Les parasites du paludisme tels que les moustiques qui jouent un rôle majeur dans la propagation de la maladie. Jusqu’à présent, il a été impossible d’élever les moustiques antipaludiques sans sang. Et pour surmonter cette limitation, notre protocole décrit un régime de remplacement du sang qui est capable de soutenir la reproduction des moustiques dans l’insecte.
L’utilisation d’un régime sans sang est très avantageux sur le sang. Un régime sans sang n’a pas les contraintes éthiques que l’utilisation de sang humain, ou des animaux expérimentaux. Le remplacement des animaux à l’expérimentation fait partie de notre politique de trois R.
Remplacer, réduire, affiner. Le fait de ne pas utiliser de sang réduit les coûts et la logistique associée à la collecte, au stockage et à l’entretien du sang rouge. L’utilisation de régimes artificiels peut faciliter l’essai des molécules d’anti plasmodium.
Jusqu’à présent, nous avons testé notre alimentation en utilisant différentes espèces d’anophèles. Dans tous, le régime alimentaire était bien engorgé par les femelles et permettait la production et la ponte d’œufs. Nous croyons que ce régime a une utilisation potentielle pour l’élevage d’autres espèces de moustiques.
En fait, nous le testons maintenant pour les aedes, un vecteur de nombreuses maladies telles que la dengue, le virus Zika ou la fièvre jaune. Maintenir anopheles coluzzii yaonde souche moustiques dans une pièce à 26 degrés Celsius, 75% d’humidité, et sous un cycle sombre de lumière de 12 heures à 12 heures. Abritez les moustiques en utilisant des conditions insectifuges standard dans une seule cage pour garantir l’accouplement.
Utilisez une pipette en plastique pour recueillir les pupes moustiques dans un petit récipient d’eau. Placez le contenant à l’intérieur d’une cage à moustiques pour laisser les moustiques adultes émerger et s’accoupler. Fournir une solution d’alimentation à 10% de glucose dans la cage.
Trois jours après l’émergence, utiliser un aspirateur pour recueillir le nombre nécessaire de femelles de la cage de stock dans une tasse en papier. Pour distinguer, les femelles sont plus grandes et les mâles ont une trompe plus large et plumeuse. Un jour avant les sentiers d’alimentation, retirez la solution d’alimentation à 10 % de glucose.
Le lendemain, préparez des régimes liquides artificiels dans des conditions stériles dans l’armoire à écoulement laminaire selon le manuscrit. Ajouter tous les ingrédients dans un tube en plastique. Bien mélanger tous les ingrédients et filtrer à l’aide d’un microfiltre de 0,45 micron.
Remplissez une seringue stérile de 1 millilitre munie d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27 avec 100 microlitres d’un milligramme par millilitre d’héparine. Puis, anesthésier six à huit semaines CD une souris femelle avec kétamine et xylazine en utilisant la voie intra péritonéale. Évaluer si la souris affiche une réaction musculaire et une réponse à différents stimuli physiques.
Effectuez la ponction cardiaque. Puis recueillir le sang de la souris dans un micro tube et maintenir le sang à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Ensuite, recueillir environ 30 moustiques femelles de la cage de stock à l’aide d’un aspirateur.
Transférer les moustiques femelles dans des gobelets en papier de 500 millilitres et couvrir d’une fine maille de moustiquaire afin qu’ils ne puissent pas s’échapper. Étirez la membrane du parafilm à travers la bouche de la mangeoire en verre pour contenir le repas. Appliquez un appareil d’alimentation artificiel à cloche de verre relié aux tubes en plastique sur le dessus de chaque tasse.
Fournir un débit d’eau constant vers le tube cylindrique et la mangeoire de sorte que la température à l’intérieur est maintenue à environ 37,5 degrés Celsius. Appliquez un millilitre de régime liquide préchauré à 37 degrés Celsius ou du sang de souris frais dans une mangeoire en verre. Nourrissez les moustiques pendant 60 minutes dans l’obscurité à 26 degrés Celsius.
Après l’alimentation artificielle, le froid anesthésie les moustiques à 20 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, placez les moustiques dans une boîte de Pétri réfrigérée. Enregistrez le nombre de moustiques femelles entièrement engorgés.
Séparez 30 femelles entièrement engorgées et mettez-les sur une nouvelle cage. Maintenant, placez un papier filtre humidifié au fond de chaque cage. Gardez les moustiques à 26 degrés Celsius, 75% d’humidité, et sous un cycle sombre clair de 12 heures à 12 heures avec 10% de glucose ad libitum.
À 96 heures et 120 heures après l’alimentation, comptez les œufs à l’aide d’une loupe portatif. Inonder le papier filtre d’eau distillée pour recueillir les œufs dans des plateaux remplis d’eau distillée. Nourrir les larves quotidiennement avec environ 13 milligrammes de nourriture pour poissons moulus par plateau.
Retirer les pupes mortes et les larves avec une pipette en plastique tous les jours. Lorsque tous les pupes sont nés en adultes, comptez le nombre de mâles et de femelles adultes, enregistrez les dates d’éclosion et de décès et calculez les taux de mortalité. Pour vérifier la longévité, rassemblez 15 mâles adultes et 15 femelles adultes de la génération F1 de chaque groupe diététrique dans une tasse en papier.
Nourrir les adultes avec 10% de glucose solution ad libitum. Utilisez une pince à épiler ou une brosse pour enlever les adultes morts tous les jours. Maintenez les moustiques à la même température, humidité, conditions de cycle léger et régime d’alimentation en sucre.
Enregistrez les dates de décès et calculez la longévité. Pour mesurer la longueur des ailes, le froid anesthésie les moustiques adultes mâles et femelles de F1 de cinq jours de chaque groupe alimentaire à 20 degrés Celsius pendant 90 secondes. Sous un stéréoscope, saisir délicatement le thorax de chaque moustique avec des forceps, et les placer côté ventral vers le haut.
Recueillir les deux ailes à l’aide d’un scalpel, et les placer sur une lame de microscope propre contenant une goutte séchée de milieu de montage pour une mesure plus supplémentaire à l’aide d’un oculaire gradué. Mesurez la longueur de l’aile à l’aide d’un stéréoscope à l’aide d’un micromètre. Dans cette étude, la performance des moustiques anophèles femelles nourris sur le repas artificiel riche formulé et les moustiques nourris sur le régime liquide initial, ou un repas de sang frais a été comparé.
Le nombre de moustiques femelles engorgés nourris avec un riche repas artificiel à 89% était significativement plus élevé que le nombre de femelles engorgées nourries au sang à 56%La génération F1 de moustiques nourris sur le sang ou le repas artificiel riche avait des taux de mortalité et de survie comparables. La variabilité était plus élevée chez les moustiques nourris au sang que chez les moustiques nourris avec le riche repas artificiel. En ce qui concerne la taille du corps adulte, les moustiques anophèles F1 nourris avec un repas artificiel riche se trouvait dans la fourchette prévue, et était similaire aux moustiques insectifuges nourris au sang.
À mon avis, il est très important d’assembler les mangeoires correctement avec le parafilm pour éviter sa rupture. Si la membrane n’est pas bien fixée à la mangeoire en verre, vous pouvez perdre le repas et probablement perdre certains des moustiques car ils peuvent être couverts par le repas et mourir. Nous aimerions effectuer un essai d’attraction à double choix, par exemple à l’aide d’un olfactomètre afin que nous puissions réellement évaluer si nos femelles sont plus attirées par le régime artificiel ou par le sang.
En outre, nous sommes maintenant lyophiliser le régime artificiel et d’étudier sa stabilité entre les différentes températures depuis longtemps. Outre les améliorations évidentes à la stabilité et le stockage que nous avons travaillé sur, l’utilisation à long terme de l’alimentation sur la condition physique des moustiques et la physiologie devrait être étudiée. Je crois que la production d’anophèles sans sang facilitera la recherche extrêmement vectorielle et la mise en œuvre d’outils de lutte qui dépendent d’un grand nombre de moustiques.
