Zebrafish émerge comme un excellent modèle vertébré pour étudier les événements chromosomiques de la méiose, y compris l’appariement des chromosomes homologues, la synapse et la recombinaison. Ce protocole de propagation de surface nucléaire nous a permis de visualiser les caractéristiques clés de l’architecture chromosomique méiotique à l’aide d’une microscopie à super résolution. Les chercheurs peuvent s’attendre à des centaines de noyaux bien répandus par toboggan avec moins de débris que les autres protocoles de propagation du poisson zèbre.
La partie la plus difficile techniquement de cette procédure est la dissection des testicules de poisson zèbre car il est à proximité de la peau et est également attaché à d’autres organes. La visualisation de la procédure de dissection permettra aux chercheurs de savoir à quoi s’attendre lorsqu’ils verront la gonad encastrée dans le tissu de l’animal. Après avoir euthanasié le poisson zèbre mâle, décapiter un poisson à la fois avec de petits ciseaux, puis utiliser des micro ciseaux pour couper le long de la ligne médiane ventrale pour exposer la cavité corporelle.
Placer le poisson dans une boîte de Pétri recouverte de silicone et couvrir d’une piscine peu profonde de 1X PBS. Au microscope à 1,65 X grossissement, disséquer les testicules à l’aide de forceps. Retirez autant que possible la graisse et les tissus environnants des testicules.
La médina apparaîtra translucide sous la lumière de portée de dissection tandis que la graisse environnante peut avoir un aspect légèrement plus foncé. Une certaine quantité de graisse peut être laissée sur la 9ed sans encrager la procédure. Ajouter chaque testicules disséqués directement dans un tube de cinq millilitres avec deux millilitres de DMEM et garder sur la glace.
Pour dissocier les cellules des testicules, ajouter 200 microlitres de solution de collagène au tube de cinq millilitres avec les testicules. Mélangez la solution en l’inversant plusieurs fois. Secouez doucement les testicules dans un shaker d’incubateur horizontalement à 100 RPM à 32 degrés Celsius.
Inversez rapidement le tube toutes les 10 minutes pour faciliter la dissociation. Après une heure, le DMEM est nuageux et les testicules sont en petits morceaux. Tandis que les testicules sont incubés dans le collagène, avant-guerre 100 microlitres de solution de saccharose molaire de 0,1 à 37 degrés Celsius.
Pour laver la collagène, ajouter le DMEM à un volume final de cinq millilitres et inverser le tube à quelques reprises. Pelleter les testicules à 200 g pendant trois minutes à température ambiante. Retirez trois millilitres du supernatant de sorte qu’il ne reste que deux millilitres.
Répétez le lavage DMEM deux fois de plus. Après le dernier lavage DMEM, retirez quatre millilitres du supernatant et ajoutez un millilitre de DMEM, 200 microlitres de solution trypsine et 20 microlitres de solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger la solution.
Secouez horizontalement le tube à 32 degrés Celsius à 100 RPM. Inversez rapidement le tube toutes les cinq minutes pour faciliter la dissociation. Après cinq à 15 minutes, la solution DMEM ne contient que quelques touffes.
Ajoutez 500 microlitres de la solution inhibiteur de la trypsine et 50 microlitres de solution DNase I. Inverser le tube à quelques reprises pour mélanger puis tourner brièvement vers le bas à 200 g pendant trois minutes à température ambiante pour enlever le liquide ou les touffes qui peuvent adhérer au bouchon du tube ou le côté du tube. Placez le tube sur la glace et réutilisez la suspension cellulaire en évadant de haut en bas à plusieurs reprises avec une pipette de transfert en plastique pendant deux minutes pour faciliter la dissociation des touffes restantes.
Assurez-vous que la suspension cellulaire n’entre pas dans l’ampoule de la pipette de transfert. Ensuite, pré-mouiller une passoire cellulaire de 100 microns avec DMEM et le placer sur le dessus d’un tube de 50 millilitres sur la glace. Transférer la suspension cellulaire à travers la passoire une goutte à la fois à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
Transférer le filtrate à l’aide d’une pipette de transfert en plastique dans un nouveau tube de cinq millilitres. Assurez-vous de recueillir les cellules poolées fixées à la face inférieure du filtre. Ajouter DMEM dans le tube à un volume final de cinq millilitres.
Pelleter les cellules à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante. Enlever autant de supernatant que possible sans déranger la pastille et ajouter cinq microlitres de solution DNase I directement dans la pastille. Mélangez ensuite la pastille avec la solution DNase I en raclant doucement le fond extérieur du tube quatre à cinq fois le long d’une grille de tube de microcentrifugeuse vide.
Ajoutez DMEM à un volume final de cinq millilitres et mélangez la solution en inversant le tube plusieurs fois. Pelleter la suspension cellulaire à 200 g pendant deux minutes à température ambiante. Répétez le traitement DNase une à trois fois de plus jusqu’à ce que la pastille résuspendée ne s’agglutine pas à l’ajout de DMEM.
Après le dernier tour, retirer autant que possible le surnatant sans déranger la pastille. Ensuite, ajoutez un millilitre de 1X PBS et résuspendez la pastille en raclant doucement le fond extérieur du tube le long d’une grille à tube vide. Pelleter la suspension cellulaire à 200 g pendant cinq minutes, puis enlever autant de supernatant que possible sans déranger la pastille.
Couper trois millimètres à partir de l’extrémité d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour élargir l’ouverture. Avec la pointe de pipette coupée, resuspendez la pastille dans 80 microlitres de solution de saccharose molaire de 0,1 par pipetting de haut en bas. Laissez reposer la suspension cellulaire à température ambiante pendant trois minutes.
Ensuite, avec une pointe de pipette, enduire une diapositive de 100 microlitres de 1% de formaldéhyde avec 0,15%Triton X-100. Ajouter ensuite 18 microlitres de la suspension de cellules saccharose sur le centre de la glissière en ligne droite perpendiculaire au long bord. Inclinez la glissière d’avant en arrière pour faciliter la propagation de la suspension cellulaire à tous les coins.
Placez les glissières à plat dans une chambre d’humidité ouverte légèrement fissurée pour empêcher la solution de formaldéhyde de sécher. Placez la chambre d’humidité dans un tiroir sombre pendant la nuit. Le matin, retirez le couvercle de la chambre d’humidité et laissez sécher complètement les glissières.
Placez les glissières dans un bocal de coplin, puis remplissez le pot de coplin d’eau distillée. Incuber pendant cinq minutes avec des secousses douces à température ambiante. Verser l’eau et remplir le bocal d’un à 250 agents mouillants.
Lavez-les deux fois pendant cinq minutes chacun avec des secousses douces à température ambiante. Laissez sécher complètement les glissières et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient tachées. Ce protocole décrit une méthode pour préparer et visualiser la propagation des spermatozoïdes du poisson zèbre qui donne des noyaux non superposés bien répandus.
Les panneaux sur la gauche montrent trois étapes de prophase méiotique, leptotene, zygotène tôt, et pachytene. Les télomères étaient des magenta tachés pour chaque étape. Un exemple de propagations de mauvaise qualité en raison de traitements DNase I insuffisants sont montrés ici.
Les chromosomes méiotiques tachés pour SYCP3 indiquent des noyaux qui se chevauchent en raison d’une suspension visqueuse des cellules saccharose qui empêche les cellules de se propager correctement sur la lame. Il est très important de commencer avec la quantité correcte de matériel de départ, traiter les testicules de poisson zèbre pour la quantité appropriée de temps dans la trypsine, et d’effectuer le nombre nécessaire de traitements DNase I que l’échec de le faire peut conduire à très peu de noyaux ou de noyaux agglutinés. Le PPE approprié doit toujours être porté en travaillant avec le formaldéhyde.
Après la procédure de propagation, les chromosomes peuvent être tachés pour visualiser diverses structures chromosomiques ainsi que des ruptures à double brin pour analyser la dépendance au moment et la localisation des événements méiotiques. Notre technique a ouvert la voie pour montrer que le poisson zèbre peut être un meilleur modèle de spermatogenèse humaine que la souris basée sur les caractéristiques chromosomiques et le bouquet de télomères.
