Ce protocole facilite les analyses quantitatives à petite et à grande échelle de la teneur en lipides de stockage cellulaire chez une variété d’espèces de levure et le fait d’une manière impartiale et normalisée. La technique permet le traitement rapide des images microscopiques et fournit des extrants quantitatifs détaillés pour comparer facilement des échantillons tels que divers mutants et cellules cultivés dans diverses conditions. Pour commencer, suivez le protocole texte qui l’accompagne pour préparer les solutions de coloration, les médias culturels et les cellules.
Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et dans la phase de croissance souhaitée avant d’exécuter l’expérience. Ensuite, préparez un coverslip microscope pour chaque échantillon à l’image. Étendre un microlitre de solution de revêtement de glissière sur un couvercle propre à l’aide du côté long d’une pointe de pipette positionnée horizontalement.
Laissez sécher complètement la solution de revêtement, puis rangez les couvercles dans un environnement exempt de poussière. Ensuite, mesurez les densités optiques des cultures cellulaires et, pour que les cultures soient analysées dans la même phase de croissance, essayez d’atteindre des valeurs similaires parmi toutes les cultures testées afin d’assurer des conditions expérimentales comparables. Ensuite, pipette un millilitre de la culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Pour les cellules S.cerevisiae seulement, ajoutez cinq microlitres de la solution de revêtement de glissière au tube aussi bien. Puis, brièvement vortex tous les tubes de microcentrifugeuse, et les incuber à 30 degrés Celsius avec des secousses pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de la solution de coloration lipidique à chaque culture aliquot, et vortex brièvement.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution de visualisation des limites cellulaires et vortexez-les brièvement une deuxième fois. Recueillir les cellules en les centrifugant à 1000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante. Une fois la filature terminée, retirer 950 microlitres du surnatant et resuspendre les cellules dans le supernatant restant à l’aide d’une pipette.
Ensuite, pipette deux microlitres de la suspension cellulaire dense sur un coverslip enduit de lectine. Ensuite, placez le coverslip sur une lame de microscope propre pour former un monocouche cellulaire, et passez à la microscopie aussi rapidement que possible pour minimiser les artefacts dans l’imagerie. La mise en place du microscope nécessite de longues expositions à de fortes sources de lumière qui pourraient endommager l’échantillon et fausser les résultats.
Par conséquent, configurer les conditions d’imagerie à l’aide d’une diapositive d’échantillon dédiée qui ne sera pas utilisée davantage pour la quantification des gouttelettes lipidiques. Placez l’échantillon dédié sur la scène d’un contraste de phase ou d’une configuration différentielle de microscope à contraste d’interférence, et concentrez-vous sur les cellules. Dans le logiciel du microscope, définissez les paramètres de la pile Z de sorte qu’ils couvrent l’ensemble du volume cellulaire.
La distance verticale totale dépend de la taille de la cellule, et le nombre de tranches optiques dépend de l’ouverture numérique de l’objectif. Ensuite, mettez l’accent sur le déplacement par rapport au plan focal central. Pour imager les gouttelettes lipidiques, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal vert.
Soyez prudent lors de l’imagerie, car BODIPY est un fluorochrome très lumineux qui peut être rapidement photobleached. En outre, réduisez au minimum le temps d’exposition pour éviter la sursaturation. Capturez d’abord le canal vert complet Z-stack avant de passer au canal bleu pour éviter de brouiller les gouttelettes mobiles de lipides.
Pour les limites des cellules d’image, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal bleu. Si possible, configurez et utilisez un workflow expérimental automatisé dans le logiciel de contrôle au microscope pour faciliter l’imagerie de plusieurs échantillons dans des conditions normalisées. Fait important, toutes les images doivent être acquises en utilisant les mêmes paramètres pour permettre une comparaison appropriée entre les échantillons.
Une fois que les conditions d’imagerie ont été optimisées, concentrez-vous sur les cellules et imagez-les dans les canaux verts et bleus. Imagez plusieurs champs de vision par échantillon pour obtenir des données robustes et représentatives. Enregistrez les images Z-stack du canal bleu et vert sous forme de fichiers TIFF multicouches 16 bits.
Assurez-vous d’inclure les mots vert ou bleu dans les noms de fichiers correspondants. Ouvrez des images microscopiques dans ImageJ et supprimez toutes les piles d’images contenant un nombre considérable de cellules qui se sont déplacées lors de l’acquisition. Ceux-ci apparaissent à différentes positions dans les sections Z individuelles.
Ensuite, retirez toutes les piles d’images contenant des particules non cellulaires hautement fluorescentes dans le canal bleu. Ceci est souvent causé par la saleté sur la surface d’imagerie ou les impuretés dans le milieu de culture et peut interférer avec la détection des cellules dans leur voisinage. En outre, retirez toutes les piles d’images contenant une grande proportion de cellules mortes.
Ces images afficheront des cellules avec une fluorescence bleue accrue par rapport aux cellules vivantes. Bien que la présence de quelques cellules mortes dans l’échantillon ne soit généralement pas un problème et que ces cellules soient automatiquement jetées au cours de l’analyse, certaines cellules mortes ou mourantes peuvent parfois être reconnues comme cellules vivantes par l’algorithme de segmentation et ainsi fausser les résultats rapportés. Pour commencer l’analyse dans MATLAB, créez d’abord un dossier principal et copiez tous les scripts MATLAB à cet endroit.
Ensuite, créez des sous-rôles avec les noms des différentes espèces de levure, et copiez les images respectives du TIFF à ces endroits. Maintenant, commencez MATLAB, ouvrez le script PRINCIPAL. m, et exécuter le script.
Dans le menu, sélectionnez les espèces de levure à analyser et commencez le traitement d’image. Inspectez et traiter les fichiers de sortie au besoin à l’aide d’un éditeur de feuille de calcul ou d’un paquet statistique. Le flux de travail produit des fichiers CSV séparés par des points-virgules et des fichiers TIFF segmentés avec des objets cellulaires détectés et des gouttelettes lipidiques.
On y voit des cellules S.pombe de type sauvage qui ont été cultivées dans le milieu complexe YES ou dans le milieu défini de l’EMM. Par rapport aux cellules cultivées dans le milieu YES, moins de gouttelettes lipidiques et une intensité de coloration plus élevée par unité de volume cellulaire ont été détectées dans le milieu emm. En outre, les gouttelettes individuelles de lipide formées dans le milieu d’EMM étaient plus grandes et ont montré une intensité totale accrue de coloration.
Ceci est en accord avec les résultats précédents de l’augmentation de la teneur en lipides stockés dans les cellules cultivées en EMM. Ensuite, ces images montrent des cellules S.japonicus provenant de cultures exponentielles et stationnaires précoces cultivées dans le milieu YES. Les cellules entrant dans la phase stationnaire ont montré un nombre nettement diminué de gouttelettes de lipide par unité de volume cellulaire tandis que l’intensité de fluorescence de gouttelette de lipide volume-normalisée a diminué légèrement entre les deux conditions.
Les gouttelettes de lipides de phase stationnaire précoce étaient généralement de taille modérément plus grande et avaient une intensité totale de fluorescence modérément plus élevée que les gouttelettes provenant de cellules à croissance exponentielle. Dans les cellules S.cerevisiae cultivées en phase exponentielle par rapport à la phase stationnaire, les cellules stationnaires contenaient un peu moins de gouttelettes lipidiques par unité de volume par rapport aux cellules en croissance exponentielle. Cependant, leur intensité de fluorescence de gouttelettes normalisée en volume a presque doublé.
Cette forte augmentation de la teneur globale en gouttelettes lipidiques est due à l’intensité et au volume beaucoup plus élevés de fluorescence et de volume de gouttelettes de lipides individuelles en phase stationnaire. Après cette procédure, les données de sortie peuvent être agrégées dans un ensemble statistique tel que R pour créer des parcelles de résultats résumés et exécuter des tests statistiques sur toutes les différences observées dans la teneur en gouttelettes lipidiques. En principe, le pipeline de traitement d’image peut être utilisé pour l’analyse de la teneur en gouttelettes lipidiques dans d’autres micro-organismes ou pour analyser d’autres structures subcellulaires similaires à des points.
