Nous sommes reconnaissants pour des discussions approfondies avec les membres du laboratoire Ju et laboratoire de Zhong et le soutien financier de la Wright State University.

Remarque : Le protocole décrit ici est conçu pour le dépistage des plasmides de bibliothèque contenues dans dix plaques de 96 puits mais peut évoluer vers le haut ou vers le bas en conséquence. Le protocole doit être répété pour compléter l’examen préalable de toute bibliothèque. Généralement, dépistage de 10 plaques de gènes de la bibliothèque chaque fois peut être confortablement géré par 1 personne.
1. préparation pour la Transformation de la levure de 96 puits
Remarque : Cette étape est faite comme précédemment décrit7,10.
<ol><li>Aliquote 5 µL (environ 50 à 100 ng) de l’ADN d’une bibliothèque de plasmide déployèrent dans chaque puits d’une plaque de 96 puits fond rond de plasmide. Remarque : Un exemple d’une telle bibliothèque serait une levure gène surexpression bibliothèque10.</li>
	<li>Inoculer 150 mL de levure peptone dextrose (DPJ) médias dans un ballon jaugé de 500 mL avec une colonie (2 – 3 mm de diamètre) de la souche de levure haploïde W303α. Les incuber pendant la nuit à 30 ° C sous agitation (200 tr/min).</li>
	<li>Le lendemain matin, mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour et diluer la culture de levure à OD600 = 0,1 (jusqu'à) 2 l de la DPJ. Incuber à 30 ° C sous agitation (200 tr/min) pendant environ 5 h, jusqu'à ce que la culture atteint OD600 = 0,4 à 0,6.</li>
</ol>2. Transformation de levure
<ol><li>Récolte de la culture de levure par 8 bouteilles de centrifugeuse stérile 250 mL de remplissage et leur centrifugation à température ambiante à 3 000 g pendant 10 min. décanter le liquide surnageant sans déranger le culot. NOTE : Effectuer toutes les étapes de centrifugation à température ambiante.</li>
	<li>Laver la levure avec stérile distillée H2O. Pour ce faire, ajouter 100 mL de stérile H2O à chaque bouteille de la centrifugeuse et le vortex à Resuspendre le culot cellulaire. Combiner les cellules lavées dans 2 bouteilles et centrifuger à 3 000 g pendant 5 min. décanter le liquide surnageant.</li>
	<li>Laver les cellules dans chaque bouteille dans 100 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc ; 10 mM Tris, pH 8,0 ; 1 mM EDTA) et les centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min. Pour désactiver le surnageant.</li>
	<li>Pendant la centrifugation, faites bouillir 5 mL de sperme de saumon ADN (10 mg/mL) à 100 ° C à l’aide d’un chauffe-bloc pendant 3 min et puis refroidir sur glace.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 25 mL de 0.1 M LiOAc/1XTE dans chaque bouteille, combiner les cellules resuspendues et transférez-les sur un flacon de 150 mL. Ajouter 5 mL de sperme saumon refroidi préalablement ADN et il incuber à 30 ° C sous agitation (225 tr/min) pendant 30 min.</li>
	<li>Versez le mélange de cellules dans un réservoir jetable stérile et, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 35 µL du mélange cellulaire dans chaque puits de la plaque à 96 puits fond rond contenant l’ADN de plasmide de bibliothèque. Plaques de Vortex le 96 puits à l’aide d’une plaque vortexer pendant 1 min à 1 000 tr/min. Incuber les boîtes pendant 30 min à 30 ° C sans agitation. Remarque : Ne pas empiler les plaques, donc la chaleur peut transférer plus efficacement. Nous avons constaté que Vortex les plaques 96 puits à 1 000 tr/min ne provoque pas de liquide se répandre hors du puits, mais une vitesse sécuritaire vortex doit être testée avant de passer à l’étape.</li>
	<li>Dans une fiole, préparer 200 mL du tampon transformation contenant une concentration finale de 40 % PEG3350, 10 % DMSO et 0,1 M LiOAc. Préparer le tampon de transformation immédiatement avant utilisation et bien mélanger en agitant.</li>
	<li>Supprimer 96 plats de l’incubateur à 30 ° C et mélanger pendant 30 s à 1 000 tr/min à l’aide de la plaque vortexer. Ajouter 125 µL de tampon de la transformation à chaque puits et puis vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min.</li>
	<li>Incuber les plaques à 30 ° C pendant 30 min et puis chauffer choc la levure en plaçant les plaques dans un incubateur à 42 ° C pendant 15 min. Remarque : Ne pas empiler les plaques.</li>
	<li>Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g. Retirer le tampon de la transformation des puits en inversant les plaques sur une poubelle et le dumping avec force la mémoire tampon des plaques. Rapidement, épongez les plaques inversées sur une serviette en papier propre pour enlever n’importe quel liquide sur le dessus des plaques.</li>
	<li>Rincer les cellules en ajoutant à la plaques 200 µL d’un minimum d’abandon moyen correspondant au marqueur sélectionnable sur le plasmide de bibliothèque. NOTE : Nous avons utilisé un Ura-milieu synthétique.</li>
	<li>Centrifuger les plaques pendant 5 min à 3 000 x g et éliminer le surnageant sur une poubelle comme au point 2.10.</li>
	<li>Ajouter 160 µL de minimes Ura-milieu contenant 2 % de glucose. Vortex les plaques pendant 1 min à 1 000 tr/min et les incuber à 30 ° C pendant 48 h sans agiter. Après 48 h, Notez qu’une pastille de levure transformée est visible au bas de chaque puits.</li>
	<li>À l’aide d’un distributeur de liquide, ajouter 100 µL de glucose contenant Ura-médias dans chaque cupule d’un nouvel ensemble de plaques de 96 puits.</li>
	<li>Vortex les plaques contenant de la levure transformée (de l’étape 2.13) à 1 000 tr/min pendant 30 s. à l’aide d’un réplicateur de 96 broches en plastique stérile, placez les chevilles dans les puits contenant de la levure transformée et puis leur inoculer dans les puits correspondants des nouvelles plaques rempli de médias. Le nouveau incuber à 30 ° C pendant 24 h. NOTE : Si vous travaillez avec 10 plaques, le milieu peut également être dispensé manuellement à l’aide de pipettes multicanaux.</li>
	<li>Après 24h, une pastille de levure doit être visible dans le fond de chaque puits contenant de la levure transformée avec succès. Pour enregistrer ces souches de levures dans les stocks de glycérol, ajouter 50 µL de glycérol à 50 % dans chaque puits, vortex les plaques pendant 30 s à 1 000 tr/min, sceller les plaques avec du ruban d’étanchéité et congeler à-80 ° C. Remarque : Les étapes ci-dessus suffit à être exécutée une fois. Futures projections de modèles différents de levure contre le même réservoir de réactif jetable de bibliothèque peuvent commencer provenant des stocks de glycérol et procéder immédiatement de la procédure ci-dessous.</li>
</ol>3. l’accouplement entre les cellules qui contiennent des gènes de la bibliothèque et de la levure de requête
<ol><li>Afin de raviver les souches de bibliothèque sur le stock de glycérol, prendre les plaques de 96 puits sortis du congélateur-80 ° C, retirez la bande d’étanchéité et laissez la levure décongeler à température ambiante pendant environ 30 min.</li>
	<li>Une fois que la levure a dégelé, utilisez un réplicateur de 96 broches en plastique stérile pour inoculer les stocks de glycérol à 160 µL de frais Ura-médias contenant 2 % de glucose en plaques 96 puits et les incuber à 30 ° C pendant 24 h. immédiatement après que les souches de bibliothèque sont utilisés , sceller les plaques avec bande d’étanchéité et les ramener au congélateur à-80 ° C.</li>
	<li>Le même jour, les souches de la bibliothèque (W303α) sont décongelés, inoculer la souche de levure de requête (en l’occurrence, FUS en W303a) à 50 mL de la DPJ et développez-le du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 250 tr/min.</li>
	<li>Le lendemain, verser la souche de levure de requête à un réservoir de réactif jetable stérile et aliquote 160 µL de la souche de requête pour chaque puits d’une plaque 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Utilisation du distributeur de liquid, distribuer 160 µL des médias de la DPJ dans chaque puits de dix plaques de 96 puits. Utiliser ces plaques plus tard pour l’accouplement de la souche de levure de requête avec la levure de la bibliothèque.</li>
	<li>Brièvement, vortex la plaque à 96 puits contenant la souche de la requête, puis utilisez un réplicateur 96 broches stérile pour transférer la requête souche pour les plaques de la DPJ.</li>
	<li>Brièvement le vortex la bibliothèque plaques de la souche et, pour chaque plaque de souche de bibliothèque, utiliser un nouveau réplicateur de 96 broches stérile pour transférer les souches de bibliothèque pour les plaques de la DPJ qui ont été inoculés avec la souche de la requête. Remarque : Les cellules en glycérol perdent leur viabilité après plusieurs cycles de gel-dégel. Les souches de la bibliothèque de retour vers le stockage à long terme (congélateur à-80 ° C) dès que possible gardera la bibliothèque de bonne qualité et prêt pour une utilisation future. Bien entretenu, le stock de glycérol peut être congelé et décongelé au moins 10 fois. Nous recommandons également garder une copie de travail et des copies de sauvegarde de l’encours de glycérol. Lorsque le stock de travail ne fonctionne pas, immédiatement faire une nouvelle copie de travail de la copie de sauvegarde.</li>
	<li>Incuber les plaques de la DPJ à 30 ° C pendant 24 h. Note qu’une pastille de levure sera visible dans le fond de chaque puits après 24h.</li>
	<li>Plaques de remplissage 96 puits avec un support minimal d’abandon contenant 2 % raffinose, correspondant aux marqueurs sélectionnables sur le plasmide dans la souche de la requête ainsi que sur le plasmide de bibliothèque (par exemple, ici Ura - son-).</li>
	<li>Un réplicateur 96 broches stérile permet de transférer les levures de la DPJ accouplement des cultures à des milieux sélectifs. Incuber les plaques 96 puits à 30 ° C pendant 48 h ; uniquement les cellules qui ont jumelé de levure et diploïde formé des cellules et, donc, contiennent tous deux le plasmide de requête et le plasmide de bibliothèque sera capable de croître dans ce média. Après 2 jours, observer qu’un pellet est visible sur le fond des puits.</li>
</ol>4. dosage de spotting
<ol><li>
Après 48 h de croissance dans les milieux sélectifs contenant du raffinose, repérer les levures sur milieu gélosé.
	<ol>
<li>Préparer 2 jeux de plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % d’agar à l’aide de plaques de polystyrène clair, un galactose contenant de 2 % et l’autre contenant 2 % de glucose.</li>
		<li>Plaques de Vortex le 96 puits pendant 1 min à 1 000 tr/min, puis repérer la levure aux plaques Ura-His-abandon contenant du galactose de 2 % et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque sont induits) et des plaques de Ura-His-abandon contenant 2 % de glucose et 2 % d’agar (gènes FUS et bibliothèque réprimée) utilisant une machine robotique de détachage, par lequel la culture de chacun est bien repérée sur les géloses en quatre exemplaires (p. ex., la culture en 1 bien est repérée à 4 taches sur la gélose).</li>
		<li>Après avoir repéré, laisser les géloses sécher et ensuite les placer à l’envers dans une étuve à 30 ° C. Photographier les géloses toutes les 24 h pour enregistrer une croissance plus rapide/plus levure dont la toxicité pour la souche de requête est sauvée ou d’enregistrer une croissance plus lente et moins dont la toxicité pour la souche de requête est exacerbée. Incuber les boîtes pendant 4 jours. Remarque : La culture dans chaque bien peut être repérée sur plaques de gélose 1-to-1, comme indiqué dans une précédente méthode axée sur la transformation10. Cependant, le 1 à 4 taches ici (ce qui peut être configuré facilement utiliser la machine robotisée détachage) augmente de manière significative la robustesse du dosage en réduisant le nombre de faux positifs. Hits positifs sont considérés uniquement lorsque toutes les 4 colonies du même bien montrent un phénotype similaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole pour effectuer un écran de surexpression de plasmide dans la levure à l’aide de l’accouplement d’introduire de la bibliothèque de plasmide dans le modèle de la levure. En utilisant cette approche, plusieurs modèles de levure de toxicité de protéine maladies neurodégénératives peuvent projetés à l’aide de la même collection de levure transformée avec une bibliothèque de plasmide. Le laborieux processus de transformation ne doit être effectuée une seule fois, après...

La levure Saccharomyces cerevisiae a été employé couramment dans la recherche scientifique fondamentale1 pour comprendre les processus cellulaires directement liés aux maladies humaines. En outre, il a été utilisé comme un organisme modèle pour étudier les protéines associées à la maladie humaines, telles que celles liées aux maladies neurodégénératives plus courants, y compris la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la maladie de Huntington et amyotrophique Latérale amyotrophique (SLA)2. Un avantage du modèle levure est la facilité avec laquelle un génome-large écran peut être effectué afin d’identifier des voies cellulaires liés à la toxicité des protéines liées à la maladie, ce qui donne un aperçu sur le mécanisme de leur toxicité. Un tel écran est appelé un écran Bibliothèque surexpression, dans lequel chacun des 5 500 gènes levure dans une bibliothèque qui se transforme en un modèle de levure pour identifier quels gènes peuvent modifier la toxicité lorsque surexprimés. Cette méthode de dépistage a été appliquée avec succès dans les modèles de la levure de multiples protéines associés à la maladie de neurodégénératives, y compris la huntingtine pour la maladie de Huntington3, α-synucléine pour la maladie de Parkinson4,5 , Bêta-amyloïdes de la maladie d’Alzheimer,6et FUS et TDP-43 ALS7,8,9. Alors qu’il est généralement fait dans une manière haut débit10, l’étape la plus fastidieuse de l’écran se transforme individuellement 5 500 gènes de levure d’une bibliothèque de rangées. Cette étape doit être exécutée chaque fois que la projection est répétée, et chaque fois qu’un modèle de levure nouvellement créé doit être étudié. Il est important de trouver un moyen plus efficace pour accomplir cette tâche.
Les cellules de levure peuvent exister stablement sous forme haploïde et diploïde. Il y a deux en face de l’accouplement des types de cellules haploïdes, l’accouplement de type a et α. cellules haploïdes de chaque croisement type produire et sécrètent leur propre phéromone accouplement spécifique, auxquels répondent seules les cellules de type sexuel opposé. Cela permet l’accouplement entre un et α des cellules pour produire des cellules diploïdes stables, a/α. Ce processus est spontanée et très efficace11. Nous pouvons tirer profit de ce cycle de vie unique de S. cerevisiae d’introduire de la bibliothèque de plasmide. Plus précisément, chaque gène dans la bibliothèque de plasmide déployèrent se transformeront en cellules haploïdes d’un type sexuel, c'est-à-dire, cellule α. Ces cellules contenant les gènes de la bibliothèque seront alors stockées en stock de glycérol dans un format de 96 puits rangé. Pour chaque modèle de levure qui doit être projeté, contenant les gènes de la bibliothèque de cellules de levure peuvent être décongelés sur le stock de glycérol, et le dépistage peut être effectué via l’accouplement avec le modèle de levures d’intérêt dans le type sexuel opposé, c'est-à-diretype sexuel un. Cette idée d’utiliser l’accouplement de réunir les deux gènes dans la levure n’est pas nouveau. Elle a été appliquée avec succès dans la levure de haut-débit dépistage-hybride, dans lequel un appât construire (p. ex.fusions de Gal4-DNA-binding domain) dans un seul type d’accouplement est réuni par accouplement avec une proie de construction d’une bibliothèque de rangées 12. Toutefois, cette stratégie n’a jamais été appliquée dans la surexpression bibliothèque de films, qui ont toujours utilisé les méthodes traditionnelles de transformation.
Notre laboratoire a déjà établi un modèle de la levure de la protéine associée aux ALS FUS7. Par le biais de criblage de surexpression en utilisant la méthode de transformation, nous avons découvert cinq gènes de la levure (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1et VHR1) que sauver la toxicité du FUS lorsque surexprimés. Ces résultats ont été indépendamment confirmés avec une étude similaire réalisée par un autre groupe8. hUPF1, un homologue humain du ECM32, s’est avéré par la suite supprimer la toxicité des cellules neuronales primaires13 et dans un modèle animal de ALS14 établissements. À l’aide de ces cinq gènes comme preuve de principe, nous démontrons que tous les cinq gènes secourir de même toxicité FUS lorsqu’ils sont introduits dans le modèle de levure FUS par l’accouplement. Puisque les cellules de levure contenant les gènes de la bibliothèque peuvent être stockés en permanence en stock de glycérol et relancés chaque fois que nécessaire, cette méthode basée sur l’accouplement supprime la longue étape de transformation chaque fois que la bibliothèque doit être projeté contre. Étant donné que l’accouplement est très efficace avec aucune transformation de plasmide impliquée, cette stratégie diminue également de façon significative le coût associé à la purification et la transformation d’une bibliothèque de gros plasmide. Nous appliquerons avec succès cette méthode dans une bibliothèque de dépistage contre le modèle de la levure du FUS.
La procédure de dépistage basé sur l’accouplement est brièvement décrite à la Figure 1. Au départ, la bibliothèque du plasmide qui se transforme en une souche de levure haploïde de l’accouplement de type α, en utilisant un protocole de transformation de levure de haut-débit dans lesquels chaque puits d’une plaque 96 puits contient levure transformée avec un plasmide de bibliothèque spécifique. Cette collection de levure transformée est enregistrée comme un stock de glycérol qui peut être décongelé et relancé pour une utilisation plus tard. Le modèle de levures d’intérêt, dans cette affaire toxicité FUS, doit être généré dans une souche de levure haploïde avec le type sexuel opposé (type sexuel un). D’une manière de haut débit utilisant des réplicateurs de 96 broches stériles, le FUS souche souches de levure contenant la bibliothèque de plasmide transférés à plaques à 96 puits contenant des médias riches et sont autorisés pour s’accoupler. Après l’accouplement, un petit volume de chaque puits de la culture d’accouplement est transféré à plaques à 96 puits contenant des médias synthétiques d’abandon dans lequel levure uniquement diploïde contenant les deux Dug et gènes de bibliothèque peuvent se développer. Une machine robotisée tache sert ensuite de transférer la culture de levure de chaque puits, sur plaques de gélose, où l’expression des gènes Bibliothèque et FUS est induite.  En outre, culture de levure est repérée pour contrôler les boîtes de gélose où FUS et les gènes de bibliothèque ne sont pas exprimées. Après une croissance sur milieu gélosé, gènes de sauvetage ou d’aggravent la toxicité FUS seront identifiés.

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

La levure de bière a été largement utilisée comme un modèle dans l’étude des protéines associées à des maladies humaines. Génome-large dépistage génétique est un outil puissant couramment utilisé dans les études de levure. L’expression d’un certain nombre de protéines associés à la maladie neurodégénérative levure provoque la cytotoxicité et formation globale, récapitulant les résultats observés chez les patients atteints de ces troubles. Nous décrivons ici une méthode de dépistage d’un modèle de la levure de la protéine associée à la sclérose latérale amyotrophique FUS pour les modificateurs de sa toxicité. Au lieu d’utiliser la transformation, cette nouvelle plateforme de projection s’appuie sur l’accouplement de levure pour introduire une bibliothèque déployèrent des plasmides dans le modèle de levure. La méthode d’accouplement a deux avantages : Premièrement, il est très efficace ; Deuxièmement, la bibliothèque déployèrent préalablement transformée des plasmides peut être conservée pendant à long terme comme un stock de glycérol et rapidement appliquée aux autres écrans sans la fastidieuse étape de transformation dans le modèle de levure chaque fois. Nous montrons comment cette méthode peut être utilisée avec succès pour dépister les gènes qui modifient la toxicité du FUS.

La protéine associée aux ALS FUS, une protéine de liaison ARN/ADN, a été étudiée précédemment dans la levure haploïde7,8. Génétique de dépistage à l’aide de la méthode axée sur la transformation découvert plusieurs gènes de la levure qui suppriment la toxicité FUS. Plus tard, l’homologue humain de l’un des gènes de la levure a été démontrée efficace à réprimer la toxicité neuronale de cellules prim...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

mating-based-overexpression-library-screening-in-yeast

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K vues.  Wright State University. Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Vidéo: Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Recherche

Biochimie

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Un écran de suppresseur de Deep-séquençage-assisted, spontanée chez la levure Scissipare Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Génétique

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Immunologie et infection

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biologie

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimisation des fonctions protéiques grâce à des techniques d’affichage de surface de levure

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bio-ingénierie

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Résumé

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Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Un écran de suppresseur de Deep-séquençage-assisted, spontanée chez la levure Scissipare Schizosaccharomyces pombe

Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Réalisé Evolution Méthode