Les cellules souches embryonnaires humaines peuvent être induites pour se différencier en cellules progénitrices neurales et par la suite en astrocytes neuronaux et oligodendrocytes. Cependant, méthode de culture de type pour les cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation en cellules progénitrices neurales sont très inefficaces et ouvert in vivo système de co-culture Ici, nous présentons un système de culture améliorée et robuste qui est facilement évolutif en utilisant la culture de type cellulaire unique à haute densité avec des cellules souches embryonnaires humaines. La culture de type cellulaire unique des cellules souches embryonnaires humaines fournit un système rapide et efficace pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent la différenciation en plusieurs étapes le long de lignées différentes et distinctes différenciées, y compris les cellules progénitrices neurales et leur différenciation ultérieure en lignées neuronales supplémentaires.
Commencez par préparer des plaques enduites de membrane de sous-sol qualifiées de cellules souches embryonnaires humaines. Décongeler lentement la solution matricielle membranaire du sous-sol à quatre degrés Celsius pendant au moins deux à trois heures ou toute la nuit. Une fois décongelée, diluer la matrice dans le froid DMEM/F-12 à 2%mélanger bien, et enrober chaque puits d’une plaque de six puits avec un millilitre de la solution diluée.
Incuber les plaques enduites à température ambiante pendant au moins trois heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour passer les cultures sans mangeoire des cellules souches embryonnaires humaines de type H9 cultivées sur la matrice membranaire du sous-sol, aspirez le milieu des puits et lavez-les une fois avec un millilitre de DPBS. Ajouter un millilitre de solution Dispase à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Retirer le Dispase et laver délicatement les cellules une fois avec deux millilitres de DMEM/F-12. Après le lavage, retirer le milieu et ajouter deux millilitres de DMEM/F-12 à chaque puits. Détachez doucement les colonies en les détachant de haut en bas et transférez-les dans un tube de 15 millilitres.
Centrifuger le tube à 370 fois g pendant deux minutes. Aspirer le milieu. Dissociez ensuite les granulés cellulaires en cellules individuelles en ajoutant deux millilitres de solution de détachement cellulaire et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Répétez la centrifugation et retirez la solution de détachement. Resuspendez les cellules dans mTeSR-1 milieu esc humain en pipetting doucement de haut en bas. Pour adapter les cellules souches embryonnaires humaines de type colonie à une seule culture de type cellulaire, plaquez environ 1,5 à deux millions de cellules dans chaque puits de la plaque enduite de matrice membranaire du sous-sol en deux millilitres de mTeSR-1 contenant 10 inhibiteurs rock micromolaires.
Après 24 heures, remplacer le milieu par du mTeSR-1 frais sans inhibiteur rock. Permettre aux cellules de se développer comme un seul type de cellule pendant trois jours en changeant le milieu par jour. Le quatrième jour, dissocier les cellules dans la solution de détachement et les re plaquer comme décrit précédemment.
Après avoir résuspendé et incubé les cellules selon les instructions manuscrites, transférez les petits corps embryonnaires dans un tube de 15 millilitres, laissez-les s’installer au fond et retirez doucement le milieu à l’aide d’une pipette. Transférez-les dans le milieu EB et laissez-les se développer dans des plats à faible fixation pendant sept jours. Pour induire la différenciation des cellules progénitrices neurales ou des PNJ, dissociez les cellules souches embryonnaires humaines de type cellule unique avec un millilitre de solution de détachement et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Centrifuger les cellules pendant deux minutes à 370 fois g. Retirez la solution de détachement supernatant. Puis résuspendez les cellules dans DMEM/F-12.
Plaquez les cellules sur une matrice membranaire du sous-sol recouverte d’une plaque de six puits à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par puits en deux millilitres de mTeSR-1 avec inhibiteur rock de 10 micromolaires. Après 24 heures, remplacer le milieu de culture par un milieu d’induction neural complété par un micromolaire Dorsomorphin et cinq micromolaireS SB431542. Changez le milieu tous les deux jours pendant les quatre premiers jours de l’induction neuronale, puis tous les jours jusqu’à ce que la confluence soit atteinte au septième jour.
Après sept jours d’induction neuronale, dissocier les cellules en ajoutant un millilitre de solution de détachement et en les incubant pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Centrifugez les cellules à 370 fois g et retirez le supernatant de solution de détachement. Ajouter un millilitre de milieu d’expansion NPC et pipette doucement les cellules de haut en bas pour résuspendre.
Puis plaque une fois 10 à la cinquième cellules par puits en deux millilitres de milieu d’expansion NPC sur la matrice membranaire du sous-sol enduit plaques de six puits. Passer les cellules au besoin lorsque les cultures atteignent 90% confluency ajoutant 10 inhibiteurs rock micromolaire au cours des trois à quatre premiers passages. Changez le milieu tous les deux jours pendant l’expansion.
Pour préparer les plaques recouvertes de laminine de l’OLP, diluer la solution de stock de l’OLP dans le PBS ou l’eau à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, bien mélanger, puis enrober chaque puits d’une plaque de six puits d’un millilitre de la solution. Incuber les plaques pendant au moins deux heures à 37 degrés Celsius ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez chaque puits avec PBS et immédiatement après le revêtement de chaque puits avec un millilitre de solution de laminine préparé selon les instructions manuscrites.
Gardez les plaques à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Pour différencier les PNJ en neurones dopaminergiques, plaquez les cellules dans les plats recouverts de laminine de l’OLP dans le milieu d’expansion du PNJ à une densité d’environ 50 % après 24 heures, changez le milieu en DA1 et changez le milieu tous les deux jours par la suite. Pour passer les cultures lorsqu’elles atteignent la confluence, dissocier les cellules avec un millilitre de solution de détachement et les incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.
Puis centrifugez-les à 370 fois g et retirez la solution de détachement supernatant. Resuspendez les cellules en un millilitre de MILIEU DA1 et plaquez une fois 10 à la cinquième cellule en deux millilitres de milieu sur les plaques de six puits recouvertes de laminine de l’OLP. Pour différencier les PNJ en astrocytes, plaquez les cellules sur les plaques de laminine de l’OLP et le milieu d’expansion du PNJ à une densité de 50 % de changer le milieu en milieu d’astrocyte après 24 heures, et passer les cellules comme décrit précédemment.
Lorsque les cellules souches embryonnaires humaines de type colonie ont été adaptées à la culture de type cellulaire unique, il a été constaté que les cellules étaient capables d’être maintenues à haute densité, puis facilement et efficacement sous-cultures lorsque la confluence a été atteinte. Ces cellules ont conservé les caractéristiques du cycle cellulaire typiques des cellules souches embryonnaires humaines de type colonie, comme une courte phase G1 et une forte proportion de cellules en phase S. L’analyse quantitative du PCR a également confirmé qu’ils expriment des marqueurs ESC à des niveaux comparables à ceux des cellules de type colonie.
En outre, il a été démontré que les cellules souches embryonnaires humaines à cellule unique étaient capables de former des corps embryoïdes contenant des cellules des trois couches germinales : endoderm, mésoderm et ectoderm. Il a ensuite été démontré que les cellules souches embryonnaires humaines de type cellule unique se distinguaient efficacement en PNJ, comme l’indique la perte de la morphologie des cellules souches embryonnaires humaines typiques et l’apparition de la morphologie du PNJ. La différenciation a été soutenue par l’expression accrue des marqueurs de PNJ de signature et confirmée par l’immunostaining et l’analyse de FACS.
La même analyse a également montré que plus de 90% des cellules tachées positives pour SOX1, PAX6, et les protéines NCAM. En outre, les PNJ dérivés ont pu se différencier en neurones dopaminergiques et astrocytes comme indiqué par l’apparition des morphologies caractéristiques et l’expression des marqueurs spécifiques à la lignée. Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel de plaquer les cellules souches embryonnaires humaines à haute densité afin de maintenir une culture saine et indifférenciée des cellules souches embryonnaires humaines.
Ce protocole fournit une plate-forme pour la production simple, robuste, et évolutive de l’ancêtre et de la cellule différenciée qui sera évolutive pour l’étude de base, l’écran de drogue, et l’application dans la médecine neurodegenerative.
