganglions ventraux des pupes d’Anophèles gambiae. L’utilisation de marqueurs fluorescents de différentes couleurs permet la sélection et le criblage d’individus modifiés portant différents composants GAL4 et UAS. Lorsque vous travaillez avec un système bipartite GAL4-UAS, il est nécessaire de croiser des mâles et des femelles de différentes souches pour acquérir une progéniture portant à la fois les composants GAL4 et UAS.
La morphologie différentielle observée chez les organes génitaux externes mâles et femelles des pupes est utilisée pour le sexage. Un exemple de nymphe non identifiable est mis en évidence ici. L’élimination de toute l’eau des nymphes, comme indiqué à droite, augmente la difficulté du sexage car les pagaies anales obscurcissent la visualisation des organes génitaux.
Le système bipartite GAL4-UAS permet de modifier l’expression des gènes de manière spatio-temporelle contrôlée. Cela peut être visualisé en croisant l’ovénocyte et l’omniprésent GAL4 quatre lignes de conducteur exprimant avec la ligne de réponse UAS-mCherry. L’un des principaux avantages de l’utilisation d’un système bipartite GAL4-UAS est la facilité d’étudier les phénotypes mortels, même au stade embryonnaire.
Pour ce faire, il est nécessaire de visualiser la morphologie interne des embryons. Les caractéristiques morphologiques normales observées à différents stades du développement embryonnaire à 12, 24 et 36 heures après la ponte peuvent être observées après l’achèvement du protocole de clairance de l’embryon. Il est essentiel tout au long de cette procédure que les pupes et les œufs ne soient pas autorisés à se dessécher.
Par conséquent, il est important de travailler rapidement lors de l’élimination des liquides. La méthode GAL4-UAS nous a permis de caractériser fonctionnellement les gènes impliqués dans la résistance aux insecticides et ceux ayant des utilisations potentielles dans les méthodes de contrôle du forçage génétique.
