La néovascularisation, la génération de nouveaux vaisseaux sanguins est un processus très réglementé dans les événements normaux et pathologiques. Pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Nous avons développé une puce microfluidique et un contrôle automatique.
Des circulations très efficaces sont effectuées pour former des micro-tubes de perfusion et simuler l’utilisation de la protéine pour récapituler à l’événement initial d’une nouvelle vascularisation. La puce germinante microfluidique était composée de trois canaux. Un canal de culture cellulaire endothéliale et un canal liquide ont été séparés par un large canal hydrogel central.
Le système de commande microfluidique était composé d’une pompe à microsyringe et d’une valve électromagnétique de pincement. Une puce de piège à bulles, une puce de germination microfluidique, une pompe micro-périssaltique et un réservoir moyen de culture. Avec un système microfluidique, les cellules endothéliales pourraient être stimulées par le stress de cisaillement luminal élevé, le niveau physiologique du flux transendothelial et diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale simultanément.
Pipette 20 microlitres de 125 microgrammes par millilitre de fibronectine dans un port d’injection médiatique du canal de culture cellulaire. Couper une pointe de pipette pour s’adapter au canal de culture cellulaire avec des ciseaux. Insérez la pointe pipette dans l’autre port d’injection multimédia du canal de culture cellulaire.
Ensuite, pipette de l’air du canal de culture cellulaire pour le remplir de fibronectine. Incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant une heure. Avant l’ensemencement cellulaire, pipette 20 microlitre de milieu cellulaire endothélial dans chaque port d’injection médiatique et incuber les copeaux à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, pipette tous les médias dans tous les ports d’injection des médias. Ensuite, pipette cinq microlitres de suspension cellulaire dans un port d’injection de médias de canal de culture cellulaire. Ensuite, les cellules endothéliales se propagent rapidement sur l’ensemble du canal sous pression hydrostatique différentielle.
Ajouter environ quatre à six microlitres de supports ECM à l’autre port pour ajuster la pression hydrostatique et arrêter le déplacement des cellules. Éloignez les puces à l’incubateur cellulaire. Ensuite, retournez les copeaux toutes les 30 minutes jusqu’à ce que les cellules endothéliales s’enrobent autour de la surface interne du canal de culture cellulaire, deux heures plus tard.
Utilisez la pointe pipette pour enlever très soigneusement les cellules attachées dans les ports d’injection. Ensuite, insérez quatre adaptateurs Luer femelles barbelés dans les ports d’injection des médias et remplissez-les de supports ECM. Retirez les puces dans l’incubateur cellulaire, changez les supports ECM et les adaptateurs Luer toutes les 12 heures.
Pour assembler le système de commande microfluidique, préparez deux tubes en polytétrafluoroéthylène, deux tubes courts en silicone, trois longs tubes en silicone, un adaptateur Luer femelle barbelé, un connecteur de type Y, puis trois connecteurs de type L. Remplissez la seringue de 10 millilitres de milieu ECM préchauffé. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à la seringue par un adaptateur Luer femelle barbelé.
Ensuite, connectez l’autre extrémité du tube de polytétrafluoroéthylène à un connecteur de type Y. Ensuite, connectez deux longs tubes en silicone aux deux autres extrémités du connecteur de type Y. Nous utilisons un tube pour nous connecter au réservoir et à l’autre tube pour nous connecter à la puce du piège à bulles.
Connectez un autre long tube de silicone au réservoir. Ensuite, utilisez deux courts tubes en silicone pour connecter tous les trous d’entrée et de sortie sur la couche supérieure de puce piège à bulles. Connectez un tube de polytétrafluoroéthylène à l’arrière de la puce.
Ensuite, fixez une seringue sur la pompe à microsyringe. Clip deux longs tubes de silicone dans la valve de pincement électromagnétique. Ensuite, passez la valve de pincement électromagnétique pour ouvrir le pipeline entre la seringue et le réservoir.
Injecter des supports dans le réservoir à l’aide d’une pompe à microsyringe pour épuiser l’air dans le tube. Ensuite, changez à nouveau la vanne pour ouvrir le pipeline entre la seringue et la puce du piège à bulles. Injecter des supports pour remplir la chambre liquide et le tube de backend de la puce de piège à bulles.
Sortez les copeaux de germination endothéliale de l’incubateur cellulaire, puis retirez les adaptateurs Luer du côté de la culture cellulaire. Insérez deux bouchons de tuyaux dans les ports d’injection d’hydrogel de la puce de germination microfluidique. Connectez le tube arrière de la puce de piège à bulles à un port de canal de culture cellulaire.
Insérez un connecteur de type T à l’autre port et connectez-le à un long tube de silicium relié au réservoir. Couper le long tube de silicone dans la pompe micro périssaltique. Ensuite, insérez un filtre à air dans le réservoir.
Ensuite, assemblez la puce de germination microfluidique à l’incubateur supérieur de scène. Ensuite, connectez la pompe à vide aux trous dans la couche inférieure de la puce de piège à bulles par un tube TPU. Réglez simultanément le volume de circulation opposé et un débit dans le programme personnalisé qui contrôle simultanément la pompe à microsyringe et la soupape électromagnétique de pincement.
Ensuite, configurer le débit de la pompe micro périsaltique. Allumez la pompe à microsyringe. Ensuite, le système de contrôle de la circulation est établi.
Nous testons la fonction barrière de certains micro-vaisseaux de notre modèle en mesurant le coefficient de perméabilité diffusionnelle de 40 kDa F-I-T-C dextrine. Comme il est indiqué dans la figure, le coefficient de perméabilité diffusionnelle de la puce de culture statique avec doublure cellulaire est de 0,1 plus ou moins 0,3 micromètre par seconde. Et le coefficient de perméabilité diffusionnelle du canal vide sans doublure cellulaire est de 5,4 plus ou moins 0,7 micromètre par seconde.
L’essai endothélial de germination a prouvé que les cellules endothéliales ont germé dans l’hydrogel central en grande partie après 24 heures de culture statique, alors que le degré de germination a sensiblement diminué avec l’augmentation du stress de cisaillement luminal. Quantitativement, le stress de cisaillement luminal a diminué la germination endothéliale de manière significative en termes de zone de germination, de longueur moyenne de germination, et de la plus longue longueur de pousse. Avec notre système, le stress de cisaillement sur les cellules endothéliales pourrait être changé en option à tout moment pendant l’expérience tandis que le flux transendothelial est resté au niveau physiologique.
Ce modèle biomimétique 3D in vitro peut être directement appliqué à l’étude du mécanisme de néosularisation, et tient la promesse potentielle comme plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.
