La fonction mitochondrique est critique pour l’auto-renouvellement hématopoïétique de cellules souches. L’activité mitochondriale est un réflecteur du potentiel de membrane mitochondrique interne, qui peut être mesuré par TMRM, un colorant cationique fluorescent et perméant de cellules. Les pompes d’efflux xénobiotiques sont très actives dans HSC, et causent l’extrusion de TMRM.
Le principal avantage de ce protocole, est la correction de cet effet, en utilisant Verapamil, un inhibiteur des pompes efflux. Commencez par isoler la moelle osseuse des fémurs de souris. Utilisez une paire de forceps et de ciseaux pointus pour couper les deux pattes postérieures.
Ensuite, faire un petit snip dans la peau ventrale de la souris, et l’étirer. Extraire le fémur et le tibia, tout en prenant soin de ne pas déloger les têtes du fémur, et placer les os dans une plaque de six puits, rempli de 1,5 millilitres de tampon de coloration. Retirez les muscles des os et coupez les extrémités des os, ce qui permet à la moelle osseuse de sortir.
Placez les os nettoyés dans de nouveaux puits, avec 1,5 millilitres de tampon de coloration. Ensuite, rincer la moelle osseuse avec une seringue de trois millilitres et une aiguille de calibre 25, jusqu’à ce que l’os devienne blanc. Recueillir toutes les cellules dans un tube de 1,5 millilitre, et les centrifuger pendant cinq minutes à 180 fois G, puis jeter le supernatant.
Resuspendez soigneusement la pastille dans 300 microlitres de tampon de lysing ACK froid de glace, et mettez les cellules sur la glace pendant une minute. Ensuite, désactivez immédiatement la lyse en ajoutant un millilitre de tampon de coloration. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 180 fois G.Resuspendre la pastille cellulaire, qui devrait apparaître blanc, dans un millilitre de tampon de coloration.
Filtrer les cellules à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour obtenir des cellules mononucléaires. Commencez par préparer le cocktail de lignée, et fluorophore anticorps conjugués, selon les instructions manuscrites. Gardez les anticorps sur la glace et protégez-les de la lumière.
Ensuite, centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 180 fois G, et jeter le supernatant. Ajouter 400 microlitres du cocktail de lignée, et quatre microlitres d’anticorps biotinylés CD135 à la pastille cellulaire, et vortex le mélange. Ensuite, incubez-le sur la glace pendant 30 minutes.
Après l’incubation, laver l’échantillon en ajoutant trois millilitres de tampon de coloration, en le faisant tourner pendant cinq minutes à 180 fois G et en jetant le supernatant. Ajouter ensuite 400 microlitres de solution d’anticorps et vortexer le mélange. Incubez-le sur la glace pendant encore 30 minutes, et répétez le lavage avec le tampon de coloration.
Pour préparer la solution de coloration TMRM, ajouter 2,2 microlitres de solution de stock TMRM, et 1,1 microlitres de Verapamil, à 1,1 millilitres de milieu de culture hématopoïétique sans sérum, avec thrombopoïétine et facteur de cellules souches. Resuspendez la moelle osseuse en un millilitre de la solution de coloration TMRM, vortex rapidement, et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Filtrer l’échantillon à l’aide d’un bouchon de passoire cellulaire, avec un maillage en nylon de 35 micromètres, pour éviter d’obstruer le cytomètre d’écoulement.
Ajoutez ensuite un microlitre de DAPI et procédez à la cytométrie d’écoulement. Exécutez l’échantillon de moelle osseuse et acquérez au moins un million d’événements. Ensuite, affichez les cellules mononucléaires de moelle osseuse vivantes dans une parcelle de bleu pacifique, pour identifier les fractions cd135 Lin-négatives et lin-positives.
Tracez la fraction lin-négative pour APC/Cy7 contre PE/Cy7 pour identifier l’ancêtre multipotent ou la fraction de MPP. Ensuite, tracez la fraction MPP pour APC contre PerCP/Cy5.5, pour identifier la cellule souche hématopoïétique ou la fraction HSC. Affichez la fraction HSC pour fitc, ou CD34, pour la diviser en fractions HSC négatives CD34 et CD34 positives HSC.
Enfin acquérir l’intensité TMRM dans chaque population. Pour s’assurer que la coloration tmrm a fonctionné correctement, ajouter un microlitre de FCCP à l’échantillon, pour une concentration finale d’un millimolaire, et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis acquérir un million d’événements.
Après l’ajout de FCCP, l’intensité de TMRM devrait être considérablement augmentée. Ce protocole a été utilisé avec succès pour quantifier le potentiel memitochondrial de membrane dans diverses populations cellulaires, avec le colorant de TMRM. Il a été démontré que la présence de PBS et de FBS dans le milieu de culture affecte l’intensité du signal TMRM.
Il est donc important d’effectuer la coloration TMRM dans le milieu d’expansion sans sérum. Les cellules souches hématopoïétiques expriment des niveaux d’activité élevés de pompes à efflux xénobiotiques qui extruder le colorant TMRM. Ainsi, les profils TMRM varient également en présence de Verapamil ou Cyclosporin H, qui bloquent les pompes.
Pour vérifier l’exactitude de la coloration TMRM, FCCP peut être de dépolariser les mitochondries, et de réduire l’intensité TMRM. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier HSC avec un colorant potentiel de membrane mitochondrique différent, y compris TMRE ou JC-1. Ainsi que d’autres dyes mitochondriques tels que MitoTracker ou MitoSOX.
Les questions critiques héritées par l’activité différente des pompes d’efflux parmi la population de moelle ont été soulignées seulement récemment. Ce protocole vise donc à réduire l’écart entre les résultats antérieurs.
