Ce protocole est utilisé pour la cartographie et la discrimination des transcriptions primaires et traitées dans les mitochondries de maïs. Cette technique comprend une étape de normalisation de l’ARN et elle minimise l’influence de cinq triphosphates premiers instables qui entravent une discrimination claire entre les transcriptions primaires et traitées. Outre les mitochondries de maïs, cette méthode pourrait être appliquée aux plastides et autres mitochondries végétales.
Commencez par recueillir 20 grammes de grains en développement dans un tube de 50 millilitres sur la glace. Transférer les grains dans un mortier pré-refroidi et ajouter 10 à 20 millilitres de tampon d’extraction du froid glacé. Moudre complètement les grains, ajouter plus de tampon d’extraction et filtrer le tissu au sol à travers deux couches de tissu filtrant.
Centrifuger le filtrate à 8000 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube et jetez le filtrate. Centrifuger le tube à 20 000 fois G pendant 10 minutes.
Verser le supernatant et suspendre à nouveau la pastille en six millilitres de tampon de lavage. Aliquot la suspension en cinq tubes sans RNase de 1,5 millilitre et les centrifugeuse à 14 000 fois G pendant cinq minutes. Jeter le supernatant et congeler la pastille mitochondriale dans de l’azote liquide.
Extraire l’ARN mitochondrial à l’aide de reagents commerciaux selon les instructions du fabricant et mettre en place un ARN cinq traitement de polyphosphaatase premier. Ensuite, récupérez l’ARN avec un kit de purification de l’ARN. Le reagent utilisé pour l’extraction de l’ARN est dangereux.
Toujours travailler avec elle dans une hotte de fumée et toujours porter un manteau de laboratoire et des gants. Préparez deux réactions de circularisation en utilisant les mêmes quantités de cinq polyphosphatase de premier choix traités et non traités ARN mitochondrial. Incuber les deux réactions à 16 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures, puis récupérer l’ARN auto-ligated avec un kit de purification de l’ARN précédemment utilisé.
Commencez par préparer un mélange d’apprêt avec un rapport égal de 26 SCRT et jusqu’à sept autres amorces de transcription inversée. Assembler deux systèmes de réaction de transcription inverse selon les instructions manuscrites et les incuber à 42 degrés Celsius pendant 50 minutes. Pour normaliser l’ADNC, préparez deux réactions pcr avec le même volume d’ADN des cinq principaux ARN traités ou non traités et exécutez la réaction dans des conditions de thermocyclisme décrites dans le manuscrit.
La normalisation par rRNA mature 26S est une étape clé pour discriminer entre les transcriptions primaires et traitées. Comparez l’abondance des deux produits PCR et, si nécessaire, optimisez la normalisation en ajustant les quantités d’ADN modèle. Préparez des paires de réactions PCR avec des volumes appropriés d’ADN normalisé et une paire d’amorces divergentes comme dans la jonction de cinq premiers à trois premiers des transcriptions cibles et effectuez pcr selon les directives manuscrites.
Ensuite, utilisez un kit de récupération d’ADN de gel pour isoler les bandes proéminentes qui sont amplifiées par pcr imbriqué. Clonez les produits PCR purifiés par gel en un vecteur à l’aide de techniques standard et effectuez le PCR de la colonie pour sélectionner des clones positifs contenant les inserts cibles. Séquencez les produits PCR et alignez les données de séquençage avec le génome mitochondrial du maïs à l’aide de l’outil local de recherche d’alignement de base ou BLAST.
Choisissez la collection de nucléotides de la base de données de recherche et de maïs de l’organisme. Trouvez la jonction principale à trois de la transcription circulaire et déterminez les positions des cinq termini de transcription principaux et de trois principaux. Amplifiez le fragment d’ADN utilisé pour préparer la sonde ARN et clonez-la au vecteur précédemment utilisé qui contient un promoteur T7, 17 paires de base en amont du site d’insertion.
Étiquetez les sondes ARN avec dig-11-UTP et effectuez l’hybridation de l’ARN à l’aide de kits commerciaux. Discriminer les cinq extrémités primaires et traitées en comparant les produits circulaires RT-PCR obtenus à partir des cinq polyphosphatase primaires normalisées traitées et non traitées arn. Ensuite, concevez des amorces quantitatives RT-PCR basées sur les résultats de la cartographie et vérifiez les résultats de discrimination avec RT-PCR.
Le gène COX-2 a été utilisé comme exemple pour démontrer la cartographie et la discrimination des transcriptions mitochondriques du maïs avec la stratégie circulaire basée sur rt-PCR. Les CDNA normalisés ont été utilisés comme modèles pour pcr, qui ont eu comme conséquence deux bandes proéminentes amplifiées des cinq échantillons traités principaux de polyphosphatase. Les deux bandes ont été nommées COX-2 une et deux récupérées du gel et clonées en vecteurs.
Les résultats du PCR de colonie ont montré que les clones positifs contiennent des inserts de taille variable, ce qui implique que les termini ont hétérogène cinq premiers ou trois termini premiers. Les résultats de séquençage ont montré que COX-2 un et deux ont les mêmes trois extrémités principales à 39 nucléotides en aval du codon d’arrêt tandis que leurs cinq termini principaux sont situés à 992 à 1,030 et 1, 276 à 1, 283 nucléotides en amont du codon de départ, respectivement. L’hybridation circulaire de tache de gel d’ARN a été exécutée pour vérifier les résultats circulaires de cartographie de RT-PCR et deux bandes principales avec des tailles semblables à COX-2 un et deux ont été détectées.
Une autre paire d’amorces divergentes ont été conçues pour amplifier les bandes COX-2 trois et quatre détectées avec la tache de gel d’ARN mais pas avec rt-PCR circulaire de première fois. Les résultats quantitatifs de RT-PCR ont confirmé que COX-2 un, deux, trois et quatre étaient sensibles à cinq polyphosphatase primaire et qu’ils ont eu les cinq termini principaux primaires. L’analyse de l’extension de l’amorce pourrait être effectuée pour vérifier les cinq principaux résultats de la cartographie, bien qu’elle ne soit pas incluse dans ce protocole.
