Ce protocole utilise une approche simplifiée pour mesurer l’expression des gènes végétaux en réponse à l’herbivorie des insectes. En utilisant des feuilles détachées isolées dans les boîtes de Pétri, les insectes sont plus faciles à appliquer et à surveiller pendant la période relativement courte d’infestation contribuant à des données reproductibles sur l’expression des gènes. Ce protocole peut être adapté à de nombreuses interactions plantes/insectes.
si l’on considère les observations de base de systèmes végétaux entiers. La nature imprévisible de l’alimentation des insectes peut être difficile. Par conséquent, un approvisionnement fiable de larves correctement mises en scène et de plantes saines offrent les meilleures chances de succès.
La visualisation de la santé des plantes et des insectes devrait apparaître et se comporter est essentielle à l’obtention de résultats optimaux, en particulier pour les chercheurs nouveaux dans le domaine d’étude. Frances Perez, biologiste moléculaire au laboratoire d’amélioration génétique des fruits et légumes, fera la démonstration de la procédure avec moi. Pour préparer les plants de pommes de terre de culture tissulaire propagée nodale, obtenez d’abord des plantules de Kennebec cultivées à partir de matériaux explantés avec au moins trois à quatre nœuds.
Utilisez une lame stérile pour enlever les feuilles qui coupent les branches près de la tige principale et qui laissent environ deux millimètres de tissu de branche par feuille. Couper environ deux millimètres au-dessus et au-dessous de chaque nœud pour enlever les sections nodales des tiges et organiser les boutures nodales dans un récipient stérile de culture tissulaire contenant le milieu de transfert nodal avec la branche pointant vers le haut. Transférez ensuite les boutures nodales dans une chambre de culture des tissus végétaux pendant deux à trois semaines de croissance à 24 degrés Celsius et à une période de photo sombre de 16 heures et de huit heures.
Pour préparer les insectes à l’alimentation, obtenir le stade larvaire désiré de M.sexta et transférer une larve dans chaque puits d’un récipient de confinement approprié en fonction de la taille de la larve. Faites des modèles de placement pour chaque point de temps de récolte à l’aide de cinq plateaux robustes capables de tenir un ensemble de six boîtes de Petri de taille appropriée tapissées de papier blanc. Tracez un ensemble de six cercles à l’aide de la boîte petri de taille appropriée sur le papier dans chaque plateau et étiquetez un ensemble de cercles de contrôle A, B et C et l’autre infesté A, B, et C.Then étiqueter chaque modèle de placement avec le temps de récolte approprié.
Ensuite, étiquetez un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre pour chaque cercle dans le modèle de placement afin d’identifier de façon appropriée la perturbation, la lettre de réplication des plantes et le point de temps de récolte. Lorsque tous les tubes ont été étiquetés, placez un disque de papier filtre stérile dans une boîte de Pétri par modèle et humidifiez les disques avec de l’eau stérile sans laisser l’excès de liquide dans chaque plat. Placez ensuite un plat dans chaque cercle dans chaque modèle de placement et placez trois plants de pommes de terre du même âge et de la même taille relative à côté de chaque modèle de placement.
Pour déclencher l’infestation, utilisez des ciseaux stériles pour enlever les feuilles appariées de deux tailles de chaque plante et placer une feuille dans la boîte de Petri de contrôle et une dans la boîte de Pétri infestée pour chaque plante aussi rapidement que possible. Lorsque toutes les feuilles ont été placées, utilisez des forceps tactiles souples pour transférer au moins une larve dans chaque plat infesté le plus rapidement possible et régler la mise à jour pour le temps d’infestation désiré. Observez l’alimentation pour vous assurer que toutes les larves mangent, en remplaçant les larves qui ne se nourrissent pas au besoin.
Retirez toutes les larves de toutes les feuilles à la fin du temps d’infestation et commencez la période de la récolte. À la fin de chaque point de temps de récolte, transférer chaque feuille dans le tube correspondant et déposer immédiatement le tube dans de l’azote liquide pour congeler l’échantillon de feuilles avant l’entreposage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’isolement de l’ARN. Les larves en bonne santé avec précision devraient commencer à se nourrir immédiatement après leur placement à la surface des feuilles et l’alimentation devrait se poursuivre de façon assez uniforme tout au long de la période d’infestation.
La larve au fond de cette feuille n’a pas consommé de matériel végétal et est un exemple d’infestation infructueuse. Ces feuilles ont été détachées des plantes nodales de culture des tissus nondal de deux semaines et consommées à des taux et des styles d’alimentation différents pour chaque stade larvaire. Sur la base de ces résultats, les larves du quatrième stade ont été sélectionnées pour évaluer davantage les dommages causés aux feuilles pour les plants de pommes de terre cultivés dans le sol plus matures qui se rapprochent davantage des plants de pommes de terre cultivés en champ.
Dans ces études d’expression de gène, deux nouveaux facteurs de transcription de doigt de zinc C2H2 qui sont solidement sensibles à l’herbivorie de M.sexta ont été identifiés soutenant l’utilisation des feuilles détachées pour des analyses d’infestation. N’oubliez pas d’utiliser des feuilles appariées en âge et en taille et de bien mettre en scène les larves pour chaque expérience, car l’uniformité se traduit par des données plus reproductibles. Les tissus foliaires peuvent être assayed pour les espèces réactives d’oxygène stress-intronisés et les dérivés jasmonic d’hormone d’acide.
Des études complètes de transcriptome, de protéome ou de microbiome peuvent également être effectuées sur les tissus foliaires.
