Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

1. Livraison hydrodynamique de sRANKL MC ADN <ol><li> Livraison hydrodynamique via souris veine de la queue <ol><li> Peser la souris avant l&#39;injection dans la veine caudale. Diluer sRANKL ou la protéine fluorescente verte (GFP) dans MC solution de Ringer (pré-chauffer à 37 ° C) dans un volume total d&#39;environ 10% du poids corporel de la souris. </li><li> Réchauffez la souris dans une cage pendant 10 minutes avant l&#39;injection afin de dilater les vaisseaux sanguins et faire nervures latérales (EFV) visibles. Surveillez attentivement la souris pour éviter la déshydratation et d&#39;hyperthermie. </li><li> Dès que les VL sont dilatés et visibles, transférer la souris pour le dispositif de retenue et insérer la fiche assez loin dans le canon pour restreindre le mouvement. Surveillance de la souris pour les activités normales comme la respiration. Réglez la prise de contention si nécessaire. </li><li> Désinfecter la zone d&#39;injection 3/4 de la pointe de la queue avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Utiliser une aiguille 27-30 G pour injection veine de la queue de la souris. Tenez la queue fermement d&#39;une main et insérer l&#39;aiguille dansà la veine de la queue. Appliquer une pression sur la seringue et compléter l&#39;injection dans 5-7 sec. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la veine de la queue et appliquer une pression avec une boule de coton sur le site d&#39;injection pour arrêter le saignement. Surveillance de la souris pendant 15-30 minutes, puis transférer la souris vers vivarium fois le taux de respiration est réduite à son taux normal. </li></ol></li><li> Confirmation de l&#39;expression et la quantification de souris systémique de transfert souris Sérum TRACP5b Poster Gene <ol><li> Réchauffez la souris dans une cage pendant 5-10 min afin de dilater les vaisseaux sanguins et faire VL visible. Surveillez attentivement la souris pour éviter la déshydratation et d&#39;hyperthermie. </li><li> Faire une petite incision avec une lame à la queue de la souris à un site d&#39;une suite de la pointe de la queue. </li><li> Recueillir environ 100 pi de sang dans des tubes de séparation de sérum. </li><li> Incuber les tubes de séparation de sérum à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 5 min et recueillir le sérum. Store sérum à -80 ° C pour analyse ultérieure. </li><li> Effectuer sRANKL ELISA et test de la souris TRACP5b de sérum sur des échantillons de sérum en utilisant un kit disponible dans le commerce. </li></ol></li></ol> 2. Ostéoclastes in vitro génération de BMMS souris <ol><li> Isolement et culture des BMMS <ol><li> L&#39;isolement du tibia et du fémur os: Euthanasier la souris donneuse avec du CO 2, et à désinfecter les jambes avec 70% d&#39;éthanol. Disséquer de l&#39;os pubien à l&#39;os du calcanéum, de supprimer fémur et du tibia os intact. </li><li> Retirez soigneusement la peau et les muscles sans endommager l&#39;os. Placez fémur et du tibia traitées os dans une boîte de Petri contenant un tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Prélèvement de moelle osseuse: Couper le bout sur un côté du fémur et du tibia os et débusquer la moelle osseuse dans un tube de 50 ml à l&#39;aide d&#39;une seringue de 1 ml avec une aiguille 25 G, chargé de α-MEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine (ostéoclastes milieu de culture / OCM). </li><li&gt; Procédé de moelle osseuse: mélanger et transférer la suspension de moelle osseuse pour un nouveau tube de 50 ml en la faisant passer à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm. Centrifuger les cellules à 300 xg et remettre en suspension dans α-MEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine et 10% de FBS (milieu ostéoclastes Culture / OCM (+)). </li></ol></li><li> Culture de macrophages <ol><li> Compter les cellules en utilisant un hématimètre ou compteur de cellules automatique. </li><li> Plate 1 x 10 6 cellules par puits pour une plaque à 6 puits ou 3 x 10 5 cellules de lamelles de verre (5 mm) ou des tranches de dentine placés en plaque de 96 puits et incuber à 37 ° C. </li><li> Aspirer tous les médias contenant des cellules non-adhérentes et incuber les cellules à 37 ° C avec frais OCM (+) contenant 25 ng / ml souris M-CSF pendant 48 heures. </li><li> Aspirer tous les médias et incuber les cellules à 37 ° C avec frais OCM (+) des milieux contenant 25 ng / ml souris M-CSF, et 30 ng / ml sRANKL de la souris pour lancer ostéoclastogénèse. Reconstituer des médias tous les 3 jours selon les besoins. </li><li> Cultiver des cellulespour environ 6-8 jours pour former des cellules multi-nucléaires géants capables de résorption osseuse. Dès que les cellules multinucléées apparaissent, effectuer TRAP (tartrate de la phosphatase acide résistant) coloration en utilisant un kit disponible dans le commerce, et à pleine maturité, effectuer des tests fonctionnels. Visualiser les anneaux F-actine sur des lamelles à l&#39;aide de la phalloïdine tache et de l&#39;image des cellules attachées à la dentine tranches par microscopie électronique à balayage (MEB), comme décrit précédemment 19. </li></ol></li></ol> 3. Ostéoclastes in vitro génération à partir de PBMC humaines <ol><li> Isolement de cellules PBMC humaines <ol><li> Ajouter 10 ml d&#39;Histopaque-1077 pré-chauffé dans un tube de 50 ml. </li><li> Filtre de leucocytes vide obtenu à partir de la banque de sang avec du PBS stérile dans un tube de 50 ml (rapport 1:1 de sang avec de la PBS). Couche du sang dilué sur la solution de histopaque très lentement, faire en sorte que le sang ne se mélange pas avec le histopaque. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 20 min à 18 ° C. Suivrement centrifugation, isoler soigneusement la couche leuco-plaquettaire blanc contenant les globules blancs et transférer dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Diluer les cellules avec du PBS et on centrifuge à nouveau à 650 x g pendant 5 minutes pour recueillir les cellules. </li><li> Retirer le surnageant et remettre les cellules en OCM (-) les médias et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules. </li></ol></li><li> Placage et la culture des PBMC <ol><li> Remettre en suspension les cellules dans l&#39;OCM (+) des médias et plateau de 8 x 10 6 cellules / ml par puits dans une plaque à 6 puits ou 1 x 10 6 cellules / ml par puits dans une plaque de 96 puits. Cellules de la plaque sur des lamelles de verre (5 mm) tel que requis pour l&#39;imagerie par immunofluorescence, ainsi que sur des tranches osseuses appropriées pour des dosages de la résorption osseuse tels que décrits précédemment 20. </li><li> Changer de milieux de culture, la reconstitution des cellules avec M-CSF humain tous les 2-3 jours ou au besoin. Ensuite, passez à l&#39;étape de différenciation au jour 5 par addition de 30 ng / ml de sRANKL humain avec 25 ml de M-CSF humain / ng dans OCM (+) médias pour lancer osteoclastogenesest. </li><li> Cultiver des cellules d&#39;environ 14 à 21 jours pour former des cellules multi-nucléaires géants. Dès que les cellules multinucléées apparaissent, ces cellules peuvent ensuite être étiquetés pour TRAP, et à pleine maturité, les essais fonctionnels peuvent être effectuées. Anneaux F-actine peuvent être visualisées sur des lamelles à l&#39;aide phalloidin tache. La morphologie des cellules peut être examinée dans des cellules attachées à la dentine tranches par SEM. </li></ol></li></ol>

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	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Troubles musculo-squelettiques sont les principales causes de morbidité et d&#39;invalidité et sont constitués de plus de 150 maladies et syndromes; affectant environ 90 millions d&#39;Américains aujourd&#39;hui. L&#39;inflammation des articulations et la destruction osseuse sont des caractéristiques prédominantes de troubles musculo-squelettiques, dont l&#39;arthrite et l&#39;ostéoporose. L&#39;ostéoporose est une maladie qui fragilise l&#39;intégrité de l&#39;os, ce qui conduit souvent à des fractures de l&#39;os. L&#39;arthrite est une maladie chronique et débilitante caractérisée par une inflammation des articulations qui deviennent gonflées, tendres et le mouvement normal raide restriction et peuvent conduire à l&#39;invalidité. Bien que la pathogenèse des maladies musculo-squelettiques est très différente de l&#39;autre, la destruction de l&#39;os est le trait commun fondamental. La destruction osseuse dans des conditions musculo-squelettiques est principalement causée par un déséquilibre entre la résorption osseuse et la formation osseuse 21,22. Une approche thérapeutique est de tenter de bloquer la capacité de ces cellules à détruire l&#39;os <sjusqu&#39;à&gt; 23. Les techniques et les procédures décrites ici permettent l&#39;étude des ostéoclastes à la fois in vivo et in vitro. Le modèle in vivo décrit ici utilise minicercles, qui sont de petits vecteurs épisomiques d&#39;ADN (~ de 4Ko) libérés de squelette bactérienne, qui servent également de supports de transgènes 24. Minicercles expriment transgènes 10-1000 fois plus élevés que les plasmides bactériens normales avec une expression stable pendant plusieurs mois. La petite taille moléculaire de minicercles contribue à taux de transfection plus efficace et d&#39;expression substantielle comparer à des plasmides bactériens normales 24. Par conséquent, minicercles sont maintenant largement utilisés dans les études pré-cliniques de transfert de gène 25,26. Livraison hydrodynamique est un procédé bien établi en fonction de la pression hydrodynamique dans les capillaires pour transporter l&#39;ADN plasmidique dans l&#39;ensemble du corps d&#39;une souris. La délivrance de gènes hydrodynamique à hépatocytes via injection dans la veine de la queue chez la souris est bien établie to exprimer un transgène par le plasmide ADN 6. Dans ces études, la surexpression de la souris sRANKL dans le modèle de souris in vivo est réalisée par sRANKL MC et livraison hydrodynamique par des injections de veine de la queue. Souris sRANKL ELISA peut être utilisée pour détecter des niveaux sériques de RANKL dans des souris. Élévation significative de TRACP5b de sérum de souris, un marqueur de la résorption osseuse 27, on observe chez la souris de transfert de gènes sRANKL. En particulier, cette technique n&#39;est pas limitée à la surexpression de sRANKL; il peut également être en outre appliqué pour surexprimer d&#39;autres protéines sécrétées 28. La difficulté technique principal de cette procédure est la livraison hydrodynamique par la veine de la queue. En plus de l&#39;injection régulière veine de la queue, la livraison hydrodynamique nécessite la livraison de minicercles dans de grands volumes de solution physiologique dans les souris dans 5-7 sec. Ainsi, les techniques de traitement et d&#39;injection stables sont essentiels pour le succès de cette procédure. Génération de souris transgéniques sRANKL est une autre approche pour osteoc in vivolastogenesis. Toutefois, un niveau élevé de sRANKL peut conduire à une létalité embryonnaire 4 et générer des souris transgéniques est également coûteuse et prend du temps. Dans le modèle de rongeur OVX, les deux cytokines inflammatoires telles que le TNF, IL-1 et IL-6 et les sRANKL de cytokines inflammatoires non-contribuent à l&#39;ostéoclastogenèse et in vivo de la perte osseuse. sRANKL modèle de transfert de gène conduit à la surexpression de la cytokine seulement sRANKL non inflammatoire. Par conséquent, le modèle de transfert de gène sRANKL décrit ici offre aux chercheurs un outil puissant pour examiner la contribution de l&#39;axe RANKL-RANK dans le remodelage osseux en l&#39;absence d&#39;inflammation. Une méthode de culture in vitro des ostéoclastes, ce qui implique la co-culture de cellules de la moelle osseuse et les ostéoblastes, a été créé à la fin des années 1980 avant la découverte de RANKL à la fin de 1990, 29,30. M-CSF recombinant RANKL et induisent la différenciation des ostéoclastes in vitro de manière efficace unnd le procédé a été décrit précédemment dans d&#39;autres études 3,31. M-CSF est connu pour stimuler l&#39;expression de RANK dans des précurseurs d&#39;ostéoclastes et début des années 32 pour agir comme un facteur de survie pour les précurseurs d&#39;ostéoclastes et des ostéoclastes matures 33. RANKL est essentielle pour la différenciation des ostéoclastes et activation 3. Ici, le procédé de l&#39;ostéoclastogenèse in vitro est décrit. Culture réussie et la différenciation des cellules précurseurs d&#39;ostéoclastes nécessitent l&#39;isolement de cellules stérile et les techniques de placage appropriées ainsi que la compréhension minutieuse de la récolte des cellules chronométré. Placage calculée des cellules est essentiel car la différenciation des ostéoclastes nécessite la fusion de cellules précurseurs des ostéoclastes 34 et un nombre insuffisant de cellules précurseurs d&#39;ostéoclastes va pas faciliter la fusion et la différenciation des cellules précurseurs en ostéoclastes. De même, un nombre excessif de cellules précurseurs d&#39;ostéoclastes, conduit à s&#39;agglutiner formation et la mort cellulaire éventuelle. L&#39;élimination du noncellules adhérentes 2 heures après l&#39;étalement des cellules peut aider à maintenir un nombre de cellules optimale. Enfin, le moment de la récolte des cellules est essentiel que les ostéoclastes sont terminale des cellules différenciées de courte durée avec une durée de vie d&#39;environ 48 heures 35. Ainsi, les cellules doivent être récoltées dans les 48 heures après la première observation de cellules multinucléées. Ces cellules peuvent ensuite être caractérisés par TRAP et la F-actine coloration par immunohistochimie et l&#39;activité de résorption osseuse peut être détecté par microscopie électronique à balayage (MEB). Ces approches expérimentales permettent définition claire des ostéoclastes en fonction de leur phénotype et la fonction. Le in vivo et in vitro techniques décrites ici facilitera le développement d&#39;inhibiteurs d&#39;ostéoclastes actuellement en études pré-cliniques, conduisant à des stratégies thérapeutiques efficaces pour les millions d&#39;ostéoporose et de patients atteints de polyarthrite à travers le monde.

Maladies musculo-squelettiques affectent des millions de personnes aux Etats-Unis et actuelles de graves conséquences pour les systèmes nationaux et locaux de la santé 1. Ces troubles sont caractérisés par la perte de l&#39;os et la fonction articulaire qui nécessitent un traitement lourd et de longues périodes de récupération. Généralement, une augmentation relative du nombre et / ou l&#39;activité des ostéoclastes, cellules spécialisées à résorber l&#39;os, l&#39;ostéoporose et l&#39;arthrite est observée 2. Dans des conditions physiologiques, le nombre et l&#39;activité des ostéoclastes est régulée par l&#39;activateur du récepteur du facteur nucléaire-κ B ligand (RANKL), qui est produit par les ostéoblastes. Ostéoprotégérine (OPG), un récepteur leurre pour RANKL est également produite par les ostéoblastes 3 ​​Dans les modèles animaux in vivo qui impliquent la surexpression systémique de sRANKL, ou la suppression d&#39;OPG sont très précieux dans la recherche de l&#39;ostéoporose.; Cependant, ces méthodes nécessitent la génération de souris transgéniques à 4,5. Ici, une nouvelle alternativeméthode de surexpression sRANKL pour l&#39;étude des troubles musculo-squelettiques liés est décrite. Plus précisément, minicercles (MC) technologie de l&#39;ADN et les méthodes de livraison hydrodynamiques ont été utilisés pour réaliser le transfert de gènes in vivo de sRANKL et surexpriment la souris sRANKL systémique 6. Cette méthode est également complémentaire à d&#39;autres modèles in vivo de l&#39;ostéoporose, tels que la modulation hormonale des ostéoclastes suivants ovariectomie 7 et l&#39;intervention diététique par le régime alimentaire pauvre en calcium 8. Ces modèles sont très utiles pour étudier les différents aspects des troubles musculo-squelettiques liés-mais ils ont besoin d&#39;interventions chirurgicales et peuvent prendre jusqu&#39;à plusieurs mois, à un coût important 9. Ovariectomisées (OVX) modèle de rongeur est un modèle animal expérimental où l&#39;enlèvement des ovaires conduit à une déficience en oestrogènes mimant ainsi l&#39;ostéoporose post-ménopausique humaine 10. Human ostéoporose post-ménopausique, une condition où l&#39;oestrogène Deficirence conduit à un risque accru de fractures osseuses et l&#39;ostéoporose affecte environ huit millions de femmes aux États-Unis seulement. Bien que le modèle OVX est utile pour l&#39;ostéoporose post-ménopausique il offre des avantages limités à l&#39;étude de l&#39;ostéoporose en général. L&#39;œstrogène inhibe la perte osseuse, en induisant des ostéoclastes et en inhibant l&#39;apoptose des ostéoblastes, donc en l&#39;absence d&#39;une augmentation de l&#39;activité des ostéoclastes est observée 10 à 12. Un rapport RANKL-OPG déséquilibre qui favorise la résorption osseuse est également observée 13. Cependant, la carence en oestrogène in vivo est également accompagnée par des niveaux de transformation β du facteur de croissance (TGF β d&#39;), l&#39;augmentation de l&#39;interleukine-7 (IL-7) et le TNF, IL-1 et IL-6 14,15 diminué. Comme ces cytokines ont connu des fonctions modulatrices du remodelage osseux indépendante de la voie de RANKL, il n&#39;est pas possible d&#39;attribuer toute activation des ostéoclastes uniquement à l&#39;axe RANKL-RANK. Le modèle décrit dans ce document permet aux chercheurs d&#39;étudier en vivo axe RANKL-RANK dans ostéoclastogénèse et la perte osseuse sans cytokines pro-inflammatoires par rapport aux modèles de rongeurs OVX. En outre, les techniques in vitro ostéoclastogenèse sont des outils essentiels pour étudier l&#39;activation des ostéoclastes pour des traitements thérapeutiques potentielles des maladies musculo-squelettiques. Des études antérieures ont également montré que la culture de macrophages de souris dérivées de la moelle osseuse (BMMS) avec des macrophages de souris colony-stimulating factor (M-CSF) et de la souris sRANKL peut conduire à la différenciation des ostéoclastes 3,16,17. Ici, les protocoles pour générer des cellules ostéoclastes multinucléés analogue à partir de moelle osseuse de souris, ainsi que de cellules mononucléaires périphériques humaines du sang périphérique (PBMC) in vitro 18 sont décrits. Les tests cellulaires nécessaires pour définir un ostéoclastes différenciation terminale et entièrement fonctionnel maturité sont aussi brièvement décrits. Ces techniques in vitro complètent la nouvelle approche in vivo et, ensemble, servent de poutils d&#39;investigation owerful pour étudier la différenciation des ostéoclastes et activation. L&#39;utilisation de ces systèmes, les scientifiques sont capables de générer des ostéoclastes in vivo et in vitro et de définir les stimuli et les signaux nécessaires à leur prolifération et l&#39;activation ainsi que de tester l&#39;efficacité des inhibiteurs pharmacologiques et biologiques.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&amp;nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Ici, une technique de transfert de gène selon l&#39;invention pour la différenciation des ostéoclastes in vivo et des protocoles de culture de cellules pour la différenciation des cellules précurseurs des ostéoclastes in vitro en tant que méthode pour étudier les effets des cytokines sur l&#39;ostéoclastogenèse sont décrits. Sur la figure 1, les résultats représentatifs de transfert de gène réussie de GFP et de la souris sRANKL MC chez la souris sont présentées. Dans la figure 2, les images représentatives de la souris os PBMC différenciation cellulaire cultures de cours de temps l&#39;homme de cellules précurseurs à ostéoclastes par microscopie en champ clair osseuse ou sont présentés. Figure 3, les images représentatives de trois méthodes indépendantes pour caractériser la souris moelle osseuse des ostéoclastes dérivés sont présentés . La présence de souris sRANKL active l&#39;expression de la TRAP (Figures 3A et B) et la formation d&#39;anneaux de F-actine (figures 3C et D). elec de numérisationtron microscopie à balayage (MEB) montre que les souris sRANKL induit la formation de cellules géantes capables de résorption osseuse (figures 3E et F). figure 4, les mêmes méthodes de caractérisation sur des PBMC humaines dérivées ostéoclastes sont présentés. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. SRANKL in vivo par transfert génique conduit à une augmentation ostéoclastogénèse. Vue antérieure de A, B) des explants de foie de souris et C, D) des images du corps entier de vieux de 12 semaines souris C57BL / 6 mâles injectés avec 5 ug de la GFP ou sRANKL MC ADN. La flèche indique l&#39;expression de GFP in vivo dans le gène de la GFP transfert souris. souris de transfert de gènes de RANKL servent pas de fluorescence de fond. Les images capturées par Maestro 2 Imager, un jour après le transfert génique (d rouge et vertenote fond et la GFP, respectivement). carte E) Le plasmide de sRANKL MC-construction d&#39;ADN et F) Niveau de sRANKL dans le sérum analysé à 1, 5 et 11 jours après la GFP ou le transfert de gène sRANKL. G) Souris niveau de TRACP5b sérique analysées 11 jours après transfert de gène GFP ou sRANKL. Barres d&#39;échelle indiquent 5 mm par A, B, et de 10 mm de C, D. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig2highres.jpg" width="500" /> Dans l&#39;ostéoclastogenèse Figure 2. Vitro à la fois de souris et des systèmes de culture de cellules humaines. Microscopie à champ clair de cellules de souris isolées à partir de moelle osseuse et cultivés en présence de 25 ng / ml de la souris M-CSF et 30 ng / ml sRANKL de souris montrant une différenciation cours du temps au jour A), 2 B) 5, et C) 8. Microscopie à champ lumineux des cellules humaines isoléesà partir de sang périphérique et on les cultive en présence de 25 ng / ml de M-CSF humain et humain sRANKL 30 ng / ml représentant une évolution dans le temps de différenciation à jour D), E 4) 14, et F) 21. Barres d&#39;échelle indiquent 20 um. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Génération et caractérisation des ostéoclastes de souris. TRAP coloration (rose) de cellules de souris isolées à partir de moelle osseuse et cultivées pendant 6 jours en présence de A) 25 ng / ml de la souris M-CSF ou B) de 25 ng / ml souris M -CSF et 30 ng / ml sRANKL de la souris. Phalloïdine (vert) et DAPI (bleu) la coloration de cellules de souris isolées à partir de moelle osseuse et cultivés pendant 8 jours en présence de C) de 25 ng / ml de la souris M-CSF ou D) 25 ng / ml de la souris M-CSF et 30 ng / ml souris sRANKL montrant la formation de FaRCIQT anneau dans les cellules multinucléées. Microphotographies au MEB de cellules de souris isolées à partir de moelle 25 ng / ml de la souris M-CSF ou F 25 ng / ml de la souris M-CSF et 30 ng / ml souris sRANKL montrant la formation de moelle osseuse et cultivés pendant 8 jours en présence de E)) les zones de résorption de l&#39;os comme indiqué par les flèches. Barres d&#39;échelle indiquent 40 um dans la MA, et 30 um E, F. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Génération et caractérisation des ostéoclastes humains. TRAP coloration (rose) de cellules humaines isolées à partir des PBMC en culture et pendant 15 jours en présence de A) 25 ng / ml de M-CSF humain ou B) de 25 ng / ml de M-humain CSF et 30 ml sRANKL ng / humain. Phalloïdine (vert) et DAPI (bleu) de coloration de cellules humaines isolées à partir des PBMC et on les cultive pendant 19 jours en présence de C) </strong&gt; 25 ng / ml de M-CSF humain ou D) 25 ng / ml de M-CSF humain et 30 ng / ml sRANKL humain montrant la formation d&#39;anneaux de F-actine dans des cellules multinucléées. Microphotographies au MEB de cellules humaines isolées à partir des PBMC et on les cultive pendant 18 jours en présence de E) 25 ng / ml de M-CSF humain ou F) 25 ng / ml de M-CSF humain et 30 ng / ml sRANKL humain montrant la formation de la résorption des zones sur l&#39;os, comme indiqué par les flèches. Barres d&#39;échelle indiquent 10 um dans A, B, C dans 20 um, 15 um D en E, F.

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A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

A Novel<em&gt; In vivo</em&gt; Technique Gene Transfer et<em&gt; In vitro</em&gt; Essais cellule sur la base de l&#39;étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K vues.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

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Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Traitement de la toxicomanie et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie des ostéoblastes-ostéoclastes Interactions dans un modèle Medaka poisson Ostéoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Recherche

Biologie du développement

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modèles de métastases osseuses

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Médecine

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Combiné<em&gt; In vivo</em&gt; Optique et μCT imagerie pour surveiller l&#39;infection, l&#39;inflammation, et Bone Anatomy dans une infection orthopédique Implant souris

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Bio-ingénierie

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Immunologie et infection

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse multimodale de la formation osseuse à l’aide de modèles d’explants

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous modalities that are currently available for analysis. Here, we propose a workflow for a comprehensive evaluation of new bone formation using a relevant large animal osseous ex vivo explant. A bone defect (diameter = 3.75 mm; depth = 5.0 mm) is created in an explanted sheep femoral head and injected with a macroporous bone substitute loaded with a pro-osteogenic growth factor (bone morphogenetic protein 2 - BMP2). Subsequently, the explant is maintained in culture for a 28-day period, allowing cellular colonization and subsequent bone formation. To evaluate the quality and structure of newly mineralized tissue, the following successive methods are set up: (i) Characterization and high-resolution 3D images of the entire explant using micro-CT, followed by deep learning image analyses to enhance the discrimination of mineralized tissues; (ii) Nano-indentation to determine the mechanical properties of the newly formed tissue; (iii) Histological examinations, such as Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner's trichrome, and Movat's pentachrome to provide a qualitative assessment of mineralized tissue, particularly with regard to the visualization of the osteoid barrier and the presence of bone cells; (iv) Back-scattering scanning electron microscopy (SEM) mapping with internal reference to quantify the degree of mineralization and provide detailed insights into surface morphology, mineral composition, and bone-biomaterial interface; (v) Raman spectroscopy to characterize the molecular composition of the mineralized matrix and to provide insights into the persistence of BMP2 within the cement through the detection of peptide bonds. This multimodal analysis will provide an effective assessment of newly formed bone and comprehensive qualitative and quantitative insights into mineralized tissues. Through the standardization of these protocols, we aim to facilitate interstudy comparisons and improve the validity and reliability of research findings.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Techniques avancées de caractérisation de la minéralisation tissulaire dans la recherche sur la régénération osseuse

The proposed protocol entails a global approach to assess bone formation in the context of bone regeneration using multimodal analyses. It aims to provide qualitative and quantitative information on new bone formation, enhancing the rigor and validity of basic and pre-clinical investigations.

A Novel

Résumé

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Traitement de la toxicomanie et

Modèles de métastases osseuses

Séquentiel

Combiné

des applications de

Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour

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Caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo

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