La méthode est significative parce qu’elle permet la détection neurochimique avec la résolution spatiale et temporelle élevée qui peut potentiellement augmenter des méthodes in vivo de détection neurochimique. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode rapide, facile et reproductible pour améliorer la sensibilité et la résolution temporelle de la détection des neurotransmetteurs. Sanuja Mohanaraj et Pauline Wonnenberg, étudiantes diplômées de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, séparez le matériau en fibre de carbone en brins individuels et tirez une seule fibre de carbone de sept micromètres de diamètre à partir d’un brin. Connectez une ligne de vide à un capillaire en verre borosilicate et aspirez la fibre de carbone dans le capillaire. Ensuite, coupez un morceau de carton de 10 centimètres sur 25 centimètres pour servir de support d’électrode.
Collez une serviette en papier autour du carton comme support, puis insérez le capillaire dans le support d’électrode et fixez-le soigneusement dans un pull capillaire vertical. Configurer le pull capillaire pour tirer le capillaire en verre à un cône fin pour les matériaux d’électrode et de le démarrer. Une fois que la bobine de chauffage s’est refroidie, coupez la fibre de carbone reliant les électrodes tirées par tube.
Retirez soigneusement les microélecrodes du puller capillaire. Guidé par un stéréoscope ou un microscope, utilisez une lame tranchante ou des ciseaux chirurgicaux pour réduire la fibre de carbone saillante sur chaque électrode à environ 100 à 150 micromètres de longueur. Ensuite, dans un flacon de 25 millilitres, utiliser un coton-tige pour mélanger 10 grammes d’époxy avec 0,2 millilitres de durcisseur.
Remplir un autre flacon d’acétone. Pour chaque électrode, plonger la pointe de fibre de carbone dans l’époxy pendant 15 secondes, puis la tremper dans l’acétone pendant trois secondes pour éliminer l’excès d’époxy. Après époxyde, les électrodes epoxiées sont ensuite durcies au four pendant trois heures à 125 degrés Celsius.
Ensuite, utilisez un micromanipulateur pour placer une microélecrode en fibre de carbone dans une électrode de référence argent-argent-chlorure dans une solution de 0,5 millimolaire d’acide chloroaurique dans 0,1 chlorure de potassium aqueux molaire. Connectez les électrodes à un potentiostat avec une microélecrode en fibre de carbone comme électrode de travail. Scannez l’électrode de 0,2 volt à moins un volt à 50 millivolts par seconde pendant 10 cycles pour effectuer le dépôt d’électrodes.
Il est essentiel d’optimiser les paramètres de dépôt du revêtement en or. Trop de revêtement causera le bruit et la surcharge de signal tandis que trop peu de revêtement n’améliorera pas la détection neurochimique. Avant le test, préparer une solution de stock de 10 millimillires de dopamine dans l’acide perchlorique et environ un litre de pH 7,4 tampon à base de PBS dans l’eau déionisée.
Pipette un microlitre de la solution de stock de dopamine en 10 millilitres de tampon pour faire une solution de dopamine d’environ un micromolaire. Connectez ensuite une microélecrode en fibre de carbone et une électrode de référence au chlorure argenté-argent à un potentiostat. Fixez l’électrode en fibre de carbone et l’électrode de référence dans le stade de tête de l’appareil de cellule d’écoulement et utilisez le micromanipulateur pour les abaisser dans la cellule d’écoulement.
Dessinez 60 millilitres du tampon PBS dans une seringue. Remplissez la cellule d’écoulement avec le tampon, et montez la seringue dans une pompe de seringue. Commencez à couler tampon à travers la cellule d’écoulement à une vitesse d’un millilitre par minute.
Configurez ensuite le potentiostat pour scanner moins 0,4 volts à 1,3 volts à 10 hertz et 400 volts par seconde. Appliquez brièvement la forme d’onde sur la microélecrode, observez l’oscilloscope et ajustez le gain pour éviter la surcharge. Laissez le microélecrode équilibrer pendant 10 minutes dans le tampon.
Puis dessiner la solution de dopamine diluée dans une seringue et la connecter au port d’injection de la cellule d’écoulement. Réglez le temps de course total sur le potentiostat à 30 secondes. Commencez à enregistrer les mesures, attendez 10 secondes, puis injectez 0,2 millilitres de solution dopaminerique dans la cellule d’écoulement.
Lorsque la course se termine, traiter les données avec un logiciel d’analyse de voltammétrie cyclique haute définition. Laissez la microélecrode rééquilibrer pendant 10 minutes avant d’effectuer un autre test. Lorsque les essais sont terminés, nettoyez la cellule d’écoulement en injectant trois millilitres d’eau et trois millilitres d’air dans le tampon et les ports d’injection à trois reprises.
Les fibres de carbone enduites ont été imaged avec la microscopie électronique de balayage. L’épaisseur et la taille des particules des revêtements de nanoparticules d’or peuvent être contrôlées par le temps de dépôt des électrodes. 20 minutes de dépôt d’électrodes ont donné un épais revêtement doré avec des crêtes pointues tandis que cinq minutes ont donné un revêtement en or uniforme mince.
Les microélecrodes en fibre de carbone enduites de nanoparticules d’or avaient des courants oxydatifs de pointe significativement plus élevés et une cinétique de transfert d’électrons plus rapide que les électrodes non modifiées. Le revêtement nanoparticule d’or n’a eu aucun effet significatif sur la stabilité des réponses d’électrode comme démontré ici dans une solution de dopamine. Les électrodes recouvertes de nanoparticules nues et dorées ont réagi de façon linéaire aux changements de taux d’analyse avec une ampleur beaucoup plus grande de changement dans les électrodes recouvertes d’or.
Ceci a indiqué que l’absorption de dopamine pourrait être commandée par l’intermédiaire du taux de balayage. Les électrodes nues et dorées recouvertes de nanoparticules ont répondu linéairement entre les concentrations de dopamine de 100 nanomolaires à 10 micromolaires. Une courbe asymptotique a été observée à des concentrations plus élevées, ce qui indique que la dopamine est sursaturée à la surface de l’électrode.
La capacité de détecter les changements neurochimiques à une échelle de temps plus rapide et à des sensibilités plus élevées aidera à répondre à des questions complexes en neurosciences. Cette méthode a également des utilisations dans la chimie analytique, métabolomique, et la science de l’environnement. Bien qu’il soit facile à apprendre, la démonstration visuelle est essentielle pour apprendre à faire, modifier et tester les microélecrodes.
Les orientations futures de cette méthode comprennent l’ajustement du dépôt d’or et d’autres revêtements pour tenir compte de l’épaisseur, de la taille, de la forme et de la morphologie afin d’optimiser la détection de neurotransmetteurs spécifiques. Les chercheurs devraient s’exercer à manipuler de petites fibres au microscope avant d’essayer cette technique. En outre, la solution de stock de neurotransmetteur devrait être préparée dans une hotte de fumée parce qu’ils emploient l’acide perchlorique molar de molar.
