La résolution de la structure du domaine récepteur de la ryanodine peut aider à notre compréhension du mécanisme moléculaire de la fonction protéique, de l’action insecticide et du développement de la résistance aux insecticides. Cette mesure implique l’utilisation de la cristallographie aux rayons X pour l’illustration de la structure, qui est considérée comme un étalon-or pour la détermination de la structure protéique à résolution quasi atomique. Cette structure à haute résolution du domaine des récepteurs de la ryanodine des insectes révèle le mécanisme de l’accouplement des canaux et fournit un modèle important pour le développement d’insecticides spécifiques aux espèces à l’aide d’approches de conception de médicaments basées sur la structure.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, parce que les cristallographes protéiques potentiels doivent être compétents en biochimie, biophysique, informatique et mathématiques. Commencez par amplifier l’ADN correspondant à la protéine d’intérêt par réaction en chaîne de polymése. À la fin de la réaction, exécuter l’ensemble des 50 microlitres de mélange de réaction sur un gel agarose de 2%, et extraire l’ADN avec un kit d’extraction de gel selon les protocoles standard.
Ensuite, linéariser l’ADN vecteur du LIC en mélangeant 20 microlitres de l’ADN vecteur avec 6 microlitres de tampon de réaction 10X et 4 microlitres d’enzyme de restriction SspI dans 30 microlitres d’eau double-distillée. Incuber ce mélange de réaction pendant trois heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faire fonctionner l’ensemble du mélange de réaction sur un gel d’agarose de 1 %, suivi de l’extraction de l’ADN vectoriel linéarisé avec un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
Ensuite, effectuez des traitements distincts de polymélase d’ADN T4 sur 5 microlitres de l’ADN vectoriel linéarisé et de l’ADN amplifié d’insertion pcr, selon les protocoles standard. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante, suivi de 20 minutes d’inactivation thermique enzymatique à 75 degrés Celsius. Effectuez la réaction d’annealage de clonage indépendante de ligature en combinant 2 microlitres de l’ADN d’insertion traité T4 avec 2 microlitres de l’ADN vecteur LIC traité T4 pour une incubation de 10 minutes à température ambiante.
Pour transformer les cellules BL21(DE3)E. Coli avec le plasmide recombinant, décongelez 50 microlitres de cellules compétentes sur la glace et ajoutez environ 1 microlitre du plasmide annelé au tube. Feuilletez doucement le tube deux à trois fois pour mélanger les cellules et l’ADN, et placez le tube sur la glace pendant 20 minutes.
À la fin de l’incubation, choquer les cellules à 42 degrés Celsius pendant 40 secondes, suivies de deux minutes de retour sur la glace. Ensuite, ajoutez un millilitre de LB à température ambiante au tube et placez les cellules sur un shaker de 250 RPM pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation secouant, plaque 150 à 200 microlitres de ce mélange sur les plaques de sélection, et inverser les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, la culture d’une seule colonie en 100 millilitres de milieu 2-YT, complétée par la kanamycine, dans un incubateur shaker à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, inoculer un litre de 2-YT moyen, complété par la kanamycine, avec 10 millilitres de culture de nuit, et incuber à 37 degrés Celsius avec secouant jusqu’à ce que la lecture OD600 atteint environ 0,6. Ensuite, induire la culture avec IPTG à une concentration finale de 0,4 millimolaire, et faire croître les cellules pendant cinq heures à 30 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, récolter les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille à 10 grammes de bactéries par 40 millilitres de concentration tampon de lyse. Perturber les parois cellulaires par sonication à une amplitude de 65%, et une seconde sur une seconde, pendant huit minutes. Enlever les débris cellulaires par centrifugation.
Ensuite, filtrer le supernatant par un filtre de 22 micromètres, et charger la solution dans une boucle d’échantillon. Pour purifier la protéine de fusion, injectez le supernatant filtré de la boucle de l’échantillon dans une colonne nickel-nitrolotriacetic de cinq millilitres sur un système de purification avec un gradient linéaire de 20 à 250 millimolar imidazole. Fendre la protéine cible élitisée avec la protéase du virus de l’etch du tabac, à un rapport de 1 à 50, pendant la nuit à 4 degrés Celsius, et purifier le mélange de réaction de clivage sur une colonne de résine d’amylose, et une colonne nickel-nitrolotriacétique, pour enlever l’étiquette et la protéase du virus de l’etch du tabac.
Dialyz le flux de la colonne nickel-nitrolotriacetic contre le tampon de dialyse pour réduire la concentration de sel, et purifiez l’échantillon sur une colonne d’échange d’anion par un gradient linéaire de chlorure de potassium de 20 à 500 millimillires dans le tampon d’élitution. Ensuite, concentrez la protéine dans un concentrateur centrifuge. Injectez la protéine concentrée dans une colonne de filtration de gel Superdex 200 26/600 pour vérifier l’homogénéité et évaluer la pureté de la protéine de 15 %SDS-PAGE.
Pour préparer la protéine à la cristallisation, concentrez l’échantillon de protéines purifiées à 10 milligrammes par millilitre dans le concentrateur centrifuge, et échangez tampon au tampon de cristallisation avant le stockage de 80 degrés Celsius. Pour effectuer le criblage de cristallisation, utilisez la méthode de diffusion de vapeur de chute assise à 295 Kelvin, avec plusieurs kits de cristallisation, et un système automatisé de manipulation liquide dans un format de 96 puits. À la fin du réglage de la goutte, sceller la plaque de cristallisation de 96 puits pour éviter l’évaporation et permettre l’équilibrage de la goutte de protéines dans le tampon du réservoir.
Placer les plaques dans un incubateur en cristal à 18 degrés Celsius. Vérifiez périodiquement les plaques au microscope léger pour surveiller la formation et la croissance des cristaux. Pour différencier les cristaux protéiques des cristaux de sel, ajoutez un microlitre de colorant en cristal protéique à la goutte cible et observez les cristaux au microscope après une heure.
Les cristaux protéiques apparaîtront bleus. Pour optimiser davantage les cristaux, utilisez les conditions de cristallisation positives et la méthode de diffusion de vapeur de goutte suspendue dans les plaques de 24 puits, suivie de l’incubation dans l’incubateur de cristal à 18 degrés Celsius. Pour déterminer la structure protéique, montez les cristaux sur un cryoloop sous un microscope léger pour le refroidissement flash dans l’azote liquide, et placez les cristaux dans un unibuck pour le stockage et le transport.
Pré-filtrer les cristaux dans un diffractor de rayons X interne, en utilisant la fonction de centrage manuel pour monter et centrer les cristaux. Ensuite, utilisez le logiciel de diffraction des rayons X pour recueillir les données. Pour indexer, intégrer et mettre à l’échelle l’ensemble de données, en utilisant la suite HKL-2000, sélectionnez d’abord le détecteur et chargez l’ensemble de données.
Ensuite, effectuez la fonction de recherche de pointe pour trouver les taches de diffraction. Indexer les taches, sélectionner le bon groupe d’espace et effectuer l’intégration de pointe. Ensuite, mettez à l’échelle l’ensemble de données.
Ajustez à nouveau le modèle d’erreur et l’échelle. Enregistrez le fichier sca de sortie. Pour déterminer la structure à l’aide de la suite logicielle Phenix, créez un nouveau projet.
Tout d’abord, exécutez Extriage avec le fichier sca pour calculer le nombre possible de molécules protéiques dans l’unité asymétrique. Ensuite, pour résoudre le problème de phase par remplacement moléculaire, exécutez Phaser, en utilisant le fichier de données de diffraction, le fichier de structure de modèle avec l’identité de haute séquence et la similitude structurelle que la protéine cible, et le fichier séquence de protéines, pour trouver la solution. Effectuez la construction automatique dans Phenix pour générer le modèle initial, en utilisant le fichier de sortie de Phaser et le fichier séquence de la protéine cible.
Construire manuellement la structure dans la densité électronique expérimentale modifiée à l’aide de COOT, et affiner à l’aide de Phenix affiner dans les cycles itératifs. Valider le modèle final à l’aide des outils de validation de Phenix. Dans cette expérience représentative, la purification du domaine terminal final de la protéine récepteur de la ryanodine à dos de diamant, comme démontré, a donné une seule bande à environ 21 kilodaltons par l’analyse STS-PAGE.
Le volume d’élitution de la colonne de filtration de gel a confirmé que le domaine end-terminal purifié de récepteur de ryanodine était un monomère. Pour la cristallisation, les conditions les plus optimales dans lesquelles des cristaux en forme de plaque de haute qualité ont été formés était en présence de 1 MOLAIRE HEPES d’un pH de 7, et de 1,6 sulfate d’ammonium molaire. La détermination de la structure protéique à partir de l’ensemble de données de diffraction utilisant des logiciels tels qu’ils ont été démontrés a révélé le domaine terminal final du récepteur de la ryanodine à dos de diamant couvrant les résidus 1 à 205.
Les protéines atteintes de troubles importants, de régions flexibles ou ayant de faibles affinités sont difficiles à cristalliser. Dans ces scénarios, les stratégies d’ingénierie protéique telles que la réduction de l’entropie de surface, la troncature en boucle et la liaison croisée peuvent augmenter la probabilité d’obtenir de meilleurs cristaux protéiques. En plus de révéler des structures protéiques à haute résolution, la cristallographie aux rayons X peut également être utilisée pour étudier les interactions protéine-pesticide, ce qui pourrait aider à la conception de pesticides à base de structure.
