Notre protocole évalue les effets des cellules suppressrices myéloïdes-dérivées et des macrophages tumeur-associés dans l’apoptose de cellule de tumeur T-cellule-induite. Parallèlement à l’étude des mécanismes sous-jacents des interventions thérapeutiques potentielles. Ce protocole évalue directement l’apoptose de cellules tumorales induites par les cellules T avec une sensibilité élevée et permet l’analyse longitudinale et l’imagerie des interactions cellule à cellule.
L’efficacité de l’inhibiteur de point de contrôle est mieux examinée par les cellules myéloïdes tumeur-infiltration dans certains types de tumeur. Cette technique pourrait conduire à l’identification de nouvelles thérapies pour ces tumeurs. Cette méthode pourrait non seulement faire progresser la recherche en immunologie du cancer, mais pourrait également fournir un aperçu de l’immunodéficience et des maladies auto-immunes.
Pour l’activation et l’expansion des lymphocytes T CD8-positifs isolés de la rate, d’abord aliquot une fois 10 à la cinquième T-cells CD8-positives dans 50 microlitres d’E-DMEM dans les puits individuels d’une plaque u-bottom de 96 puits. Ensuite, ajoutez une fois 10 aux cinquièmes cellules suppressrices dans 50 microlitres d’E-DMEM, ou 50 microlitres d’E-DMEM seulement, dans chaque puits de T-cellules. Ajoutez ensuite 50 microlitres de milieu d’activation fraîchement préparé et 50 microlitres d’E-DMEM, avec ou sans les réhabilités d’essai d’intérêt, aux puits appropriés.
Et placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec 95% d’humidité pendant quatre jours. Pour mettre en place une co-culture préactivée des cellules cibles à cellule T CD8-positives, ajoutez d’abord 30 microlitres de matrice de membrane soluble à fond plat diluée de 1 à 100 à 100,100, à la matrice de membrane soluble réduite par facteur de croissance aux puits appropriés d’une plaque à fond plat de 96 puits, adaptée à la microscopie. Secouez la plaque pour répartir la matrice uniformément, et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure.
Pendant que la plaque est en équilibre, préparez les cellules cibles. Aspirer le milieu, laver avec PBS, et ajouter un millilitre de 05%Trypsin-EDTA à température ambiante pendant une minute. Ajouter neuf millilitres de DMEM complétés par du sérum bovin fœtal par pipetting doux, et transférer les cellules dissociées dans des tubes.
Après avoir centrifugé les cellules, réutiliser la palette en 500 microlitres d’E-DMEM. Filtrer les cellules résuspendus à travers une passoire cellulaire, et compter les cellules vivantes. Ajustez ensuite la densité à quatre fois 10 à la quatrième cellule cible par millilitre dans l’E-DMEM frais sur la glace.
Ensuite, pipette les lymphocytes T CD8 pré-activés à quelques reprises pour résuspendre les cellules dans une seule suspension cellulaire, et transférer les lymphocytes T flottants dans un tube de 1,5 millilitre par condition. Recueillir les cellules restantes avec 200 microlitres de PBS par puits, transférer les lavages dans les tubes appropriés de 1,5 millilitre, et centrifugeuse. Aspirer le milieu et ajouter un millilitre d’E-DMEM à chaque tube pour la centrifugation.
Après centrifugation, réutiliser les granulés dans 100 microlitres d’E-DMEM frais par tube. Après comptage, réglez les cellules de chaque tube à une densité de 1,6 fois 10 à la cinquième cellule T CD8-positive préactivée par millilitre de milieu, et placez les cellules sur la glace. Lorsque les cellules sont prêtes, aspirez la matrice membranaire du sous-sol de chaque puits de la plaque de microscopie de 96 puits et ajoutez 50 microlitres de cellules cibles à des puits individuels dans les 60 puits intérieurs de la plaque avec mélange.
Ajouter 25 microlitres d’E-DMEM complétés par quatre fois 10 aux troisièmes unités par millilitre d’IL2, et 10 micromolaires de substrat fluorogène caspase-3 aux puits appropriés. Ajoutez ensuite 25 microlitres de lymphocytes T CD8 positifs pré-activés aux puits appropriés. Enfin, ajoutez e-DMEM aux puits appropriés pour faire un volume total de jusqu’à 100 microlitres.
Ajouter 200 microlitres de PBS ou d’eau stérile dans tous les puits vides. Secouez la plaque et laissez la plaque sur une surface plane pendant 10 minutes. Pour imager les cellules, réglez le microscope pour acquérir des images en contraste de phase.
Ainsi que les canaux de fluorescence adaptés à la protéine fluorescente à restriction nucléaire, et les fluorogéniques activés caspase-3 substrat fluorophores utilisés dans l’expérience. Capturez ensuite des images de chaque puits expérimental en contraste de phase et des deux canaux de fluorescence toutes les une à trois heures pendant au moins 72 heures. Pour analyser les images capturées, ouvrez une image à partir d’un puits de contrôle contenant uniquement des cellules cibles et un milieu sans substrat caspase-3 dans le canal de fluorescence utilisé pour le signal du substrat.
Observez si un signal de fluorescence inapproprié est émis par les noyaux. Si le signal du substrat est apparent à l’intérieur des noyaux, utilisez un mélange spectral pour augmenter le pourcentage de signal de substrat retiré du signal des noyaux, jusqu’à ce que le signal du substrat disparaisse. Ensuite, voir un puits de contrôle contenant uniquement des noyaux non étiquetés cellules effectrices dans le milieu sans substrat caspase-3 dans les deux canaux de fluorescence individuellement.
Observez si un signal est émis par les noyaux. Si aucun signal n’est apparent dans les différents canaux, aucun démixage spectral n’est nécessaire. Pour résoudre les objets fluorescents dans les deux canaux de fluorescence, utilisez une méthode de soustraction de fond de fluorescence avec des paramètres pertinents pour l’échantillon et les paramètres appropriés pour le fractionnement des bords.
Utilisez des images de la monoculture cellulaire cible pour établir des paramètres pour la fluorescence nucléaire des cellules cibles. Utilisez des images de la monoculture des cellules effectrices pour établir des paramètres pour la fluorescence nucléaire apoptotique induite par le substrat. Utilisez des images de co-culture pour vérifier ou affiner les paramètres de fluorescence nucléaire apoptotique induite par le substrat dans les cellules cibles.
Pour déterminer la taille minimale des noyaux cibles, utilisez des images dans le canal de signal des noyaux à partir des puits contenant uniquement des cellules cibles avec substrat de caspase. Pour déterminer la taille moyenne des noyaux effecteurs apoptotiques, utilisez des images dans le canal de signal du substrat à partir des puits contenant uniquement des cellules effectrices avec substrat de caspase. Pour compter le nombre de noyaux cellulaires cibles de fluorescence, mettre en place une procédure d’analyse à l’aide d’une restriction de taille minimale appropriée.
À l’aide d’images de monoculture de cellules effectrices, mettre en place une deuxième procédure d’analyse pour compter le nombre de noyaux apoptotiques qui sont plus grands que la taille moyenne des noyaux effecteur apoptotique. Ensuite, mettre en place une troisième procédure d’analyse pour compter le nombre de cellules cibles apoptotiques en comptant le nombre de noyaux dans lesquels le signal du noyau et le signal de substrat limité par la taille co-localisent significativement. Typiquement, les cellules cancéreuses augmentent le signal de fluorescence dans leurs noyaux suivant l’activation d’un biocapteur de caspase de ciblage nucléaire quand les cellules prennent contact avec des lymphocytes T CD8-positifs pré-activés par des anticorps en l’absence des cellules suppressrices.
La taille du noyau des lymphocytes T CD8 positifs est plus petite que celle des cellules cancéreuses. Ainsi, les cellules effectrices apoptotiques peuvent être exclues du nombre de cellules cibles apoptotiques par une méthode d’analyse d’image de restriction de taille. Bien que certaines cellules cancéreuses cibles présentent une petite forme arrondie sans fluorescence du substrat, cela n’affecte pas l’analyse.
Comme ces cellules subissent une mitose plutôt qu’une apoptose et sont donc exclues du nombre de cellules cibles apoptotiques par un masque de chevauchement du signal du substrat nucléaire. La co-culture des cellules cancéreuses cibles avec des lymphocytes T CD8 positifs pré-activés augmente l’apoptose cellulaire tumorale au-dessus des niveaux d’apoptose spontanée dans les monocultures de cellules cancéreuses. Généralement, lors de l’utilisation d’un rapport optimal des cellules cancéreuses cibles aux cellules effectrices, un pic dans le nombre de cellules cancéreuses cibles apoptotiques peut être observé.
Ce pic devient plus distinct lorsque les données sont exprimées comme la fraction apoptotique de la population cellulaire cible. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est de mettre en place des monocultures de cellules cibles et des monocultures de cellules effectrices pour une utilisation dans le développement des masques d’analyse. Cette méthode peut fournir un aperçu de la durée et de la fréquence des interactions des lymphocytes T aux cellules cancéreuses, et des conditions associées à la cytotoxicité dépendante des gènes dans les cellules humaines et souris.
Nous développons actuellement cette analyse dans un écran à haut débit utilisant des cellules humaines pour identifier les composés qui inhibent l’immunosuppression myéloïde à base de cellules et améliorent ainsi l’efficacité des inhibiteurs des points de contrôle.
